本發(fā)明涉及一種cas蛋白結合dna的方法，所述方法的應用以及一種試劑盒，尤其涉及一種能夠方便、快速、高效地針對一個或者多個靶點進行基因轉錄調控的方法、以及用于所述方法的試劑盒。
背景技術：
：隨著分子生物學的進步，科學家們的其中一項工作是致力于發(fā)展新的修飾和操作基因組的技術，其中，基于crispr/cas9蛋白的基因組編輯技術顯示了強大的應用前景。一般來說，在dna水平上精確的基因組編輯或調控需要兩個主要組成部分：一個dna結合的結構域來介導特異性序列的識別和結合，一個效應結構域來實現(xiàn)dna的切割或調節(jié)轉錄。cas9蛋白是rna引導的內切酶，這段rna通過與靶標dna堿基配對的方式結合，加之cas9與dna上pam(protospacer-adjacentmotif)序列相互作用，只要簡單的改變引導rna就可以改變特定的靶標位置。cas9蛋白這個天然內切酶的活性能廣泛的用于各個物種的基因組編輯，包括細菌、真菌、植物和動物。為了實現(xiàn)特定基因的調控，失活的cas9(dcas9)融合不同的效應蛋白，如轉錄激活子、抑制子和表觀修飾子，從而實現(xiàn)不同的調控目的。在細菌細胞中，僅dcas9就可以通過阻礙轉錄機器有效的抑制轉錄，該技術被稱為crispr干擾(crispri)。雖然crispri在原核細胞中非常高效，但是在哺乳動物細胞中，dcas9并不能有效的實現(xiàn)基因沉默。但在哺乳動物細胞中，如果將dcas9與一個抑制結構域(比如kox1的krab結構域)進行融合，便可以成功地抑制報告基因或者內源基因的表達。除了crispri，crispr激活(crispra)也已成功實現(xiàn)，即在哺乳動物細胞中將dcas9融合轉錄激活結構域，例如vp64和p65ad，或者是在細菌中將dcas9融合ω亞單位。除了應用于基因調控，dcas9還可以應用于基因組的表觀遺傳學編輯，或與熒光蛋白融合，使得可以在活細胞中直接成像來確定基因組的特定位置。另外，dcas9也被用來研究蛋白與特定位點的相互作用，并且有潛力切割rna。最近，doudna等人利用dcas9和一小段額外添加的dna，實現(xiàn)對特定mrna的追蹤，這種cas9被稱為rcas9(rna-targetingcas9)。利用crispr/dcas9技術再進行基因轉錄調控或者基因組表觀遺傳學編輯的過程中，如果需要編輯多個基因(或位點)的話，則需要構建多個sgrna表達單元，整個構建過程比較繁瑣。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術方案無法快速、方便地使得蛋白結合到基因組上多個靶位點的問題，本發(fā)明提供了一種新的cas蛋白結合dna的方法和試劑盒。本發(fā)明第一個方面提供了一種cas蛋白結合dna的方法，優(yōu)選為一種基因轉錄調控的方法；更優(yōu)選為針對靶標基因進行基因轉錄水平的調控的方法，更優(yōu)選為抑制靶標基因轉錄的方法；尤其提供一種能夠方便、快速、高效地針對一個或者多個靶點進行基因轉錄調控的方法。本發(fā)明所述的cas蛋白結合dna的方法，步驟包括：確定基因組上的目標靶點或者靶標基因，在所述目標靶點或者靶標基因左右兩側找到結合cas蛋白所需的pam位點，針對所述pam位點設計向導序列；確定所述cas蛋白識別和結合所需的同向重復序列；將同向重復序列與所述向導序列連接形成crrna序列，并構建轉錄所述crrna序列的crrna質粒；將所述cas蛋白的編碼基因與轉錄所述crrna序列的crrna質粒在細胞內共表達，即可使cas蛋白特異地結合到靶標位點。其中，所述靶標基因的數量可以是一個或多個，并優(yōu)選為多個。其中，所述的目標靶點數量可以是一個或多個，并優(yōu)選為多個。其中，所述pam位點的數量可以是一個或多個。其中，所述cas蛋白為保留rna酶活力、缺失dna酶活力的cas蛋白突變體。在一種優(yōu)選實施例中，所述cas蛋白可以是選自：1)保留rna酶活力、缺失dna酶活力的cpf1突變體；和/或2)缺失dna酶活力的其他類型cas蛋白突變體；和/或3)所述cpf1突變體或cas蛋白突變體連接一個或多個不同功能域的融合蛋白。其中，所述其他類型cas蛋白為具有rna酶活性的cas蛋白，尤其是同時具有dna酶活性和rna活性的cas蛋白，如c2c1蛋白。其中，所述缺失dna酶活力的其他類型cas蛋白突變體為缺失dna酶活性、但具有rna酶活性的蛋白突變體，如c2c1蛋白突變體。在一種更優(yōu)選實施例中，根據所述pam位點設計一個向導序列，將向導序列與同向重復序列連接獲得一個crrna序列；或者根據多個pam位點設計分別向導序列(即獲得多個向導序列)，將多個向導序列分別與同向重復序列連接獲得多個crrna序列，將多個crrna序列串聯(lián)之后獲得一個crrna陣列；構建所述crrna序列或者crrna陣列的轉錄質粒crrna質粒用于轉錄所述一個crrna序列、或多個crrna序列串聯(lián)的序列；然后將crrna序列或者crrna陣列與cas編碼基因在細胞內共表達，即可使cas蛋白特異結合到基因組上向導序列所靶向的目標靶點或靶標基因。在更優(yōu)選實施例中，所述一個或多個向導序列為針對啟動子區(qū)域t鏈或/和nt鏈上pam位點進行設計的向導序列、或者編碼序列nt鏈或/和t鏈上pam位點進行設計的向導序列，更優(yōu)選為針對一個或多個編碼序列t鏈上pam位點設計的向導序列，和/或針對一個或多個編碼序列nt鏈上pam位點設計的向導序列，尤其優(yōu)選為針對一個或多個編碼序列t鏈上pam位點設計的向導序列。本發(fā)明第二個方面是提供一種用于cas蛋白特異性結合靶標dna的試劑盒，優(yōu)選為基因轉錄調控的試劑盒，更優(yōu)選為針對靶標基因進行基因轉錄水平的調控的試劑盒，更優(yōu)選為抑制靶標基因轉錄的試劑盒。尤其提供一種能夠方便、快速、高效地針對一個或者多個靶點進行基因轉錄調控的試劑盒。其中，所述靶標基因的數量可以是一個或多個，并優(yōu)選為多個。本發(fā)明所述的試劑盒包括cas蛋白編碼基因、所述cas蛋白識別和結合所需的同向重復序列、針對目標靶點設計的向導序列、以及crrna質粒，所述crrna質粒用于轉錄所述同向重復序列-向導序列連接形成的crrna。其中，所述試劑盒中，所述同向重復序列可以是與所述引導序列連接形成crrna?；蛘?，也可以是在使用時將所述同向重復序列與所述引導序列連接形成crrna。在所述試劑盒的一種更優(yōu)選實施例中，所述引導序列為根據一個pam位點設計的一個序列或根據多個pam位點設計的多個向導序列；在所述試劑盒的更優(yōu)選實施例中，還包括連接引物，用于連接所述同向重復序列與所述一個或多個向導序列。在所述試劑盒的一種優(yōu)選實施例中，同向重復序列-向導序列連接形成的crrna可以是：a)根據所述pam位點設計一個向導序列，將向導序列與同向重復序列連接獲得一個crrna序列；或者b)根據多個pam位點分別設計向導序列，將多個向導序列分別與同向重復序列連接獲得多個crrna序列，再將多個crrna序列串聯(lián)之后獲得的一個crrna陣列。在所述試劑盒的一種優(yōu)選實施例中，所述crrna質粒用于轉錄a)所述一個所述crrna序列；或用于轉錄b)所述一個crrna陣列。其中，所述cas蛋白為保留rna酶活力、缺失dna酶活力的cas蛋白突變體。在一種優(yōu)選實施例中，所述cas蛋白可以是選自：1)保留rna酶活力、缺失dna酶活力的cpf1突變體；和/或2)缺失dna酶活力的其他類型cas蛋白突變體；和/或3)所述cpf1突變體或cas蛋白突變體連接一個或多個不同功能域的融合蛋白。其中，所述其他類型cas蛋白為具有rna酶活性的cas蛋白，尤其是同時具有dna酶活性和rna活性的cas蛋白，如c2c1蛋白。其中，所述缺失dna酶活力的其他類型cas蛋白突變體為缺失dna酶活性、但具有rna酶活性的蛋白突變體，如c2c1蛋白突變體。在所述試劑盒的一種優(yōu)選實施例中，所述一個或多個向導序列為針對啟動子區(qū)域pam位點設計的向導序列、或一個或多個針對編碼序列nt鏈或/和t鏈上pam位點進行設計的向導序列，更優(yōu)選為針對一個或多個編碼序列t鏈上pam位點設計的向導序列，和/或針對一個或多個編碼序列nt鏈上pam位點設計的向導序列，尤其優(yōu)選為針對一個或多個編碼序列t鏈上pam位點設計的向導序列。在所述試劑盒的一種優(yōu)選實施例中，還包括cas蛋白編碼基因序列的擴增引物。在所述試劑盒的一種優(yōu)選實施例中，還包括含有復制子、抗生素抗性基因的質粒。其中，所述復制子優(yōu)選為p15a復制子。其中，所述抗生素抗性基因優(yōu)選為卡那霉素(kanamycin)抗性基因。在所述試劑盒的更優(yōu)選實施例中，還包括所述用于轉錄所述引導序列的crrna質粒的擴增引物。采用本發(fā)明的方法，能夠調節(jié)一個或多個靶標基因的轉錄，過程非常簡單，且編輯效率與dcas9相當。附圖說明圖1為本發(fā)明采用ddcpf1調節(jié)靶標基因轉錄原理示意圖；圖2為本發(fā)明實施例1中大腸桿菌mg1655基因組lacz基因啟動子區(qū)域、編碼鏈(即非模板鏈)和非編碼鏈(即模板鏈)上不同向導序列的位點示意圖；圖3為本發(fā)明實施例1中針對大腸桿菌lacz基因，利用ddcpf1和不同位置向導序列的crrna進行轉錄調控的實驗結果；圖4為本發(fā)明實施例2中針對大腸桿菌malt、prop、degp和rsea基因，利用ddcpf1和crrna陣列進行轉錄調控的實驗結果。具體實施方式參照圖1，本發(fā)明采用ddcpf1等缺失dna酶活性的cas(crispr-associated,cas)蛋白突變體來替代dcas9，由于ddcpf1可以直接加工crrna的前體(或者crrna陣列)，形成一個(或多個)成熟的crrna，從而能夠引導ddcpf1結合到基因組上特定的位點，來行使基因轉錄調控或者基因組表觀遺傳學編輯的功能。下面參照附圖2-4，本發(fā)明結合具體實施例對本發(fā)明調控基因編輯的方法進行介紹。實施例1：針對大腸桿菌lacz基因，利用ddcpf1和不同位置的啟動子區(qū)域、模板鏈、非模板鏈crrna進行轉錄調控步驟1，構建crrna的表達質粒參照圖2，在大腸桿菌mg1655基因組lacz基因的編碼鏈和非編碼鏈上找到cpf1的pam(protospaceradjacentmotifs)位點ttn，并根據所述位點設計相應的同向重復序列(directrepeat，dr，ascpf1同向重復序列，seqidno.38)和向導序列(guide)t1、t2、t3、nt1、nt2。構建crrna的表達載體ptc17014r。以pgrna-bacteria(可參照repurposingcrisprasanrna-guidedplatformforsequence-specificcontrolofgeneexpression.qils等.cell.2013,152(5):1173-83.)為模板，用引物(bsmbi-grna-f/bsmbi-grna-r2，seqidno.3-4)進行pcr擴增，然后回收pcr產物，進行dpni處理以去除原始質粒模板，然后利用上海吐露港生物科技有限公司的無縫拼接試劑盒(貨號：24303-1)進行無縫拼接，然后轉化dh10b，獲得質粒ptc17014。為了消除ptc17014質粒上帶有的bsmbi位點，設計了一對引物(bsmbi-muf/bsmbi-mur，seqidno.5-6)，以ptc17014為模板進行擴增，使用同樣的方法進行無縫拼接，獲得ptc17014r質粒。ptc17014r質粒利用bsmbi進行酶切，回收后作為載體備用。針對p、t1、t2、t3、nt1、nt2序列，分別設計引物對(見表1)；將每對引物分別進行退火，然后分別與用bsmbi酶切后的ptc17014r質粒進行連接；獲得轉錄針對p、t1、t2、t3、nt1、nt2位點crrna的質粒；其中，轉錄crrna的啟動子為j23119-spei(seqidno.37；可參照repurposingcrisprasanrna-guidedplatformforsequence-specificcontrolofgeneexpression.qils等.cell.2013,152(5):1173-83.)。所有的質粒均經過測序確認。表1，針對不同pam位點設計的引物對步驟2，制備ddcpf1表達質粒合成ascpf1基因(seqidno.1)并克隆到含有p15a復制子和卡納霉素抗性基因的質粒上，獲得pxx55-ascpf1。ascpf1的啟動子為強啟動子j23100(seqidno.2)。設計引物(ascpf1-e993a-f/ascpf1-e993a-r，seqidno.7-8)進行pcr擴增。得到的pcr產物用dpni去除模板，直接轉化到dh10b中，并測序驗證。正確的克隆將ascpf1蛋白(seqidno.9)的第993位谷氨酸(gag編碼)替換成了丙氨酸(gcc編碼)，從而使cpf1缺失dna酶的活力，但是保留其rna酶的活力。獲得的質粒命名為pxx55-ddcpf1，可以在大腸桿菌中表達ddcpf1蛋白(seqidno.10)。步驟3，在大腸桿菌中共表達ddcpf1和crrna將pxx55-ddcpf1與表達針對p位點、以及t1、t2、t3、nt1、nt2位點crrna的質粒，以及crrna對照質粒ptc17014r，分別共轉化到大腸桿菌mg1655中，并在添加了卡納霉素和氨芐青霉素的lb平板上進行篩選。培養(yǎng)條件是37℃培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)，直至平板上長出單克隆。挑選單克隆接種至添加了卡納霉素和氨芐青霉素的lb液體中，置于37℃搖床中過夜培養(yǎng)；以1％的接種量，將過夜培養(yǎng)的菌液接種至添加了卡納霉素和氨芐青霉素的新鮮lb液體中，37℃振蕩培養(yǎng)至od600為1.0；添加終濃度為0.5mmiptg來誘導lacz基因的表達；誘導1h之后，收集3ml菌體，用zymoresearch的rna提取試劑盒(貨號：r2014)來抽提總rna。取1μg的總rna，用takara的反轉錄試劑盒(貨號：rr047a)進行反轉錄，用takara的熒光定量檢測試劑盒(貨號：rr820a)進行定量檢測相應基因的表達水平。熒光定量pcr儀為steponeplusreal-timepcrsystem(thermofisherscientific)。以大腸桿菌mg1655的gapa基因為內參基因。實驗操作均按照試劑盒或儀器的說明進行。參照圖3，驗結果表明，轉入表達ddcpf1和表達針對p、t1、t2和t3位點crrna質粒的菌株，lacz的轉錄水平有大幅度的降低；相比于對照組(轉入了ddcpf1的表達質粒和crrna對照質粒ptc17014r)，轉錄水平降低了300倍左右，抑制效果非常顯著。相比而言，轉入了表達ddcpf1和表達針對nt1、nt2位點crrna質粒的菌株，lacz的轉錄水平有一定幅度的降低，但是降低的幅度相對較小。因此，使用ddcpf1進行靶標基因抑制時，首先選擇針對啟動子區(qū)域和模板鏈(t鏈)上的位點設計crrna的表達質粒。實施例2：針對大腸桿菌多個基因，利用ddcpf1和crrna陣列進行轉錄調控除了步驟1之外，與實施例1相同。本實施例中，步驟1為在malt、prop、degp和rsea基因的模板鏈上分別選擇一條ddcpf1的向導序列，詳見表2。表2，針對不同基因設計的向導序列基因向導序列maltcacagtgaagtgattaactatgcseqidno.21propttgcttacgcattaggtaaagttseqidno.22degpgcgttatctccgctctctgcaacseqidno.23rseaatggatggcgaaacgctggatagseqidno.24針對四個向導序列分別設計pcr引物maltcrrna-tf/maltcrrna-tr(malt基因向導序列)、propcrrna-tf/propcrrna-tr(prop基因向導序列)、degpcrrna-tf/degpcrrna-tr(degp基因向導序列)和rseacrrna-tf/rseacrrna-tr(rsea基因向導序列)；分別進行退火，獲得的4個片段分別與ptc17014r質粒用bsmbi酶切處理后的載體進行連接，獲得表達針對malt、prop、degp和rsea基因的crrna表達質粒ptc160309、ptc17050、ptc17041、ptc17043。表3，針對不同基因向導序列設計的引物對設計引物(詳見表4)，構建crrna陣列1(malt-prop-degp-rsea)，方法如下：將crrna-array1f/crrna-array1r、crrna-array2f/crrna-array2r和crrna-array3f/crrna-array3r分別退火；獲得的3個片段與ptc17014r質粒用bsmbi酶切處理后的載體進行連接，獲得crrna陣列1的表達質粒ptc17055。在該陣列中，4個guide的串聯(lián)順序為malt-prop-degp-rsea。表4，構建crrna陣列1所設計的引物引物名稱引物序列crrna-array1fagatcacagtgaagtgattaactatgcaatttctactcttgtagatttgcttcrrna-array1rgcgtaagcaaatctacaagagtagaaattgcatagttaatcacttcactgtgcrrna-array2facgcattaggtaaagttaatttctactcttgtagatgcgttatctccgctccrrna-array2rcagagagcggagataacgcatctacaagagtagaaattaactttacctaatcrrna-array3ftctgcaacaatttctactcttgtagatatggatggcgaaacgctggatagcrrna-array3raaaactatccagcgtttcgccatccatatctacaagagtagaaattgttg設計引物(詳見表5)，構建crrna陣列2(prop-degp-rsea-malt)，方法如下：將crrna-array4f/crrna-array4r、crrna-array5f/crrna-array5r和crrna-array6f/crrna-array6r分別退火；獲得的3個片段與ptc17014r質粒用bsmbi酶切處理后的載體進行連接，獲得crrna陣列2的表達質粒ptc17056。在該陣列中，4個guide的串聯(lián)順序為prop-degp-rsea-malt。表5，構建crrna陣列2所設計的引物引物名稱引物序列crrna-array4fagatttgcttacgcattaggtaaagttaatttctactcttgtagatgcgttacrrna-array4rgagataacgcatctacaagagtagaaattaactttacctaatgcgtaagcaacrrna-array5ftctccgctctctgcaacaatttctactcttgtagatatggatggcgaaacgccrrna-array5rtccagcgtttcgccatccatatctacaagagtagaaattgttgcagagagcgcrrna-array6ftggatagaatttctactcttgtagatcacagtgaagtgattaactatgccrrna-array6raaaagcatagttaatcacttcactgtgatctacaagagtagaaattcta參照圖4，當把ddcpf1的表達質粒和靶向malt-prop-degp-rsea的crrna陣列1表達質粒一起轉入大腸桿菌時，相比于對照組(轉入了ddcpf1的表達質粒和crrna對照質粒ptc17014r)，4個基因的轉錄水平都被大幅度抑制；并且，其抑制水平與單轉靶向單個基因的crrna時的抑制水平相當。類似地，當把ddcpf1的表達質粒和靶向prop-degp-rsea-malt的crrna陣列2表達質粒一起轉入大腸桿菌時，相比于對照組(轉入了ddcpf1的表達質粒和crrna對照質粒ptc17014r)，4個基因的轉錄水平也被大幅度抑制；并且，其抑制水平與單轉靶向單個基因的crrna時的抑制水平相當。以上結果說明，本發(fā)明利用構建crrna陣列的方法可以來方便地調控多個靶標基因的轉錄水平；而且，針對各個靶標基因的guide序列的排列順序不會顯著影響對各個靶標基因的抑制效率。本發(fā)明上述實施例中，進行熒光定量pcr檢測基因轉錄水平的引物如下：表6，熒光定量pcr檢測基因轉錄水平的引物以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。sequencelisting<110>上海吐露港生物科技有限公司<120>一種cas蛋白特異結合靶標dna、調控靶標基因轉錄的方法及試劑盒<130>cn<160>60<170>patentinversion3.3<210>1<211>3924<212>dna<213>artificial<220><223>ascpf1基因<400>1atgacacagttcgagggctttaccaacctgtatcaggtgagcaagacactgaggtttgag60ctgatcccacagggcaagaccctgaagcacatccaggagcagggcttcatcgaggaggac120aaggccagaaatgatcactacaaggagctgaagcccatcatcgataggatctacaagacc180tatgccgaccagtgcctgcagctggtgcagctggattgggagaacctgagcgccgccatc240gactcctatcgcaaggagaagacagaggagacccggaacgccctgatcgaggagcaggcc300acatatagaaatgccatccacgactacttcatcggcaggacagacaacctgaccgatgcc360atcaataagcgccacgccgagatctacaagggcctgttcaaggccgagctgtttaatggc420aaggtgctgaagcagctgggcaccgtgaccacaaccgagcacgagaacgccctgctgcgc480agcttcgataagtttacaacctacttctccggcttttatgagaaccggaagaacgtgttc540agcgccgaggatatcagcacagccatcccacacagaatcgtgcaggacaacttccccaag600tttaaggagaattgtcacatcttcacaagactgatcaccgccgtgcccagcctgagggag660cactttgagaacgtgaagaaggccatcggcatcttcgtgagcacctccatcgaggaggtg720ttttccttccctttttataaccagctgctgacacagacccagatcgacctgtacaatcag780ctgctgggaggaatctctagggaggcaggaaccgagaagatcaagggcctgaacgaggtg840ctgaatctggccatccag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