專(zhuān)利名稱(chēng)：一種dna結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基于微陣列芯片的DNA結(jié)合蛋白檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種DNA結(jié) 合蛋白高靈敏高通量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
對(duì)于各種生命活動(dòng)來(lái)說(shuō)，蛋白與DNA的特異性結(jié)合是許多細(xì)胞表現(xiàn)各種生物 活性的一個(gè)關(guān)鍵步驟，包括基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯以及DNA復(fù)制、重組和修復(fù)等。 因此，DNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)和特異性結(jié)合位點(diǎn)的鑒定對(duì)于探索基因表達(dá)機(jī)制和分析 細(xì)胞功能是十分重要的。進(jìn)而，探明這些信息有助于査明生物有機(jī)體發(fā)育畸變的 原因。近來(lái)，DNA結(jié)合蛋白以及結(jié)合位點(diǎn)信息已經(jīng)成為許多疾病診斷和藥物發(fā)現(xiàn)的
潛在標(biāo)簽和靶標(biāo)。實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的早期診斷也是預(yù)防與治療眾多疾病如癌 癥、疼痛等的一個(gè)重要方法。因此，建立一種監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平或活性的 快速靈敏方法是十分關(guān)鍵的。目前常規(guī)檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的方法有蛋白電泳遷移 法、DNA印記法、ELISA法和Southwestern印跡法。然而，這些方法都比較費(fèi)時(shí) 耗力，并且這些方法不是需要放射性標(biāo)記，就是需要昂貴的抗體，目前現(xiàn)存的檢 測(cè)方法都存在不同的技術(shù)缺陷。近來(lái)，高通量芯片技術(shù)已經(jīng)被發(fā)展用來(lái)檢測(cè)DNA 結(jié)合蛋白。然而，已經(jīng)報(bào)道的芯片檢測(cè)方法仍存在較多缺點(diǎn)，如檢測(cè)蛋白直接標(biāo) 記法會(huì)降低蛋白與DNA間的結(jié)合活性；還有些方法需要抗體對(duì)蛋白進(jìn)行標(biāo)記，這 樣給微量蛋白的檢測(cè)造成極大的困難。此外，熒光探針技術(shù)也被用來(lái)檢測(cè)DNA結(jié) 合蛋白。但是以往報(bào)導(dǎo)方法中， 一方面要用不同的熒光探針檢測(cè)不同的蛋白，這 樣導(dǎo)致了檢測(cè)成本的增加；另一方面，檢測(cè)靈敏度不夠高還會(huì)造成微量樣本檢測(cè) 的困難。目前，生物醫(yī)學(xué)研究和臨床檢測(cè)上，急需要一種超高靈敏度、低成本且 高通量DNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測(cè)方法。 它是基于微陣列芯片的高靈敏、低成本檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的高通量方法。由本發(fā) 明制得的DNA結(jié)合蛋白檢測(cè)芯片，具有DNA結(jié)合蛋白檢測(cè)的超靈敏、高特異以及低成本和省時(shí)省力的特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于科研和臨床檢測(cè)診斷之中。
本發(fā)明是以如下技術(shù)解決方案實(shí)現(xiàn)的 一種DNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)方法，首先 設(shè)計(jì)寡核苷酸DNA芯片；將待篩選的粗細(xì)胞提取液同寡核苷酸DNA芯片直接溫育； 再將核酸外切酶III放入上述寡核苷酸DNA芯片體系中溫育；再將環(huán)形探針加入 寡核苷酸DNA芯片體系中，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，有結(jié)合蛋白的序列能進(jìn)行擴(kuò)增獲得熒 光信號(hào)，而沒(méi)有被蛋白的結(jié)合的序列，被核酸外切酶III所切割則不能進(jìn)行滾環(huán) 擴(kuò)增，不能獲得熒光信號(hào)；最后通過(guò)微陣列熒光信號(hào)的有無(wú)來(lái)判斷芯片體系中DNA 結(jié)合蛋白的有無(wú)，通過(guò)熒光強(qiáng)度則能夠定量檢測(cè)出DNA結(jié)合蛋白含量。
所述的寡核苷酸DNA芯片由芯片和被固定到芯片上的的寡核苷酸組成。 所述的寡核苷酸DNA的芯片是普通玻璃片或是微球；其表面修飾是聚丙烯酰 胺修飾、醛基修飾或鏈霉親和素修飾；而相對(duì)應(yīng)的被固定的寡核苷酸的5'端則是 丙烯酰胺修飾、氨基修飾或生物素修飾。
所述的被固定到芯片上的的寡核苷酸是雙鏈的寡核苷酸，或是單鏈的寡核苷 酸；通過(guò)延伸的方法得到雙鏈的寡核苷酸芯片，或是通過(guò)具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈寡 核苷酸通過(guò)自身返折成發(fā)夾，最后形成具有雙鏈DNA芯片。
所述的的微陣列信號(hào)通過(guò)和環(huán)形探針特定片段互補(bǔ)的熒光探針雜交得到；或 通過(guò)滾環(huán)過(guò)程中熒光標(biāo)記的dNTP參入到延伸核苷酸序列上得到；或者通過(guò)滾環(huán)擴(kuò) 增后得到的單鏈DNA延伸成雙鏈DNA后，再同SUBGREEN染料結(jié)合后得到。 所述的環(huán)形探針是人工合成的，或是人工合成后經(jīng)過(guò)連接而成的。 所述的環(huán)形探針的結(jié)構(gòu)，它的一個(gè)片段同固定于芯片的寡核苷酸特定片^L相. 互補(bǔ)，包括蛋白結(jié)合的DNA序列；其另一部分片段則同熒光檢測(cè)探針的序列相同。 所述的環(huán)形探針其結(jié)構(gòu)還在于一個(gè)片段同固定于芯片的寡核苷酸的特定片段 相互補(bǔ)，其發(fā)夾轉(zhuǎn)彎處15-20個(gè)通用堿基；其另一部分片段則同熒光檢測(cè)探針的 序列一樣。
本發(fā)明的有益效果是a.檢測(cè)靶標(biāo)蛋白的準(zhǔn)確性與靈敏度高。由于芯片上的 固定的雙或單鏈寡核苷酸都是已知序列，從而保證了每個(gè)微陣列對(duì)靶標(biāo)蛋白結(jié)合 的特異性；最后通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)檢測(cè)信號(hào)成千上萬(wàn)倍的放大，從而保證 了微陣列芯片對(duì)微量蛋白樣本的超靈敏檢測(cè)。b.靶標(biāo)蛋白檢測(cè)的高通量。將能與 蛋白結(jié)合的寡核苷酸直接固定到芯片上，芯片的高通量特性決定了該方法能夠?qū)崿F(xiàn)DNA結(jié)合蛋白檢測(cè)的高通量。c.低成本。對(duì)于芯片的檢測(cè)信號(hào)來(lái)說(shuō)，熒光探 針是成本高的主要原因。本發(fā)明中應(yīng)用通用熒光檢測(cè)探針或直接將熒光標(biāo)記的 dNTP參入擴(kuò)增產(chǎn)物，極大降低了試驗(yàn)成本。d.極好的重復(fù)性與均一性。e.該芯 片還具有制備簡(jiǎn)單、操作方便的特點(diǎn)。


下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的方法和效果。 圖1是高靈敏檢測(cè)微量DNA結(jié)合蛋白的示意圖2是利用該方法檢測(cè)細(xì)胞粗提取物中NF-kappaB和OCT-1蛋白的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
實(shí)現(xiàn)對(duì)同一癌痛敏感樣本的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物中NF-kappaB p50、 NF-kappaB p52和OCT-1蛋白的檢測(cè)分別將用于檢測(cè)NF-k鄰paB p50、 NF-k鄰paB p52和OCT-1蛋白的具有丙烯酰胺修飾的寡核苷酸雙鏈固定到聚丙烯酰胺凝膠芯片 上(以野生型序列和已知NF-kappaB p50樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，以突變型序列和已 知NF-kappaB p50樣本作為陰性對(duì)照)，將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物同芯片進(jìn)行溫育； 然后再用核酸外切酶III對(duì)芯片上雙鏈寡核苷酸進(jìn)行酶切。將凝膠芯片進(jìn)行低頻 超聲去雜后，將環(huán)形檢測(cè)探針同芯片進(jìn)行雜交，并進(jìn)行等溫滾環(huán)擴(kuò)增30分鐘。最 后將擴(kuò)增芯片同通用熒光檢測(cè)探針進(jìn)行雜交，芯片經(jīng)掃描后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通 過(guò)微陣列芯片點(diǎn)陣熒光信號(hào)的有無(wú)可以定性判斷細(xì)胞中相應(yīng)目標(biāo)蛋白的有無(wú)；通 過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱則可以定量判斷相應(yīng)目標(biāo)蛋白的含量。 實(shí)施例2
實(shí)現(xiàn)對(duì)同一癌痛敏感樣本的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物中NF-ka卯a(chǎn)B p50、 NF-kappaBp52和0CT-1蛋白的檢測(cè)分別將用于檢測(cè)NF-kappaB p50、 NF-ka卯a(chǎn)B p52和0CT-1蛋白的具氨基修飾的寡核苷酸雙鏈固定到醛基修飾的芯片上(以野生 型序列和已知NF-k鄰paB p50樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，以突變型序列和已知NF-kappaB p50的樣本作為陰性對(duì)照)，將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物同芯片進(jìn)行溫育；然后再用 核酸外切酶in對(duì)芯片上雙鏈寡核苷酸進(jìn)行酶切。將凝膠芯片進(jìn)行低頻超聲去雜 后，將環(huán)形檢測(cè)探針同芯片進(jìn)行雜交，并進(jìn)行等溫滾環(huán)擴(kuò)增30分鐘。最后將擴(kuò)增 芯片同通用熒光檢測(cè)探針進(jìn)行雜交，芯片經(jīng)掃描后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過(guò)微陣列芯片點(diǎn)陣熒光信號(hào)的有無(wú)可以定性判斷細(xì)胞中相應(yīng)目標(biāo)蛋白的有無(wú)；通過(guò)熒光信
號(hào)強(qiáng)弱則可以定量判斷相應(yīng)目標(biāo)蛋白的含量。 實(shí)施例3
實(shí)現(xiàn)對(duì)同一癌痛敏感樣本的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物中NF-ka卯a(chǎn)B p50、 NF-kappaB p52和OCT-1蛋白的檢測(cè)分別將用于檢測(cè)NF-kappaB p50、 NF-ka卯a(chǎn)B p52和OCT-1蛋白的具生物素修飾的寡核苷酸雙鏈固定到鏈霉親和素修飾的磁性微 球或有機(jī)微球上(以野生型序列和己知NF-kappaB p50的樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，以 突變型序列和已知NF-kappaB p50樣本作為陰性對(duì)照)，將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物 同芯片進(jìn)行溫育；然后再用核酸外切酶in對(duì)微球上雙鏈寡核苷酸進(jìn)行酶切。將 微球進(jìn)行低頻超聲去雜后，將環(huán)形檢測(cè)探針同芯片進(jìn)行雜交，并進(jìn)行等溫滾環(huán)擴(kuò) 增30分鐘。最后將擴(kuò)增微球同通用熒光檢測(cè)探針進(jìn)行雜交，微球通過(guò)流式細(xì)胞儀 或微流體裝置經(jīng)激光掃描后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過(guò)微球的熒光信號(hào)的有無(wú)可以定 性判斷細(xì)胞中相應(yīng)目標(biāo)蛋白的有無(wú)；通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱則可以定量判斷相應(yīng)目標(biāo) 蛋白的含量。 實(shí)施例4
實(shí)現(xiàn)對(duì)同一癌痛敏感樣本的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物中NF-kappaB p50、 NF-ka卯a(chǎn)B p52和OCT-1蛋白的檢測(cè)分別將檢測(cè)用于NF-ka卯a(chǎn)B p50、 NF-kappaB p52和OCT-l蛋白的具生物素修飾的寡核苷酸雙鏈固定到鏈霉親和素修飾的芯片上 (以野生型序列和已知NF-kappaB p50樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，以突變型序列和己知 NF-kappaB p50的樣本作為陰性對(duì)照)，將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物同芯片進(jìn)行溫育； 然后再用核酸外七刀酶ni對(duì)芯片上雙鏈寡核苷酸進(jìn)行酶切。將凝膠芯片進(jìn)行低頻 超聲去雜后，將環(huán)形檢測(cè)探針同芯片進(jìn)行雜交，并進(jìn)行等溫滾環(huán)擴(kuò)增30分鐘。最 后將擴(kuò)增芯片同通用熒光檢測(cè)探針進(jìn)行雜交，芯片經(jīng)掃描后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通 過(guò)微陣列芯片點(diǎn)陣熒光信號(hào)的有無(wú)可以定性判斷細(xì)胞中相應(yīng)目標(biāo)蛋白的有無(wú)；通 過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱則可以定量判斷相應(yīng)目標(biāo)蛋白的含量。 實(shí)施例5
實(shí)現(xiàn)對(duì)同一癌痛敏感樣本的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物中NF-kappaB p50、 NF-ka卯a(chǎn)Bp52和0CT-1蛋白的檢測(cè)分別將檢測(cè)用于NF-ka卯a(chǎn)B p50、 NF-ka卯a(chǎn)B p52和0CT-l蛋白的具有修飾的寡核苷酸單鏈固定到相應(yīng)芯片上(以野生型序列和已知NF-ka卯a(chǎn)B p50樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，以突變型序列和已知NF-kappaB p50樣 本作為陰性對(duì)照)，然后將同用延伸引物同芯片進(jìn)行雜交，并進(jìn)行延伸得到檢測(cè)目 標(biāo)蛋白的雙鏈寡核苷酸微陣列芯片。再將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物同芯片進(jìn)行溫育; 然后再用核酸外切酶in對(duì)芯片上雙鏈寡核苷酸進(jìn)行酶切。將凝膠芯片進(jìn)行低頻 超聲去雜后，將環(huán)形檢測(cè)探針同芯片進(jìn)行雜交，并進(jìn)行等溫滾環(huán)擴(kuò)增30分鐘。最 后將擴(kuò)增芯片同通用熒光檢測(cè)探針進(jìn)行雜交，芯片經(jīng)掃描后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通 過(guò)微陣列芯片點(diǎn)陣熒光信號(hào)的有無(wú)可以定性判斷細(xì)胞中相應(yīng)目標(biāo)蛋白的有無(wú)；通 過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱則可以定量判斷相應(yīng)目標(biāo)蛋白的含量。 實(shí)施例6
實(shí)現(xiàn)對(duì)同一癌痛敏感樣本的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物中NF-kappaB p50、 NF-ka卯a(chǎn)Bp52和OCT-1蛋白的檢測(cè)分別將用于檢測(cè)NF-k鄰paBp50、 NF-ka卯a(chǎn)B p52和0CT-l蛋白的具有修飾的寡核苷酸單鏈固定到相應(yīng)芯片上(以野生型序列和 己知NF-ka卯a(chǎn)B p50樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，以突變型序列和已知NF-ka卯a(chǎn)B p50的 樣本作為陰性對(duì)照)，然后通過(guò)單鏈寡核苷酸的自身轉(zhuǎn)折成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而成為能檢 測(cè)DNA結(jié)合蛋白的雙鏈DNA芯片。再將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物同芯片進(jìn)行溫育； 然后再用核酸外切酶III對(duì)芯片上雙鏈寡核苷酸進(jìn)行酶切。將凝膠芯片進(jìn)行低頻 超聲去雜后，將通用環(huán)形檢測(cè)探針同芯片進(jìn)行雜交(在固定的單鏈能形成發(fā)夾結(jié) 構(gòu)的情況下，環(huán)形探針對(duì)于所有微陣列點(diǎn)來(lái)說(shuō)都是通用的)，并進(jìn)行等溫滾環(huán)擴(kuò)增 30分鐘。最后將擴(kuò)增芯片同通用熒光檢測(cè)探針進(jìn)行雜交，芯片經(jīng)掃描后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn) 行分析。通過(guò)微陣列芯片點(diǎn)陣熒光信號(hào)的有無(wú)可以定性判斷細(xì)胞中相應(yīng)目標(biāo)蛋白 的有無(wú)；通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱則可以定量判斷相應(yīng)目標(biāo)蛋白的含量。 實(shí)施例7
實(shí)現(xiàn)對(duì)同一癌痛敏感樣本的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物中NF-k鄰paB p50、 NF-kappaB p52和OCT-1蛋白的檢測(cè)分別將用于檢測(cè)NF-kappaB p50、 NF-kappaB p52和OCT-1蛋白的具有修飾的寡核苷酸單或雙鏈固定到相應(yīng)芯片上(以野生型序 列和己知NF-k鄰paB p50樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，以突變型序列和已知NF-k即paB p50 樣本作為陰性對(duì)照)，經(jīng)過(guò)相應(yīng)的處理得到檢測(cè)目標(biāo)蛋白的雙鏈寡核苷酸微陣列芯 片。再將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物同芯片進(jìn)行溫育；然后再用核酸外切酶III對(duì)芯 片上雙鏈寡核苷酸進(jìn)行酶切。將凝膠芯片進(jìn)行低頻超聲去雜后，將環(huán)形檢測(cè)探針同芯片進(jìn)行雜交，將具有熒光修飾的dNTP加入到滾環(huán)擴(kuò)增體系中進(jìn)行等溫滾環(huán)擴(kuò) 增30分鐘。最后芯片經(jīng)掃描后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過(guò)微陣列芯片點(diǎn)陣熒光信號(hào)的 有無(wú)可以定性判斷細(xì)胞中相應(yīng)目標(biāo)蛋白的有無(wú)；通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱則可以定量判 斷相應(yīng)目標(biāo)蛋白的含量。 實(shí)施例8
實(shí)現(xiàn)對(duì)同一癌痛敏感樣本的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物中的NF-kappaB p50、 NF-kappaB p52和OCT-1蛋白的檢測(cè)分別將用于檢測(cè)NF-kappaB p50、 NF-ka卯a(chǎn)B p52和OCT-1蛋白的具有修飾的寡核苷酸單或雙鏈固定到相應(yīng)芯片上(以野生型序 列和己知NF-kappaB p50樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，以突變型序列和3知NF-kappaB p50 樣本作為陰性對(duì)照)，經(jīng)過(guò)相應(yīng)的處理得到檢測(cè)目標(biāo)蛋白的雙鏈寡核苷酸微陣列芯 片。再將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)粗提取物同芯片進(jìn)行溫育；然后再用核酸外切酶III對(duì)芯 片上雙鏈寡核苷酸進(jìn)行酶切。將凝膠芯片進(jìn)行低頻超聲去雜后，將環(huán)形檢測(cè)探針 和與固定單鏈寡核苷酸互補(bǔ)的通用延伸引物同芯片進(jìn)行雜交，同時(shí)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增 和通用引物延伸反應(yīng)(得到雙鏈DNA芯片)。最后將SUBGREEN加入到雙鏈DNA芯 片上。最后芯片經(jīng)掃描后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過(guò)微陣列芯片點(diǎn)陣熒光信號(hào)的有無(wú) 可以定性判斷細(xì)胞中相應(yīng)目標(biāo)蛋白的有無(wú)；通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱則可以定量判斷相 應(yīng)目標(biāo)蛋白的含量。
超靈敏檢測(cè)微量DNA結(jié)合蛋白見(jiàn)圖1，圖中(l)是環(huán)形探針捕獲特異蛋白結(jié) 合DNA的序列示意圖A，蛋白結(jié)合的DNA序列部分；B,環(huán)形探針；C,芯片。(2) 是檢測(cè)信號(hào)放大示意圖左，熒光標(biāo)記dNTP直接參入多拷貝滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物；右， 通用熒光標(biāo)記探針與多拷貝滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。
利用該方法檢測(cè)細(xì)胞粗提取物中NF-ka卯a(chǎn)B和OCT-1蛋白的結(jié)果見(jiàn)圖2。圖 中1， NF-kappaB突變序列；2， OCT-1突變序列；3， NF-kappaB野生型序列；4， OCT-1野生型序列。
權(quán)利要求
1.一種DNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于其具體步驟為首先設(shè)計(jì)寡核苷酸DNA芯片；將待篩選的粗細(xì)胞提取液同寡核苷酸DNA芯片直接溫育；再將核酸外切酶III放入上述寡核苷酸DNA芯片體系中溫育；再將環(huán)形探針加入寡核苷酸DNA芯片體系中，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，有結(jié)合蛋白的序列能進(jìn)行擴(kuò)增獲得熒光信號(hào)，而沒(méi)有被蛋白的結(jié)合的序列，被核酸外切酶III所切割則不能進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，不能獲得熒光信號(hào)；最后通過(guò)微陣列熒光信號(hào)的有無(wú)來(lái)判斷芯片體系中DNA結(jié)合蛋白的有無(wú)，通過(guò)熒光強(qiáng)度則能夠定量檢測(cè)出DNA結(jié)合蛋白含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測(cè)方法，其特 征在于寡核苷酸DNA由芯片和被固定到芯片上的的寡核苷酸組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測(cè)方法， 其特征在于寡核苷酸DNA的芯片是普通玻璃片或是微球；其表面修飾是聚丙烯酰 胺修飾、醛基修飾或鏈霉親和素修飾；而相對(duì)應(yīng)的被固定的寡核苷酸的5'端則是 丙烯酰胺修飾、氨基修飾或生物素修飾。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測(cè) 方法，其特征在于被固定到芯片上的的寡核苷酸是雙鏈的寡核苷酸，或是單鏈的 寡核苷酸；通過(guò)延伸的方法得到雙鏈的寡核苷酸芯片，或是通過(guò)具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 單鏈寡核苷酸通過(guò)自身返折成發(fā)夾，最后形成具有雙鏈DNA芯片。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DNA.結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測(cè)方法，其特 征在于所述的的微陣列信號(hào)通過(guò)和環(huán)形探針特定片段互補(bǔ)的熒光探針雜交得到； 或通過(guò)滾環(huán)過(guò)程中熒光標(biāo)記的dNTP參入到延伸核苷酸序列上得到；或者通過(guò)滾環(huán) 擴(kuò)增后得到的單鏈DNA延伸成雙鏈DNA后，再同SUBGREEN染料結(jié)合后得到。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測(cè)方法， 其特征在于所述的環(huán)形探針是人工合成的，或是人工合成后經(jīng)過(guò)連接而成的。
7. 根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測(cè)方 法，其特征在于所述的環(huán)形探針的結(jié)構(gòu)，它的一個(gè)片段同固定于芯片的寡核苷酸特定片段相互補(bǔ)，包括蛋白結(jié)合的DNA序列；其另一部分片段則同熒光檢測(cè)探針 的序列相同。
8.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測(cè)方 法，其特征是所述的環(huán)形探針其結(jié)構(gòu)還在于一個(gè)片段同固定于芯片的寡核苷酸的 特定片段相互補(bǔ)，其發(fā)夾轉(zhuǎn)彎處15-20個(gè)通用堿基；其另一部分片段則同熒光檢測(cè)探針的序列一樣。
全文摘要
本發(fā)明屬于基于微陣列芯片的DNA結(jié)合蛋白檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種超靈敏高通量微陣列芯片的DNA結(jié)合蛋白檢測(cè)技術(shù)。將雙鏈或單鏈寡核苷酸固定到芯片，將待篩選的細(xì)胞粗提取物同芯片直接溫育，再將外切酶放入上述體系中進(jìn)行溫育。最后將環(huán)形探針加入體系中，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。芯片上能與目標(biāo)蛋白結(jié)合的特定點(diǎn)陣序列能作為延伸引物進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增；而沒(méi)有被蛋白結(jié)合的序列，由于被外切酶所消化則不能進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物同通用熒光檢測(cè)探針雜交。根據(jù)芯片上特定陣列點(diǎn)信號(hào)的有無(wú)則可以檢測(cè)出DNA結(jié)合蛋白的有無(wú)；通過(guò)點(diǎn)陣熒光的強(qiáng)度則可以定量檢測(cè)出目標(biāo)蛋白的含量。該芯片能實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA結(jié)合蛋白的超靈敏、低成本、高特異和高通量的檢測(cè)，可以廣泛應(yīng)用于科研和臨床檢測(cè)診斷之中。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101591705SQ20091003241
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2009年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月13日
發(fā)明者張勵(lì)才, 張成標(biāo), 潘志強(qiáng), 邵翠杰 申請(qǐng)人:徐州醫(yī)學(xué)院