本申請是申請日為2009年5月14日的中國專利申請200980119396.9“使用感興趣的基因-報道物融合蛋白和光學(xué)成像的治療送遞和監(jiān)測”的分案申請。
本發(fā)明涉及在細(xì)胞與影響感興趣的基因的表達的化合物接觸時，非介入性監(jiān)測所述細(xì)胞中所述感興趣的基因的表達的方法。
因此，本發(fā)明涉及在細(xì)胞與脫甲基藥物接觸時，監(jiān)測所述細(xì)胞中感興趣的基因的表達增加的方法。本發(fā)明也涉及當(dāng)細(xì)胞與rnai接觸時，監(jiān)測所述細(xì)胞中感興趣的基因的表達減少的方法。所述方法可以在體內(nèi)進行或在人或動物體外進行。
本發(fā)明也涉及包含編碼感興趣的基因-多肽和熒光報道多肽的不同核酸分子。
背景技術(shù)：
當(dāng)前醫(yī)學(xué)的主要任務(wù)之一是開發(fā)能夠選擇性影響懷疑正在受到錯誤調(diào)節(jié)或已知要被錯誤調(diào)節(jié)的基因的表達的治療系統(tǒng)。根據(jù)受影響的基因，這可能展示在嚴(yán)重疾病，如癌中。盡管在該領(lǐng)域已經(jīng)進行了許多努力，仍然需要改進迄今所獲得的結(jié)果，并且將它們與例如能夠容易地監(jiān)測療效和/或送遞治療化合物的系統(tǒng)結(jié)合。
一般地，基因表達的概念可以概括為包括幾個步驟：在dna水平，特定序列編碼蛋白或rna，這兩者都可以展示特定功能。在第一個步驟，將dna轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的rna。該步驟受到包括通常位于5’末端并且緊鄰編碼序列的所謂啟動子區(qū)以及正面和負(fù)面影響轉(zhuǎn)錄的其它上游或下游調(diào)節(jié)性dna元件和轉(zhuǎn)錄因子的緊密控制。在蛋白是基因表達的終產(chǎn)物的情況下，被轉(zhuǎn)錄的rna稱作mrna。在第二個步驟中，該mrna翻譯為蛋白，并且所述蛋白隨后在后續(xù)步驟中任選進一步翻譯后修飾。在rna是終產(chǎn)物的情況下，被轉(zhuǎn)錄的rna可以重排和加工，并且包括在包含例如蛋白的復(fù)合物中。因此，可以通過例如影響第一個步驟，即轉(zhuǎn)錄的靶向因子，在dna水平上影響基因表達。同樣，可以靶向第二個步驟：在蛋白質(zhì)為終產(chǎn)物的情況下，mrna的翻譯可以被阻斷，在rna是終產(chǎn)物的情況下，加工等可以被阻斷。如果一種方法最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的rna的降解，則不能獲得終產(chǎn)物，并且抑制了第二個步驟。
在疾病由基因的減量調(diào)節(jié)或甚至由其完全沉默導(dǎo)致的情況下，療效應(yīng)該是所述內(nèi)源基因增量調(diào)節(jié)到正常水平。對于某些癌類型，例如，顯著的腫瘤抑制基因已知被沉默，并且因此不能表現(xiàn)它們的相應(yīng)腫瘤抑制物功能。dna-甲基化已經(jīng)被鑒定為基因減量調(diào)節(jié)/沉默的主要原因。所述甲基化通常存在于相應(yīng)基因的啟動子區(qū)中。在這些情況下，可以通過從dna除去甲基而恢復(fù)基因表達?；虻臏p量調(diào)節(jié)/沉默也可能是由于作為該基因的負(fù)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄因子的增量調(diào)節(jié)，由此阻斷基因表達而引起的。在這些情況下，治療應(yīng)該涉及編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因的減量調(diào)節(jié)，由此降低轉(zhuǎn)錄因子的水平。
如果基因的增量調(diào)節(jié)導(dǎo)致疾病，則療效應(yīng)該相應(yīng)地是所述內(nèi)源基因減量調(diào)節(jié)到正常水平。在幾乎所有癌類型中，已知基因是增量調(diào)節(jié)的。它們通常稱作癌基因或原癌基因，其中原癌基因可能不直接對例如細(xì)胞增殖起作用，但間接對其起作用，例如，通過導(dǎo)致其它基因增量調(diào)節(jié)。可以使用rnai方法，以便減量調(diào)節(jié)基因表達。與直接在“dna水平”上起作用的脫甲基藥物相反，rnai方法典型地作用于基因表達的第二個步驟，即，翻譯為蛋白或加工為相應(yīng)的rna。這些方法最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的rna的降解。因此，基因表達的整個過程受到rnai的阻斷。這也可以稱作rnai對基因的“沉默”。從機理上，加工人工導(dǎo)入的“rna”(如從載體轉(zhuǎn)錄，作為rna-雙鏈體導(dǎo)入，等等)，并且將一條鏈摻入復(fù)合物，所述復(fù)合物以序列特異性方式識別轉(zhuǎn)錄的rna。這樣，導(dǎo)入的rna的序列指定被靶定的“基因要沉默”。雜交后，識別并形成復(fù)合物，被靶定的rna通過其它機制降解。
目前監(jiān)測影響基因表達的治療系統(tǒng)的效果的方法主要依賴于比較在應(yīng)用治療系統(tǒng)之前和之后疾病如腫瘤的狀態(tài)。因此，可以用例如x線或超聲方法在治療之前和之后確定腫瘤的大小。但是，采用這樣的系統(tǒng)，不能直接監(jiān)測所述治療對于基因表達的效果，也完全不能分析相應(yīng)化合物是否定位于受影響的組織。其它方法需要組織-樣品來確定治療的結(jié)果。因此，活檢或甚至手術(shù)步驟是必須的，這通常伴隨額外的問題，如感染。此外，也只能進行事后分析。
因此，需要建立或改進影響基因表達的治療和允許以非介入性方式監(jiān)測這些治療的應(yīng)用和對被靶定的基因表達的影響的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是提供用于在細(xì)胞與影響感興趣的基因的表達的化合物接觸時，非介入性監(jiān)測所述細(xì)胞中所述感興趣的基因的表達的方法和化合物。
可以從下面的說明書中明確的本發(fā)明的這些和其它目的，是通過獨立權(quán)利要求的主題解決的。從屬權(quán)利要求涉及本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與影響所述感興趣的基因的表達的化合物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給所述化合物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的改變賦值。
在涉及上文所述方法的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明描述了在體內(nèi)非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)甲基化的啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與脫甲基藥物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給脫甲基藥物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的增加賦值。
本發(fā)明在另一優(yōu)選實施方案中描述了非介入性監(jiān)測感興趣的基因的表達的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入人或動物體外的細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)甲基化的啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與脫甲基藥物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給脫甲基藥物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的增加賦值。
本發(fā)明的另一實施方案涉及可以用于上述方法的分離的核酸分子，所述核酸分子包含：
a)甲基化的啟動子序列；
b)與其操作性連接的編碼感興趣的基因多肽的序列；
c)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列。
編碼序列(其包含與編碼熒光報道多肽的序列融合的、編碼感興趣的基因多肽的序列)包含位于5’末端的單個起始密碼子和位于3’末端的單個終止密碼子。本文使用的術(shù)語“單個起始密碼子”不排除存在其它的內(nèi)部atg密碼子。然而，后面的這些密碼子應(yīng)該不起始翻譯。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，感興趣的基因在本發(fā)明的這方面是腫瘤抑制基因或懷疑由于其沉默而導(dǎo)致疾病的基因。
因此，在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及可以用于上述方法的分離的核酸分子，該核酸分子包含：
a)甲基化的啟動子序列；
b)與其操作性連接的編碼多肽的序列，所述多肽選自包含cadm1(seqidno.2)、rb(seqidno.1)、zmynd10(seqidno.3)、rassf5(seqidno.4)、pten(seqidno.5)、serpinb5(seqidno.6)、epb41l3(seqidno.7)和dapk1(seqidno.8)的多肽組；
c)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
其中包含b)和c)的編碼序列包含位于5’末端的單個起始密碼子和位于3’末端的單個終止密碼子。
優(yōu)選地，在上述b)項中提到的序列選自cadm1(seqidno.2)和/或rb(seqidno.1)。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明描述了在體內(nèi)非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因表達的減少的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因的非功能性多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與針對所述感興趣的基因定制的rnai接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給rnai誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的減少賦值。
本發(fā)明另外涉及可以用于所述方法的核酸分子，該核酸分子包含：
a)啟動子序列；
b)與其操作性連接的編碼感興趣的基因的非功能性多肽的序列；
c)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
編碼序列(其包含與編碼熒光報道多肽的序列融合的、編碼感興趣的基因的非功能性多肽的序列)包含位于5’末端的單個起始密碼子和位于3’末端的單個終止密碼子。本文使用的術(shù)語“單個起始密碼子”不排除存在其它的內(nèi)部atg密碼子。然而，后面的這些密碼子應(yīng)該不起始翻譯。
在本發(fā)明這方面的一個優(yōu)選實施方案中，編碼感興趣的基因的非功能性多肽的感興趣的基因序列包含完整的感興趣的基因序列的一部分或含有至少一個插入、至少一個缺失、至少一個核苷酸交換或其混合物的完整的感興趣的基因序列。從而獲得感興趣的基因的非功能性多肽。但是，感興趣的基因區(qū)不包含終止密碼子。
此外，在這方面的一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明描述了如前面兩段所概括的核酸分子，其中感興趣的基因是癌基因、原癌基因或懷疑由于其超量表達而導(dǎo)致疾病的基因。
因此，在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及可以用于上述方法的分離的核酸分子，該核酸分子包含：
a)啟動子序列；
b)與其操作性連接的編碼非功能性多肽的序列，所述非功能性多肽選自包含vegf(seqidno.10)、ras(seqidno.11)、wnt(seqidno.12)、myc(seqidno.13)、erk(seqidno.14)和trk(seqidno.15)的多肽組；
c)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
其中包含b)和c)的編碼序列包含位于5’末端的單個起始密碼子和位于3’末端的單個終止密碼子。
優(yōu)選地，在上述b)項中提到的序列選自vegf(seqidno.10)和/或wnt(seqidno.12)。
因此，在本發(fā)明這方面的一個相應(yīng)的優(yōu)選實施方案中，編碼選自包含vegf(seqidno.10)、ras(seqidno.11)、wnt(seqidno.12)，myc(seqidno.13)、erk(seqidno.14)和trk(seqidno.15)的多肽組的非功能性多肽的序列包含完整序列的一部分或含有至少一個插入、至少一個缺失、至少一個核苷酸交換或其混合物的完整序列，從而獲得非功能性多肽。但是，該序列不包含終止密碼子。
在涉及這方面的一個另外的實施方案中，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，該核酸分子包含：
a)啟動子序列；
b)與其操作性連接的編碼her-2neu(seqidno.9)的非功能性多肽的序列，其中所述序列包含至少一個插入、至少一個核苷酸交換或其混合物，從而獲得非功能性多肽，但是其中該序列不包含終止密碼子；
c)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
其中包含b)和c)的編碼序列包含位于5’末端的單個起始密碼子和位于3’末端的單個終止密碼子。
在本發(fā)明的另一方面，公開了一種方法，其中非介入性監(jiān)測人或動物體外的細(xì)胞中感興趣的基因表達的減少，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入人或動物體外的細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與針對所述感興趣的基因定制的rnai接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給rnai誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的減少賦值。
在上文概括的體內(nèi)和體外方法的實施方案中，所述核酸分子和/或所述rnai可以通過聲致穿孔(sonoporation)、局部注射或脂質(zhì)體袋，或其混合輔助的轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入所述細(xì)胞，所述脂質(zhì)體袋攜帶用于正確靶向、鑒定和定位的、抗宿主細(xì)胞抗原的抗體。
本發(fā)明的另一方面涉及上文公開的方法的用途。
所述方法可以在體內(nèi)或在人或動物體外應(yīng)用。在一個實施方案中，所述方法用于在使細(xì)胞與影響感興趣的基因的表達的化合物接觸時隨時間監(jiān)測所述細(xì)胞中所述感興趣基因的表達，從而用于監(jiān)測所述化合物的效果。
在另一實施方案中，上文公開的方法可以用于送遞影響細(xì)胞中感興趣的基因的表達的化合物、監(jiān)測所述化合物的送遞，以及同時監(jiān)測所述化合物誘導(dǎo)的對所述感興趣的基因的表達的影響。同樣，這適用于體內(nèi)狀況并且適用于在人或動物體外的細(xì)胞中進行的方法。
在另一優(yōu)選實施方案中，上述體內(nèi)或人或動物體外的方法用于調(diào)整影響感興趣的基因的表達的化合物的劑量，從而獲得所述感興趣的基因的表達的進一步改變。
在本發(fā)明的另一方面，將涉及使用脫甲基藥物的方法在一個實施方案中用于測試不同的脫甲基藥物，從而分開或組合鑒定最有效的脫甲基藥物。
在方面在另一個優(yōu)選實施方案中涉及包含rnai的方法。因此，所述方法用于測試針對一種感興趣的基因定制的不同rnai，從而分開或組合鑒定最有效的rnai。
附圖說明
圖1圖解描述了本發(fā)明的可能的應(yīng)用，即rnai治療及其在乳腺癌組織中進行監(jiān)測的示例步驟。
這些步驟在本發(fā)明的實施例部分詳細(xì)描述。
具體實施方式
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達。當(dāng)影響所述感興趣的基因的表達的化合物與細(xì)胞接觸時，可以使用這種系統(tǒng)。
在詳細(xì)描述本發(fā)明的示例實施方案的同時，提供了對于理解本發(fā)明重要的定義。
如說明書和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一個”和“一種”也包括各自的復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確指出相反的意思。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“約”和“大約”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員理解仍然能夠確?？紤]的特征的技術(shù)效果的準(zhǔn)確度區(qū)間。該術(shù)語典型地表示偏離所指出的數(shù)值±10％，優(yōu)選±5％。
應(yīng)該理解術(shù)語“包含”不是限制性的。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“組成”考慮是術(shù)語“包含”的優(yōu)選實施方案。如果下文定義一個組至少包含特定數(shù)目的實施方案，這也表示包括優(yōu)選僅僅由這些實施方案組成的組。
如上文所述，本發(fā)明涉及在細(xì)胞與影響感興趣的基因的表達的化合物接觸時，非介入性監(jiān)測所述細(xì)胞中感興趣的基因的表達的方法。因此，本發(fā)明在一個實施方案中涉及非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與影響所述感興趣的基因的表達的化合物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給所述化合物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的改變賦值。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“非介入性”監(jiān)測是指在本發(fā)明方法的檢測步驟b)和d)中，為了監(jiān)測感興趣的基因的表達，不需要與患者的細(xì)胞和/或被監(jiān)測組織直接物理接觸。因此，檢測步驟過程中不需要手術(shù)或活檢或其它涉及接觸細(xì)胞的方法(例如體外測定中的膜片鉗)。
“監(jiān)測”廣義上是表示隨時間測定參數(shù)和保持跟蹤參數(shù)的過程。
本文使用的術(shù)語“感興趣的基因的表達”包括至少兩個步驟。因此，感興趣的基因轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的rna是基因表達的一個步驟。在蛋白由基因編碼的情況下，所述rna稱作mrna。rna可以進一步加工(如剪接)，并且，在第二個步驟中，mrna翻譯為蛋白。因此，蛋白可以是基因表達的終產(chǎn)物。作為終產(chǎn)物的蛋白的量可能與基因表達水平相關(guān)。但是，rna分子也可以是基因表達的終產(chǎn)物。所述rna也可以是第二個步驟中的加工和修飾的對象。
本文使用的術(shù)語“影響基因表達的化合物”包括任何對內(nèi)源基因表達具有正面或負(fù)面影響的化合物。
所述化合物可以在dna水平上起作用。這表示所述化合物可影響例如dna的甲基化狀態(tài)或?qū)е耫na的結(jié)構(gòu)重排，如從閉合到開放構(gòu)象，而不影響dna序列。由于已知dna甲基化(特別是在啟動子區(qū)中)導(dǎo)致相應(yīng)基因的沉默，已知作為脫甲基藥物起作用的化合物由于從dna除去甲基而增加基因表達。組蛋白脫乙酰酶(hdacs)從dna除去乙?；⑶覅⑴c基因抑制。因此，抑制hdacs的化合物也可以對基因表達具有正面影響。下文也將提到這些通常稱作hdac抑制劑的藥物。但是，在本發(fā)明的一個實施方案中，包括了正面影響基因表達的化合物。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，可以使用作用于基因表達的第二個步驟，即作用于轉(zhuǎn)錄的rna的化合物。在所述rna被降解的情況下，基因表達受到負(fù)面影響。在本發(fā)明的這種實施方案中，例如，可以使用rnai，從而抑制翻譯步驟。所述rnai包括如下文詳細(xì)闡述的sirna、shrna、mirna等。
本文使用的“接觸細(xì)胞”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何送遞化合物，使得它能夠?qū)?xì)胞施加其作用的方式。這可以在體內(nèi)進行，例如，通過靜脈內(nèi)注射、局部應(yīng)用、吸入等。對于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可以簡單地將諸如脫甲基藥物的化合物添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，用于培養(yǎng)。但是，也可以使用下文概括的轉(zhuǎn)染方法，以便使化合物與細(xì)胞接觸，并且，在下一個步驟中，可以將所述化合物導(dǎo)入所述細(xì)胞中。
術(shù)語“核酸分子”在本發(fā)明的上下文中是指dna、rna或其衍生物。優(yōu)選地，它是指雙鏈dna分子。所述核酸分子可以是環(huán)狀或線性的，這依賴于用于將所述核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞中的機制。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“導(dǎo)入細(xì)胞中”定義了核酸分子如dna或rna通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法導(dǎo)入相應(yīng)的細(xì)胞中。此外，“導(dǎo)入”表示所述核酸分子存在于細(xì)胞中，使得存在于所述核酸分子上的編碼序列可以根據(jù)所述區(qū)域如何受到調(diào)節(jié)而表達。為此，可以使用下文詳細(xì)描述的技術(shù)，如轉(zhuǎn)染方法。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“編碼區(qū)”或“編碼序列”意欲包括在5’末端以起始密碼子，即atg開始的dna序列。當(dāng)開始mrna翻譯時，該三聯(lián)體編碼相應(yīng)蛋白的第一個氨基酸，即甲硫氨酸。因此，編碼區(qū)以終止密碼子如tag終止于3’末端，從而終止蛋白翻譯。重要的是注意，對于本發(fā)明，除了上文提到的位于3’末端的一個終止密碼子，在編碼序列內(nèi)的任何地方都不存在終止密碼子。因此，概言之，將完整的編碼序列轉(zhuǎn)錄為一個相應(yīng)的mrna。mrna的翻譯得到一個蛋白，其可以包含至少兩個不同的結(jié)構(gòu)域/多肽/部分。但是，如下文詳細(xì)指出的，所述多肽不一定需要是功能性的；但是，對于所有編碼序列，在所述一個編碼序列內(nèi)可能存在編碼至少兩個多肽的至少兩個序列。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，核酸分子的所述編碼序列包含位于5’末端的單個起始密碼子和位于3’末端的單個終止密碼子。本文使用的術(shù)語單個起始密碼子表示該序列可能包含另外的內(nèi)部atg密碼子，但是，其不能用于起始翻譯。
術(shù)語“感興趣的基因序列”、“感興趣的基因區(qū)”、和“編碼所述感興趣的基因多肽的序列”是指要通過本發(fā)明的方法監(jiān)測的感興趣的基因的dna序列。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選地，所述術(shù)語包含翻譯為蛋白并且懷疑由于錯誤調(diào)節(jié)而導(dǎo)致某特定疾病的基因。這將在下文詳述。因此，所述序列優(yōu)選僅包含基因的編碼區(qū)，即，僅外顯子，無內(nèi)含子。但是，在某些實施方案中，它可以適用于也使用感興趣的基因的內(nèi)含子區(qū)。
在下文中，將詳細(xì)解釋術(shù)語“報道多肽”和“報道物”。本段落涉及本發(fā)明的所有實施方案，即，涉及下文詳細(xì)提到的所有方法和本發(fā)明包括的所有核酸分子。重要的是指出編碼報道多肽的序列總是符合編碼序列的5’末端的唯一atg的讀框，使得相應(yīng)多肽總是正確表達，即，制備功能性多肽/蛋白。此外，在本發(fā)明的所有實施方案中，編碼報道多肽的核酸序列編碼熒光報道多肽。所述熒光報道多肽可以選自藍色、綠色、青色、紅色或紅外熒光蛋白。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，報道序列編碼綠色熒光蛋白。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“操作性融合的”定義了至少兩個dna區(qū)(如編碼感興趣的基因多肽的序列和編碼報道多肽的序列)彼此連接。因此，它們可以在一個優(yōu)選實施方案中形成一個表達產(chǎn)物，即一個蛋白的一個編碼序列，所述表達產(chǎn)物包含至少兩個不同的結(jié)構(gòu)域/多肽。因此，如上文提到的，僅僅存在一個編碼相應(yīng)蛋白的可讀框，其中編碼報道多肽的序列總是符合所述可讀框，以便表達功能性報道多肽。優(yōu)選地，感興趣的基因序列在5’與報道序列融合從而編碼蛋白，所述蛋白由感興趣的基因多肽和隨后的熒光報道多肽構(gòu)成。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子的編碼區(qū)可以額外包含位于融合的感興趣的基因和報道序列之間的編碼多肽間隔基的間隔區(qū)。同樣在此情況下，間隔區(qū)總是符合所述可讀框，以便表達功能性間隔多肽。
術(shù)語“操作性連接的”表示上文定義的編碼區(qū)的表達受到其它區(qū)域，如啟動子或增強子的機械控制。這些區(qū)域通常是也存在于核酸分子中的其它dna區(qū)。所述操作性連接的區(qū)域可以是核酸分子上的任何位置。但是，它們優(yōu)選作為調(diào)節(jié)區(qū)，如編碼序列5’的啟動子存在。
在控制編碼序列的表達的上下文中，術(shù)語“啟動子序列”或簡單地“啟動子”是指確定的dna序列，其影響基因的表達。因此，典型的啟動子序列包含由特定細(xì)胞因子識別的特定長度的確定的堿基序列。通常，這些因子結(jié)合也這些保守的序列，并且作為基因表達的正或負(fù)調(diào)節(jié)劑，并且因此通常稱作“轉(zhuǎn)錄因子”。很多啟動子序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，甚至人工核酸分子中不同啟動子序列的組合也是可能的。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以使用不同的啟動子。因此，本發(fā)明的核酸分子在優(yōu)選實施方案中可以包含啟動子序列，其中所述啟動子序列是由至少一個誘導(dǎo)所述編碼序列表達的人轉(zhuǎn)錄因子識別的人啟動子。此外，所述人啟動子可以是強的組成型活性啟動子。在其它實施方案中，所述人啟動子可以是強的誘導(dǎo)型如組織選擇性啟動子。在某些實施方案中，它也可以是病毒啟動子。在本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案中，調(diào)節(jié)包含感興趣的基因序列等的編碼序列的表達的核酸分子的啟動子序列可以是內(nèi)源性啟動子序列(即，調(diào)節(jié)感興趣的內(nèi)源基因表達的序列)，由此反映內(nèi)源性狀況。
術(shù)語“通過非介入性光學(xué)成像方法檢測”是指可以用于非介入性檢測細(xì)胞中的熒光報道多肽的任何方法。由于該方法依賴于報道多肽，它使得能夠了解所述多肽和表達所述多肽的細(xì)胞的功能性和生物化學(xué)特性?！肮鈱W(xué)成像”方法典型地依賴于這樣的試劑，其通常稱作造影劑；在本發(fā)明中，熒光報道多肽代表所述造影劑。
優(yōu)選地，通過熒光顯微術(shù)、熒光成像、單光子和多光子共焦顯微術(shù)、激光誘導(dǎo)的熒光等進行根據(jù)本發(fā)明方法的熒光報道多肽的檢測。由于熒光蛋白在激發(fā)后發(fā)射特定波長的顏色，細(xì)胞中的熒光蛋白需要通過使用特定激發(fā)波長激發(fā)然后檢測所發(fā)射的波長的光(例如，gfp通過uv光激發(fā)，并且發(fā)射相應(yīng)于綠色的波長的光)。因此，本發(fā)明中使用的成像方法是指發(fā)射特定波長的光以便激發(fā)熒光多肽并且檢測由發(fā)熒光的多肽發(fā)射的特定波長的光的裝置。該裝置當(dāng)然可以偶聯(lián)于常規(guī)光學(xué)顯微鏡、監(jiān)視器、數(shù)據(jù)存儲裝置等。所述裝置可以根據(jù)要監(jiān)測的區(qū)域進行定位。所述區(qū)域可以是例如單細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)皿的特定區(qū)域中的細(xì)胞簇或人或動物中細(xì)胞，優(yōu)選是包含通過本發(fā)明的方法監(jiān)測的人或動物體內(nèi)的一些細(xì)胞的組織?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何能夠檢測熒光多肽的裝置。
在本發(fā)明方法的步驟b)中，在細(xì)胞與影響感興趣的基因表達的化合物接觸前檢測熒光報道多肽的水平。然后，在后續(xù)步驟中，在所述影響感興趣的基因表達的化合物與所述細(xì)胞接觸后再次檢測報道多肽。這樣，可以檢測報道多肽的兩個不同水平。然后可以如步驟e)概括的那樣“比較”這兩個水平。但是，本發(fā)明不意欲排他地依賴于兩個步驟。在本發(fā)明另外的優(yōu)選實施方案中，可以重復(fù)第二個檢測步驟至少2、3、4、5、6、10或100次，以便隨時間獲得數(shù)據(jù)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其中第二個檢測步驟d)進行數(shù)次，從而確定感興趣的基因的表達隨時間的改變。因此，在所述實施方案中，可以隨時間分析報道多肽的水平。
在另一優(yōu)選實施方案中也可以實時記錄信號，以便獲得讀出結(jié)果，即熒光蛋白檢測的影像。這可以稱作“活細(xì)胞成像”或“活組織成像”。
當(dāng)然，可以根據(jù)影響感興趣的基因的表達的化合物調(diào)整時間點。例如，如果已知化合物緩慢作用于感興趣的基因的表達，在導(dǎo)入所述化合物后例如5、10、20、30或60分鐘的額外時間后檢測熒光報道多肽的水平可能是有幫助的。在使用快速作用化合物的情況下，可以在導(dǎo)入化合物數(shù)秒內(nèi)執(zhí)行第二個檢測步驟。
此外，術(shù)語“比較”應(yīng)該理解為在所述至少兩個檢測步驟中比較報道多肽的相對量。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明描述了上文概括的方法，其中通過分析在步驟b)和d)中檢測的報道多肽的相對量，進行比較步驟e)。這樣，不是必須對所述多肽的絕對量進行定量。但是，當(dāng)使用所述相對量時，需要確保該量針對對照或在所述至少兩個檢測步驟中相同的值進行了歸一化，以便獲得歸一化的相對量。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“給改變賦值”表示在所述比較后，將所述至少兩個檢測步驟中的一種和多種差異分別表示為例如百分比。這可以包括報道多肽隨特定檢測時間的減少百分比或增加百分比。這也可以得到以下結(jié)論：當(dāng)檢測所述至少兩個報道多肽時，報道多肽的水平?jīng)]有隨時間改變，或在兩個時間點之間沒有改變。
本發(fā)明的方法可以在體內(nèi)或體外使用。
在“體內(nèi)狀況下”，本發(fā)明的方法中提到的細(xì)胞可以是人或動物的組織的部分，或可以是在人或動物體內(nèi)循環(huán)的細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，不僅僅是單個細(xì)胞，優(yōu)選地，特定組織的細(xì)胞或懷疑或已知導(dǎo)致特定疾病的細(xì)胞可以是本發(fā)明的靶。如上文概括的，某些重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)物(如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物如prb、細(xì)胞周期蛋白、cdks等)的錯誤調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致疾病，如癌。在體內(nèi)方案中，當(dāng)施用影響表達的化合物時，本發(fā)明的方法可以用于監(jiān)測例如癌組織或腫瘤中感興趣的基因的表達。根據(jù)本發(fā)明的該體內(nèi)狀況的優(yōu)選實施方案將在下文詳細(xì)描述。
因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明描述了在體內(nèi)非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與影響所述感興趣的基因的表達的化合物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給所述化合物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的改變賦值。
本發(fā)明在這種體內(nèi)方案的一個優(yōu)選實施方案中描述了上文概括的方法，其中所述核酸分子和/或所述影響感興趣的基因的表達的化合物(如rnai)可以可以通過聲致穿孔、局部注射或脂質(zhì)體袋，或其混合輔助的轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入所述細(xì)胞，所述脂質(zhì)體袋攜帶用于正確靶向、鑒定和定位的、抗宿主細(xì)胞抗原的抗體。所述技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
此外，本發(fā)明在一個優(yōu)選的體內(nèi)實施方案中涉及這樣的方法：其中根據(jù)要監(jiān)測的組織的深度來選擇報道序列編碼的熒光報道多肽，即，對于表淺組織，熒光蛋白選自藍色、綠色或青色熒光蛋白，對于深組織，熒光蛋白選自紅色或紅外熒光蛋白。
本發(fā)明的方法也可以體外使用。所述體外方案優(yōu)選是指使用在細(xì)胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞或從人或動物體提取的細(xì)胞并且在人或動物體外使用和/或處理的系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明的“哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和使用的所有細(xì)胞系。這些細(xì)胞系可以是人、小鼠、大鼠、倉鼠或雞細(xì)胞系，并且可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)培養(yǎng)。當(dāng)然，可以使用不同的人細(xì)胞系，如hela細(xì)胞、293細(xì)胞、wi-38細(xì)胞、u2os細(xì)胞等等。
因此，本發(fā)明的一個實施方案包括非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入人或動物體外的細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與影響所述感興趣的基因的表達的化合物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給所述化合物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的改變賦值。
本發(fā)明在這種體外方案的一個優(yōu)選實施方案中描述了上文概括的方法，其中所述核酸分子和/或所述影響感興趣的基因的表達的化合物(如rnai)可以通過聲致穿孔、脂質(zhì)體袋、電穿孔，或其混合輔助的轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入所述細(xì)胞。所述技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
根據(jù)本發(fā)明的方法監(jiān)測的感興趣的基因的表達改變可以是所述感興趣的基因的增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)。如上文所述，這可以在體內(nèi)或體外分析。在第一種狀況或疾病中，感興趣的基因可以減量調(diào)節(jié)，并且，因此，目標(biāo)可以是所述感興趣的基因的增量調(diào)節(jié)和所述增量調(diào)節(jié)的監(jiān)測。第二種狀況可以是感興趣的基因在疾病中增量調(diào)節(jié)。在這種狀況下，目標(biāo)可以是減量調(diào)節(jié)相應(yīng)的基因并且通過本發(fā)明的方法監(jiān)測所述減量調(diào)節(jié)。針對任一種狀況的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和方法的優(yōu)選實施方案在下文中描述。這些實施方案意欲舉例說明所述狀況。因此，可以使用對基因表達的減量調(diào)節(jié)或增量調(diào)節(jié)具有相同的總體效果的其它化合物。
在感興趣的基因被減量調(diào)節(jié)的情況下，本發(fā)明的方法在一個優(yōu)選實施方案中可以包括使用脫甲基化合物來增量調(diào)節(jié)所述基因。在相反的狀況中，當(dāng)感興趣的基因的減量調(diào)節(jié)可以作為目標(biāo)時，本發(fā)明的方法在優(yōu)選實施方案中是指使用rnai。下面將進一步詳細(xì)描述這兩組優(yōu)選實施方案。
為了分析基因是否由于dna甲基化而減量調(diào)節(jié)/沉默，可以在確定治療之前和使用本發(fā)明的監(jiān)測方法之前進行差別甲基化研究。這可以用細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)進行。可以用這種細(xì)針抽吸技術(shù)獲得dna樣品并且分析它們的甲基。所述方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在下面的段落中，提到了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其涉及監(jiān)測感興趣的基因表達增加的核酸分子和方法。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，所述核酸分子包含：
a)甲基化的啟動子序列；
b)與其操作性連接的編碼感興趣的基因多肽的序列；
c)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列。
包含b)和c)的編碼序列包含位于5’末端的單個起始密碼子和位于3末端的單個終止密碼子。本文使用的術(shù)語單個起始密碼子表示序列可以包含另外的內(nèi)部atg密碼子，然而，其不能用于起始翻譯。
如上文已經(jīng)提到的，已知dna，特別是啟動子的甲基化抑制所述啟動子控制的基因的表達。dna的甲基化優(yōu)選理解為堿基，優(yōu)選胞嘧啶的甲基化。與甲基化的啟動子序列操作性偶聯(lián)的基因可能沒有描述，因此可能不是活性的。對于上述核酸分子，如果啟動子序列是甲基化的并且保持甲基化，將不會表達包含b)和c)的相應(yīng)編碼序列。但是，如果所述區(qū)域不再被甲基修飾，所述序列是由至少一種誘導(dǎo)所述編碼區(qū)表達的人轉(zhuǎn)錄因子識別的人啟動子序列。因此，所述甲基化的啟動子區(qū)的脫甲基將導(dǎo)致未甲基化的區(qū)域能夠驅(qū)動與所述區(qū)域操作性偶聯(lián)的基因表達。本發(fā)明在一個實施方案中包含如剛剛描述的核酸分子，其中在脫甲基藥物的作用后，未甲基化的啟動子序列是由至少一種誘導(dǎo)編碼序列表達的人轉(zhuǎn)錄因子識別的人啟動子。在一個優(yōu)選實施方案中，核酸分子的所述甲基化啟動子與感興趣的基因的內(nèi)源甲基化啟動子相同。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，上面段落中描述的要求保護的核酸分子包括感興趣的基因序列，其中感興趣的基因是腫瘤抑制基因或懷疑由于其沉默而導(dǎo)致疾病的基因。在所述實施方案的一個實例中，感興趣的基因可以是rb。在其它情況下，感興趣的基因可以是cadm1、zmynd10、rassf5、pten、serpinb5、epb41l3、dapk1等。
在其它實施方案中，所述構(gòu)建體/核酸分子可以用于本發(fā)明的體內(nèi)方法或體外方法中。
本文使用的術(shù)語“脫甲基藥物”或“脫甲基化合物”意欲包括任何能夠在細(xì)胞中進行dna脫甲基，即從dna，優(yōu)選從胞嘧啶除去甲基的藥物。所述化合物可以選自包括5-氮雜胞苷等的化合物。5-氮雜胞苷的系統(tǒng)iupac命名是4-氨基-1-[3，4-二羥基-5-(羥基甲基)氧雜環(huán)戊烷(oxolan)-2-基]-1，3，5-三嗪-2-酮)。分別在dna復(fù)制和dna轉(zhuǎn)錄過程中將胞苷的所述化學(xué)類似物摻入dna和rna。這種摻入抑制甲基轉(zhuǎn)移酶如dnmt1的活性。這樣，該摻入導(dǎo)致脫甲基。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其他胞苷類似物和/或與5-氮雜胞苷起相似作用的化合物，如5-氮雜-2’脫氧胞苷、1-(β-d-呋喃核糖基)、脫氫-5-氮雜-胞苷、[1-(β-d-呋喃核糖基)-1，2-二氫嘧啶-2-酮](其也稱作zebularine)等。它們的作用機理也可以基于通過形成復(fù)合物抑制甲基轉(zhuǎn)移酶和/或消耗甲基轉(zhuǎn)移酶等。如上文已經(jīng)陳述的，所述藥物對甲基化的啟動子區(qū)的作用是激活受控制的基因。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明因此涉及在體內(nèi)非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)甲基化的啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與脫甲基藥物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給脫甲基藥物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的增加賦值。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及至少包含以下步驟的方法：
a)將核酸分子導(dǎo)入人或動物體外的細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)甲基化的啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與脫甲基藥物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給脫甲基藥物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的增加賦值。
在體內(nèi)和體外方案的上下文中，本發(fā)明在優(yōu)選實施方案中描述了一種方法，其中可以根據(jù)上文列出的步驟f)中的賦值，增加或減少脫甲基藥物的劑量。此外，本發(fā)明也在一種優(yōu)選實施方案中描述了一種方法，其中可以分開或組合測試不同的脫甲基藥物，從而獲得根據(jù)上文列出的步驟f)中的賦值的、所述感興趣基因的表達的最強增加。
感興趣的基因的減量調(diào)節(jié)也可以是由于相應(yīng)dna序列的構(gòu)象限制。已知封閉構(gòu)象，特別是在啟動子區(qū)中，可以負(fù)面影響基因表達。dna的所述封閉或“填充的”構(gòu)象似乎與dna的乙?；癄顟B(tài)相關(guān)。因此，dna上的乙?；坪鯇?dǎo)致更開放的dna構(gòu)象，并且因此正面影響基因表達。所述乙?；ㄟ^組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(hats)轉(zhuǎn)移到dna，并且通過組蛋白脫乙酰酶(hdacs)從dna除去。通過抑制hdacs，dna的乙?；癄顟B(tài)可以增加，并且因此可以增量調(diào)節(jié)基因表達。用于本發(fā)明的方法中的典型hdac抑制劑可以是3-(1-甲基-4-苯基乙?；?1h-2-吡咯基)-n-羥基-2-丙烯酰胺、環(huán)[(2s)-2-氨基-8-氧代癸?；?1-甲氧基-l-色氨酰-l-異亮氨酰-(2r)-2-piperidinexcarbonyl]，丁酸鈉、4，5：8，9-二脫水-1，2，6，7，11-五脫氧-d-蘇-d-艾杜(ido)-十一-1，6-dienitol、6-(1，3-二氧代-1h，3h-苯并[de]異喹啉-2-基)-己酸羥基酰胺、2-[(2-羥基茶-1-基亞甲基)氨基]-n-(1-苯乙基)苯甲酰胺、[r-(e，e)]-7-[4-(二甲基氨基)苯基]-n-羥基-4，6-二甲基-7-氧代-2，4-庚二烯酰胺等。這些抑制劑由例如sigmaaldrich(參見http://www.sigmaaldrich.com/area_of_interest/life_science/cell_signaling/product_highlights/histone_deacetylase_inhibitors.html)提供。hdac抑制劑的其它實例是pxd101(也稱作belinostat)和saha。特別在本發(fā)明的該實施方案中，用于本發(fā)明的方法中的核酸分子的啟動子區(qū)相應(yīng)于感興趣的基因的內(nèi)源啟動子，由此反映內(nèi)源啟動子的dna構(gòu)象。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明因此涉及在體內(nèi)非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的方法，該方法至少包括：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)所述感興趣的基因的啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與hdac抑制劑接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給所述hdac抑制劑誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的增加賦值。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入人或動物體外的細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)所述感興趣的基因的啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與hdac抑制劑接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給所述hdac抑制劑誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的增加賦值。
在下面的段落中，將提到涉及用于監(jiān)測感興趣的基因的表達減少的核酸分子和方法的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的體內(nèi)方法的核酸分子，所述核酸分子包含：
a)啟動子序列；
b)與其操作性連接的編碼感興趣的基因的非功能性多肽的序列；
c)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
其中包含b)和c)的編碼序列包含位于5’末端的至少一個起始密碼子和位于3’末端的單個終止密碼子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，如上面段落描述的要求保護的核酸分子包含感興趣的基因序列，其中感興趣的基因是癌基因或原癌基因或懷疑由于其超量表達導(dǎo)致疾病的基因。在所述實施方案的一個實例中，感興趣的基因可以是her-2neu。在其它實例中，感興趣的基因可以是vegf，ras，wnt，myc，erk，trk等。
參照本發(fā)明的這些優(yōu)選實施方案，很明顯為什么感興趣的基因-多肽可以優(yōu)選在體內(nèi)方案之中不是功能性的。在它是功能性的情況下，這會導(dǎo)致基因(在大多數(shù)情況下是癌基因)表達的總體增加，這是由感興趣的內(nèi)源基因和外源基因序列的超量表達導(dǎo)致的。這可能對細(xì)胞/組織是有害的。
因此，在涉及本發(fā)明的核酸分子和涉及體內(nèi)方法的優(yōu)選實施方案中，編碼非功能性多肽的感興趣的基因序列包含完整的感興趣的基因序列的部分，或含有至少一個插入、至少一個缺失、至少一個核苷酸交換或其混合物的完整的感興趣的基因序列，從而獲得感興趣的基因的非功能性多肽。但是，它不包含終止密碼子。因此，例如可以通過由感興趣的基因序列中的至少一個插入或至少一個缺失導(dǎo)致的移碼，獲得感興趣基因的非功能性多肽。它也可以通過導(dǎo)致相應(yīng)多肽中氨基酸取代的單個核苷酸交換獲得，所述氨基酸取代導(dǎo)致得到的蛋白的三維結(jié)構(gòu)破壞。在癌基因是感興趣的基因的情況下，可以去除編碼得到的癌基因的功能部分的序列(例如催化劑結(jié)構(gòu)域、結(jié)合結(jié)構(gòu)域、二聚化結(jié)構(gòu)域等)，并且使用其余的編碼序列作為本發(fā)明的核酸分子中的感興趣的基因序列。在這樣進行中，得到的多肽不是功能性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然知道可以除去多個序列，并且根據(jù)感興趣的基因，除去的序列的長度可以改變。
在感興趣的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子的情況下，在本發(fā)明的這方面描述的核酸分子的啟動子序列可以在其它實施方案中是僅由感興趣的基因編碼的所述人轉(zhuǎn)錄因子識別的人啟動子。因此，在實現(xiàn)所述感興趣的基因的減量調(diào)節(jié)的情況下，由于作為相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的感興趣的基因多肽的水平降低，編碼序列(由此熒光報道多肽)的表達也將減量調(diào)節(jié)。
在另外的實施方案中，所述構(gòu)建體/核酸分子可以在根據(jù)本發(fā)明的體內(nèi)方法或體外方法中使用。
在本文的上下文中，本發(fā)明描述了監(jiān)測感興趣的基因的表達減少的方法。所述減少可以通過包括反義rna、shrna、sirna、mirna或其它具有相似功能的核酸分子的化合物/分子實現(xiàn)，上述這些分子統(tǒng)稱為“rnai”或“rna干擾”或“抑制劑分子”。所述分子可以額外地通過例如納米顆粒修飾。
使用這些rna干擾策略，關(guān)鍵的是使用僅僅特異性干擾感興趣的基因表達而不干擾其它不相關(guān)細(xì)胞因子表達的分子。所述基于rna的抑制劑的選擇、鑒定和生產(chǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
典型地，將根據(jù)例如可能對基于抑制性rna的分子和各自的mrna之間的體內(nèi)相互作用起抑制作用的二級結(jié)構(gòu)元件的缺乏，鑒定感興趣的基因的編碼序列內(nèi)可能受到反義策略或基于sirna的方法影響的序列?？梢杂糜嬎銠C程序如sfold鑒定核酸的這樣的區(qū)段。
然后，在第二個步驟中，這些序列將與其它序列進行比較，從而確定它們對于各自的感興趣的基因是否是獨特的。這可以通過例如在國家生物技術(shù)信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行blast檢索而完成。
一旦已經(jīng)鑒定了獨特的序列，可以使用優(yōu)選與鑒定的序列精確匹配的互補序列選擇反義或sirna抑制劑。當(dāng)然，可以使用更低程度的互補性，前提是互補性不降低到可能發(fā)生基于反義序列或sirna的抑制劑和其它細(xì)胞因子的信使rna之間的非特異性相互作用的水平。
典型地，基于抑制性rna的分子和鑒定的特異性序列之間的互補性評級將是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
術(shù)語“互補性”當(dāng)然是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，它涉及核酸分子基于腺苷與胸腺嘧啶配對以及尿嘧啶和胍與胞嘧啶配對的能力而彼此雜交的基本特性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然理解賦予與感興趣的基因的完整編碼序列或其部分的互補性的核酸序列必須具有確?；パa序列實際上特異于感興趣基因的特定最小長度。
因此，抑制性分子內(nèi)賦予與感興趣的基因的互補性的核酸序列的長度應(yīng)該是至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300或至少400個核苷酸，并且形成連續(xù)的區(qū)段。
本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然也知道根據(jù)給感興趣的基因的編碼序列或其部分賦予互補性的核酸序列長度，確保賦予互補性的核酸序列實際上僅僅特異性靶定感興趣的基因所必須的最小互補性程度將改變。因此，如果使用30、50、60、75、100個核苷酸的較長核酸分子，可以使用較低程度的互補性，并仍然確保抑制性分子與感興趣的基因的編碼序列或其部分之間的特異性，而當(dāng)然如果抑制性分子內(nèi)的賦予互補性的核酸序列包括例如僅僅至少14、15、16、17或19個核苷酸的區(qū)段，則必須有較高程度的互補性。
如上文提到的，可以通過按照上文的概述設(shè)計的“rnai”或“rna干擾”或“抑制劑分子”實現(xiàn)感興趣的基因表達的減少。
一類所述抑制劑分子因此可以是包含重組核酸分子的分子，所述核酸分子具有與感興趣的基因的完整編碼序列或其部分互補的核酸序列。核酸序列分子可以由dna、rna或其它基于核酸的分子構(gòu)成，但是，代替核苷酸，其也可以至少部分包含核苷酸類似物，只要得到的分子能夠與感興趣的基因的完整編碼序列或其部分特異性雜交。
在一個優(yōu)選實施方案中，上文描述的抑制性分子優(yōu)選包括反義rna、shrna、sirna、mirna或與感興趣的基因具有相似功能的其它核酸分子。
這些術(shù)語明確給本領(lǐng)域技術(shù)人員指出了應(yīng)該如何合成這些分子，應(yīng)該考慮何種互補性程度等。應(yīng)該理解，根據(jù)本發(fā)明的反義rna以及shrna和sirna應(yīng)該滿足上述關(guān)于這些核酸分子的長度、它們的互補性程度等的標(biāo)準(zhǔn)。
反義分子典型地將包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、70、100、150、200、300或更多個核苷酸的長度。
為了rna干擾的目的，可以使用所謂的短發(fā)夾rna或合成的雙鏈sirna寡核苷酸。
sirna分子將典型地包含20、21、22、23、24或25個核苷酸的長度。
典型地，由于表達了shrna分子，單鏈rna分子形成分子內(nèi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。通過切酶的細(xì)胞內(nèi)加工，由其產(chǎn)生sirna分子。
如果shrna雙鏈體的兩條鏈都是用單rna分子或dna分子形式的表達載體表達的，則可以實現(xiàn)shrna分子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。為此目的，轉(zhuǎn)錄的rna鏈應(yīng)該理想地包含有義shrna序列的19-21個核苷酸，并且理想地包含相應(yīng)互補序列的19-21個核苷酸。兩條序列都應(yīng)該理想地通過6個核苷酸長度的間隔區(qū)分開。
公知的是sirna介導(dǎo)的細(xì)胞靶轉(zhuǎn)錄物的抑制效率依賴于合適的sirna序列的選擇。已經(jīng)開發(fā)了設(shè)計有效sirna分子的指南。這些指南典型地來自合成的sirna寡核苷酸，但也適用于shrna分子的加工形式。
不同于僅僅在細(xì)胞內(nèi)表達和加工后獲得的shrna分子，合成的sirna寡核苷酸由典型是19-21個核苷酸長度的雙鏈rna分子組成。這些sirna分子可以例如轉(zhuǎn)染到上文提到的細(xì)胞系統(tǒng)中并且因此將起始rnai過程。
被靶定的序列和sirna序列基序的確定可以例如根據(jù)公知的公開文獻如tuschl等人的公開文獻來確定。因此，可以使用靶mrna的編碼區(qū)來僅僅鑒定合適的sirna靶序列。盡管優(yōu)選的是選擇的sirna序列基序針對靶mrna的編碼區(qū)，它也可以針對感興趣的基因的調(diào)節(jié)區(qū)，如5’和3’非翻譯區(qū)進行設(shè)計。
如果信使rna的編碼序列用作靶序列，可以典型地使用從起始密碼子下游70個核苷酸開始并且終止于終止密碼子上游50個核苷酸的序列。
然后可以檢索該序列區(qū)，得到序列motiveaa(n19)，其中n代表任何核苷酸。得到的sirna序列然后將包含motiveaa后的19個核苷酸，并且優(yōu)選包含兩個額外添加的尿苷或胸苷殘基。在合成的sirna寡核苷酸的情況下，尿苷殘基可以優(yōu)選被胸苷替代。
在另一方法中，可以根據(jù)reynolds等的文獻使用指南。
reynolds等建議了以下用于選擇潛在的shrna或合成的sirna靶序列的標(biāo)準(zhǔn)：
1.30-50％鳥嘌呤-胞嘧啶含量
2.有義鏈的第15-19位的至少3個腺嘌呤或尿嘧啶
3.缺乏分子間發(fā)夾結(jié)構(gòu)
4.有義鏈第19位的腺嘌呤
5.有義鏈第3位的腺嘌呤
6.有義鏈第10位的尿嘧啶
7.有義鏈第19位無鳥嘌呤或胞嘧啶
8.有義鏈第13位無鳥嘌呤
這8個標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)以下方案加權(quán)：
(i)標(biāo)準(zhǔn)1、3、4、5和6是1分
(ii)15-19位，至少3個相應(yīng)堿基的每個腺嘌呤或尿嘧啶是1分(標(biāo)準(zhǔn)2)
(iii)不滿足標(biāo)準(zhǔn)7-8，每個得到-1分。
根據(jù)reynolds，僅應(yīng)該考慮根據(jù)該方案分值至少為6的sirna或shrna序列。然后，這樣的sirna序列可以用于采用blast程序進行同源性檢索。在此方法后，可以排除以下這樣的sirna：由于它們與其它編碼mrna序列的同源性將導(dǎo)致靶結(jié)構(gòu)的非特異性抑制。
如果以此方式鑒定了sirna或shrna序列，它們可以克隆到表達質(zhì)粒中。因此，可以將rna序列克隆到質(zhì)粒psuppressor(pshh，imgenex，sandiego，ca，usa)中。為了將sirna序列克隆到pshh構(gòu)建體中，可以使用雜交的dna寡核苷酸，其包含sirna有義序列、間隔區(qū)、相應(yīng)的反義序列和終止序列。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明因此涉及在體內(nèi)非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因的非功能性多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與針對所述感興趣的基因定制的rnai接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給rnai誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的減少賦值。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入人或動物體外的細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與針對所述感興趣的基因定制的rnai接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給rnai誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的減少賦值。
在人或動物體外的細(xì)胞中監(jiān)測rnai的效果的上下文中，本發(fā)明的一個實施方案涉及將步驟c)中的rnai靶向于已經(jīng)表達報道多肽的細(xì)胞的方法；因此，在所述細(xì)胞中已經(jīng)導(dǎo)入了核酸分子。所述實施方案包括含有第二編碼序列的第二核酸分子或第一核酸分子上的第二編碼序列，其中所述第二編碼序列操作性偶聯(lián)于強的組成型啟動子。在它是第二分子的情況下，將其與第一核酸分子一起導(dǎo)入細(xì)胞中。所述第二編碼區(qū)編碼也在導(dǎo)入后表達的跨膜蛋白。因此，表達感興趣的基因多肽和報道多肽的細(xì)胞也表達跨膜蛋白。通過細(xì)胞定位和加工信號而將蛋白靶向于細(xì)胞膜。但是，所述跨膜蛋白的細(xì)胞外部分是人工的，因此通常不存在于細(xì)胞外。因此，該細(xì)胞外部分將細(xì)胞“標(biāo)記”為已經(jīng)內(nèi)化，并且表達步驟a)的核酸分子。它也可以作為被特異性靶向于跨膜蛋白的該細(xì)胞外部分的任何抗體的停泊位點。所述抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)程序容易地獲得?，F(xiàn)在為了將步驟c)中的rnai特異性靶向于并且靶向進入已經(jīng)表達核酸分子的編碼序列的細(xì)胞，跨膜蛋白的人工部分可以用作錨定區(qū)。如上文提到的，可以通過轉(zhuǎn)染技術(shù)，尤其通過使用攜帶抗細(xì)胞的外部抗原的抗體的脂質(zhì)體袋的方法，導(dǎo)入rnai。這些抗體可以抗跨膜蛋白的細(xì)胞外部分，并且因此rnai被特異性靶向于它們的靶細(xì)胞。
需要理解，在本發(fā)明的任何涉及rnai的方法中，用于所述方法的核酸分子的感興趣的基因序列至少包含感興趣的基因中的區(qū)域，所述rnai是針對該區(qū)域定制的。
在體內(nèi)和體外方案的上下文中，本發(fā)明在優(yōu)選實施方案中描述了一種方法，其中可以根據(jù)上文列出的步驟f)中的賦值，增加或減少rnai的劑量。此外，本發(fā)明也在一種優(yōu)選實施方案中描述了一種方法，其中可以分開或組合測試針對一種感興趣基因定制的不同rnai，從而獲得根據(jù)上文列出的步驟f)中的賦值的、所述感興趣基因的表達的最強增加。
在另一方面，本發(fā)明涉及上文描述的方法和/或核酸的用途。
在涉及體內(nèi)方案的一個實施方案中，本發(fā)明因此涉及一種方法的用途，該方法用于在用例如脫甲基藥物治療疾病時在體內(nèi)隨時間監(jiān)測例如脫甲基藥物誘導(dǎo)的感興趣的基因的表達的增加。因此，該方法可以用于監(jiān)測脫甲基藥物的療效。相應(yīng)地，本發(fā)明在另一實施方案中涉及一種方法的用途，該方法用于在通過rnai治療疾病時在體內(nèi)隨時間監(jiān)測rnai誘導(dǎo)的感興趣的基因的表達的減少。此處，該方法可以用于監(jiān)測rnai的療效。明顯地，在rnai的情況下，第一個檢測步驟應(yīng)該在光學(xué)成像方法中產(chǎn)生信號，因為否則就不能檢測到減少。因此，在第一個檢測步驟檢測不到報道多肽的情況下，可以優(yōu)化前面步驟的條件，從而發(fā)現(xiàn)使檢測成為可能的合適條件。只有那時才能施用治療化合物。
在本發(fā)明的核酸分子表達感興趣的基因的功能性多肽的情況下，所述感興趣基因的功能性多肽也可以用作治療劑。如上文概括的，在基因沉默的情況下，例如在癌中，發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因通常被沉默。這可以用脫甲基藥物或hdac抑制劑治療，并且通過本發(fā)明的方法監(jiān)測。當(dāng)使用所述方法時，可以導(dǎo)入感興趣的基因序列編碼的功能性腫瘤抑制多肽，并且施加額外的積極療效。
同樣，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可以用于調(diào)整脫甲基藥物或rnai的劑量，以便獲得感興趣的基因的表達的減少或增加。此外，該方法可以用于測試不同的甲基化試劑或rnai，以便分別地分開或與其它脫甲基藥物和rnai組合鑒定最有效的脫甲基藥物/rnai。這適用于體內(nèi)和體外狀況兩者。在體外方案，如上文提到的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，可以優(yōu)選使用本發(fā)明的方法，從而篩選對感興趣的基因表達的改變具有影響的化合物。因此，它可以用作用于測試可能作用于基因表達的藥物的快速篩選系統(tǒng)。
本發(fā)明的方法或核酸在一個實施方案中可以用于送遞脫甲基藥物和監(jiān)測所述藥物的送遞并且同時監(jiān)測所述藥物誘導(dǎo)的感興趣的基因的表達的增加。相應(yīng)地，本發(fā)明的方法或核酸在另一個實施方案中可以用于送遞rnai，監(jiān)測所述rnai的送遞并且同時監(jiān)測所述rnai誘導(dǎo)的感興趣的基因的表達的減少。這也適用于體內(nèi)和體外狀況兩者。
本發(fā)明的另外的優(yōu)選實施方案涉及：
1.非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與影響所述感興趣的基因的表達的化合物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給所述化合物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的改變賦值。
2.在體內(nèi)非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的根據(jù)1的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
a.甲基化的啟動子序列；
b.與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
c.與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與脫甲基藥物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給脫甲基藥物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的增加賦值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入人或動物體外的細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)甲基化的啟動子序列；
bb)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
cc)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與脫甲基藥物接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給脫甲基藥物誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的增加賦值。
4.在體內(nèi)非介入性監(jiān)測細(xì)胞中感興趣的基因的表達的根據(jù)1的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
aa)啟動子序列；
dd)與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因的非功能性多肽的序列；
ee)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與針對所述感興趣的基因定制的rnai接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給rnai誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的減少賦值。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法至少包括以下步驟：
a)將核酸分子導(dǎo)入人或動物體外的細(xì)胞中，所述核酸分子包含：
a.啟動子序列；
b.與其操作性連接的編碼所述感興趣的基因多肽的序列；
c.與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
b)通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
c)使所述細(xì)胞與針對所述感興趣的基因定制的rnai接觸；
d)在步驟c)后通過非介入性光學(xué)成像方法檢測所述細(xì)胞中的熒光報道多肽；
e)比較在步驟b)中檢測到的熒光報道多肽水平與在步驟d)中檢測到的熒光報道多肽水平；
f)基于步驟e)中的比較，給rnai誘導(dǎo)的所述感興趣的基因的表達的減少賦值。
6.根據(jù)1-5的任一項的方法，其中通過聲致穿孔、局部注射或脂質(zhì)體袋，或其混合輔助的轉(zhuǎn)染將所述核酸分子和/或所述rnai導(dǎo)入所述細(xì)胞，所述脂質(zhì)體袋攜帶用于正確靶向、鑒定和定位的抗宿主細(xì)胞抗原的抗體。
7.分離的核酸分子，所述核酸分子包含：
a)甲基化的啟動子序列；
b)與其操作性連接的編碼感興趣的基因多肽的序列；
c)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列；
其中包含b)和c)的編碼序列包含位于5’末端的單個起始密碼子和位于3’末端的單個終止密碼子。
8.根據(jù)7的核酸分子，其中感興趣的基因是腫瘤抑制基因或懷疑由于其沉默而導(dǎo)致疾病的基因。
9.分離的核酸分子，該核酸分子包含：
a)啟動子序列；
b)與其操作性連接的編碼感興趣的基因的非功能性多肽的序列；
c)與其操作性融合的編碼熒光報道多肽的序列。
其中包含b)和c)的編碼序列包含位于5’末端的單個起始密碼子和位于3’末端的單個終止密碼子。
10.根據(jù)9的核酸分子，其中編碼非功能性多肽的感興趣的基因序列包含完整的感興趣基因序列的一部分或含有至少一個插入、至少一個缺失、至少一個核苷酸交換或其混合物的完整的感興趣的基因序列，從而獲得感興趣的基因的非功能性多肽，但是，其中感興趣的基因序列不包含終止密碼子。
11.根據(jù)9和10的核酸分子，其中感興趣的基因是癌基因、原癌基因或懷疑由于其超量表達而導(dǎo)致疾病的基因。
12.根據(jù)1-6的任一項的方法用于在細(xì)胞與影響感興趣的基因的表達的化合物接觸時隨時間監(jiān)測所述細(xì)胞中所述感興趣的基因的表達，從而監(jiān)測所述化合物的效果的用途。
13.根據(jù)1-6的任一項的方法用于送遞影響細(xì)胞中感興趣的基因的表達的化合物、監(jiān)測所述化合物的送遞，以及同時監(jiān)測所述化合物誘導(dǎo)的對所述感興趣的基因的表達的影響的用途。
14.根據(jù)1-6的任一項的方法用于調(diào)整影響感興趣的基因的表達的化合物的劑量，從而獲得所述感興趣的基因的表達的進一步改變的用途。
15.根據(jù)2和3的方法用于測試不同的脫甲基藥物，從而分開或組合鑒定最有效的脫甲基藥物的用途。
16.根據(jù)4和5的方法用于測試針對一種感興趣的基因定制的不同rnai，從而分開或組合鑒定最有效的rnai的用途。
17.根據(jù)7-11的核酸分子用于在細(xì)胞與影響感興趣的基因的表達的化合物接觸時隨時間監(jiān)測所述細(xì)胞中所述感興趣的基因的表達，從而監(jiān)測所述化合物的效果的用途。
13.根據(jù)7-11的核酸分子用于送遞影響細(xì)胞中感興趣的基因的表達的化合物、監(jiān)測所述化合物的送遞，以及同時監(jiān)測所述化合物誘導(dǎo)的對所述感興趣的基因的表達的影響的用途。
14.根據(jù)7-11的核酸分子用于調(diào)整影響感興趣的基因的表達的化合物的劑量，從而獲得所述感興趣的基因的表達的進一步改變的用途。
15.根據(jù)7-11的核酸分子用于測試不同的脫甲基藥物，從而分開或組合鑒定最有效的脫甲基藥物的用途。
16.根據(jù)7-11的核酸分子用于測試針對一種感興趣的基因定制的不同rnai，從而分開或組合鑒定最有效的rnai的用途。
應(yīng)該理解實施例和附圖不解釋為限制性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明確預(yù)見本文展示的原理的其它修飾。
實施例
當(dāng)將針對her-2neu(已知在乳腺癌中超量表達的基因)定制的rnai轉(zhuǎn)染到乳腺癌組織中時，非介入性監(jiān)測所述組織中her-2neu表達的方法的方案
圖1描述其步驟的示意圖。
步驟1：制備dna構(gòu)建體。所述構(gòu)建體包含已知在乳腺癌組織中有活性的人啟動子。編碼區(qū)與所述啟動子操作性連接。該編碼區(qū)包含與熒光蛋白(如gfp)的基因融合的her-2neu基因。例如通過移碼突變修飾了her-2neu序列，使得表達her-2neu的非功能性多肽。在3’末端，熒光蛋白基因的序列與her-2neu序列融合，使得得到的蛋白轉(zhuǎn)錄為一個融合蛋白，并且得到的熒光多肽是功能性的。這表示在本實施例中，在her-2neu序列中導(dǎo)入的移碼突變得到了在熒光蛋白的編碼序列起始處導(dǎo)入的另外的移碼突變的補償，從而編碼功能性的熒光蛋白，如gfp。
步驟2：然后，例如，通過注射攜帶構(gòu)建體并且優(yōu)選為了靶向的手段而攜帶抗乳腺癌細(xì)胞抗原的抗體的脂質(zhì)體袋，將上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到乳腺癌組織中。應(yīng)該注意，該靶向步驟對于下面的顯現(xiàn)步驟可能是有益的，因為僅僅檢測癌組織。但是，這也可以在以下情況下實現(xiàn)：上文描述的啟動子僅僅在乳腺癌細(xì)胞中有功能，這樣，編碼區(qū)(因此，熒光蛋白)僅僅在這些細(xì)胞中表達。在任一情況下，融合基因在包含her-2neu的非功能性結(jié)構(gòu)域和功能性熒光蛋白結(jié)構(gòu)域如gfp的癌細(xì)胞中表達。
步驟3：顯現(xiàn)熒光蛋白結(jié)構(gòu)域，由此乳腺癌組織發(fā)亮。這可以通過使用在特定波長激發(fā)熒光蛋白的光學(xué)成像裝置，然后檢測在相應(yīng)波長發(fā)射的光來完成?？梢允褂米贤夤鈦砑ぐl(fā)gfp，然后檢測發(fā)射的綠色的光。優(yōu)選地，可以使用紅外光激發(fā)的化合物和/或諸如亮遠(yuǎn)紅熒光蛋白的化合物[例如公開于shcherbod.etal.，naturemethods4，741-746(2007)]。
步驟4：然后將針對her-2neu定制的雙鏈rnai轉(zhuǎn)染到乳腺癌組織中。這也可以通過注射攜帶rnai構(gòu)建體并且優(yōu)選為了靶向的手段而攜帶抗乳腺癌細(xì)胞抗原的抗體的脂質(zhì)體袋來完成。
步驟5：現(xiàn)在阻斷步驟2中導(dǎo)入的融合基因的表達和內(nèi)源her-2neu基因的表達。這是通過選擇性阻斷從相應(yīng)mrna的翻譯的rnai實現(xiàn)的。由于her-2neu基因與編碼熒光蛋白的序列的融合，熒光蛋白的表達也被阻斷。因此，在rnai的轉(zhuǎn)染后，完全沒有熒光蛋白或僅僅小量熒光蛋白存在于乳腺癌組織中。
步驟6：再次，在相應(yīng)組織中顯現(xiàn)熒光蛋白結(jié)構(gòu)域。如上文闡述的，可以用紫外光激發(fā)gfp，然后檢測發(fā)出的綠色光。優(yōu)選地，也可以使用由紅外光激發(fā)的化合物。在導(dǎo)入的rnai導(dǎo)致從融合基因轉(zhuǎn)錄的mrna的完全翻譯阻斷的情況下，不能檢測到熒光蛋白。這樣，不再能夠顯現(xiàn)乳腺癌組織。在減少的情況下，與步驟3檢測到的信號相比，信號更弱?？傮w上，這強烈表明內(nèi)源her-2neu表達也完全被阻斷，因此，實現(xiàn)了腫瘤抑制。
概言之，以非介入的方式體內(nèi)監(jiān)測了rnai在乳腺癌組織中的療效。
序列表
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<120>使用感興趣的基因-報道物融合蛋白和光學(xué)成像的治療送遞和監(jiān)測
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<223>由基因serpinb5編碼的多肽
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