專利名稱：一種用于dna與蛋白質(zhì)相互作用研究的新技術(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，特別是指在DNA結(jié)合蛋白與相關(guān)生物探針相互作用研究實驗技術(shù)創(chuàng)新。在細胞的生命活動過程中，DNA的復(fù)制與重組、RNA的轉(zhuǎn)錄與修飾，以及病毒的感染與增殖等等，都 是涉及到特定的DNA區(qū)段與特殊蛋白質(zhì)結(jié)合因子之間的相互作用。因此，長期以來人們就一直關(guān)注DNA結(jié) 合蛋白的研究。尤其是在重組DNA技術(shù)發(fā)展以來，已經(jīng)相繼分離到了大量具有生物學(xué)意義的基因，在這一 背景支撐下，人們開始探索揭示外環(huán)境因子及發(fā)育信號是如何影響或調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性這一類課題。凝 膠阻滯試驗(gel retardation assay)是用于研究DNA或RNA與蛋白質(zhì)相互作用的重要實驗技術(shù)之一。在 凝膠實驗中，傳統(tǒng)的方法是用放射性同位素或其他生物素標記待檢測的DNA片段(又稱探針DNA， probe) 然后與細胞蛋白質(zhì)提取物一道溫育，于是便形成了 DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物。將其移入非變性的聚丙酰胺凝膠中， 控制蛋白質(zhì)與探針保持結(jié)合狀態(tài)，電泳。最后借助放射性自顯影技術(shù)(或其它適當(dāng)技術(shù))顯現(xiàn)DNA條帶位 置。如果細胞蛋白質(zhì)中不存在與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)，那么，所有DNA條帶都將集中出現(xiàn)在凝膠底部；反之， 將會形成DM-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于凝膠阻滯的緣故，其特有的的探針-蛋白質(zhì)復(fù)合物條帶就將滯后出現(xiàn)在 較靠后位置。凝膠阻滯試驗不僅可以用來鑒定在特殊類型細胞提取物中是否存在著能夠同某一特定咖A片 段結(jié)合的蛋白質(zhì)分子(比如特異的轉(zhuǎn)錄因子等)，用來研究此種結(jié)合作用的DNA序列的特異性，而且還可 以用于捕捉在特定條件干預(yù)下，雙方結(jié)合的變化及外界干預(yù)對其變化的影響等生物信息。不過，傳統(tǒng)的試驗方案中常常因為DNA探針需要標記而使實驗過程變得比較繁瑣，同時，也存在某種 程度的放射性核素污染和傷害。本發(fā)明提出了一種新技術(shù)方案，其目地是要克服傳統(tǒng)方法的上述缺陷。為了彌補傳統(tǒng)技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提出了如下技術(shù)方案細胞蛋白質(zhì)提取物先和相應(yīng)抗體分子結(jié) 合為復(fù)合物，之后再與裸探針(null probe)結(jié)合,形成抗體-蛋白-裸探針三聯(lián)復(fù)合物，再后將其移入非 變性的聚丙酰胺凝膠中，電泳，最后應(yīng)用ECL法于暗室中發(fā)光檢測。本發(fā)明方案雖然沒有使用放射性核素或其它生物素標記探針，卻同樣捕捉到研究目地特異蛋白結(jié)合情 況的必要生物信息，達到了實驗?zāi)康摹Ｓ捎诳贵w分子的加入使得蛋白質(zhì)-探針二聯(lián)復(fù)合物的分子量加大， 電泳后，在非變性的聚丙酰胺中形成的條帶更加滯后，從而更加突出的顯現(xiàn)了相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合的特異性。 這種方法同樣可以用于鑒定未知蛋白，如加入蛋白無明顯滯后的條帶出現(xiàn)，說明該蛋白與抗體無關(guān)，反之, 亦然。本發(fā)明方法對疾病診斷和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究有重要實際意義。本發(fā)明技術(shù)方案是通過如下技術(shù)操作實現(xiàn)的。 1.試劑配制(1) Tris-SDS-甘氨酸電泳緩沖液背景技術(shù)發(fā)明內(nèi)容3.03 g 1 g18.77 gTris base 5.8 gSDS0.37 g甘氨酸 2.98 g甲醇200 ml先用ddftO溶解甘氨酸，Tris base和SDS，然后加入200nd甲醇，最后定容至1000ml, (3) 5 XBanding Buffer20%甘油5mMMgCl22.5 mMEDTA2.5 mMDTT250.0 mMNaCl50 mMTris-HCL0.25vg/vlPolyDI-DC(4) TBS配制l咖l/LTris-HCLph7.5 10ml NaCL 8.8g 用ddH20定容至1000ml,配TBST時，每100ml TBS加入0.24ml的20%的Tween20混勻后4。C保存c(5) Strippingbufer二巰基乙醇 700 vlTris (PH6.8) 12.5 ml10% SDS 20ml 去離子水 66.8ml 總體積100ml洗膜過程50t:搖床30min。 PBS洗5min。在用ddFfeO洗膜5min。 洗膜前注意要將用過的膜于TBST中浸泡至少30min。搖床速度要溫柔。2.電泳 (1)灌膠10%分離膠ddH20 4.0 ml30%Acr-Bis 3.3mlpH 8.8 Tris-HCL 2.5 ml10% SDS 0.1ml10%AP 0.1mlTEMED 0.01ml 室溫下聚合50min或4t:過夜，膠聚合好后在電泳緩沖夜(Tris—SDS—甘氨酸)條件下以200V電壓 預(yù)電泳30min。(2)上樣體系15 vl核蛋白:DNA-lO:l5X結(jié)合緩沖液 3vl核蛋白 40 vgDNA 4 vgPolyDI-DC lvlddH20 Xvl于37度條件下?lián)嵊?0—30min。孵育后加入3 vl的SDS上樣緩沖液，200v條件下跑電泳。待目的蛋 白跑至膠的2/3時停止電泳。3.轉(zhuǎn)膜及抗體結(jié)合3.1用轉(zhuǎn)移緩沖液(Tris—SDS—甘氨酸-甲醇)轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜前將膠。濾紙和準備好的膜(都要剪成同 等大小)于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5min。3.2轉(zhuǎn)膜條件為100mA ， 1.5h。轉(zhuǎn)膜產(chǎn)熱，注意在冰室中進行效果更加。 3.3 5%的脫脂奶粉封閉過夜，于4t中。3.4—定比例稀釋一抗，室溫下孵育lh用TBST洗3次，每次5min^最后用TBS洗l次，時間5min。 然后染適當(dāng)比例稀釋的二抗，室溫孵育50min，用TBST洗3次，每次5min^最后用TBS洗1次，時間5min。 然后采用ECL法于暗室內(nèi)發(fā)光檢測。如果覺得背景高可以用Stripping buffer洗膜，重新封閉染抗體，效果更加。實施例l，下面介紹的是在一個經(jīng)過放射線千預(yù)后，以P53的5'端非翻譯區(qū)的DNA片段和Nucleolin 核蛋白的結(jié)合情況研究，使用本發(fā)明之技術(shù)方案，達到了預(yù)期的實驗?zāi)康亍?. 材料與方法 1.1儀器和試劑l丄l細胞株MCF7人乳腺癌細胞株由基礎(chǔ)免疫實驗室獲得。 l丄2照射儀器國產(chǎn)X.S.S.205(FZ)型固定式X射線深部治療機。 l丄3試劑配制(1) Tris-SDS-甘氨酸電泳緩沖液(2) Tris-SDS-甘氨酸一甲醇轉(zhuǎn)移緩沖液(3) 5XBanding Buffer (Glycerol, MgCl2, EDTA， DTT , NaCl, Tris-HCL， PolyDI-DC) 1.2實驗部分1.2.1目的DNA片段的獲取根據(jù)p53 tumor suppressormRNA序列設(shè)計p53基因的PCR引物(由聯(lián)星生物公司合成IOD,OPC級。) 上游引物Sense:5 ' -AAGGATCCTCTAGAGCCACCGTCCAG-3 '下游引物Antisense:5 ' GGGAATTCCTCCTCCATGGCAGTGAC-3'利用PCR擴增目的片段。連入PCDNA3.1載體后拿去測序。 測序正確后轉(zhuǎn)化、大提質(zhì)粒。然后酶切電泳。切膠回收目的片段，定量備用。1.2.2胞核蛋白的提取(1) 4Gy X射線照射MCF7細胞后，分別于2h、 4h、 8h、 16h、 24h、 48h。收取細胞，用凱基胞漿胞 核蛋白提取試劑盒提取胞核蛋白。(2) 不同劑量X射線照射MCF7細胞4小時后，收取細胞，用凱基胞漿胞核蛋白提取試劑盒提取胞核蛋白。(3) 考馬斯亮蘭法蛋白定量。蛋白保存一70'C備用。 1.2.4電泳灌膠10%分離膠(ddH20 4ml, 30%Acr-Bis3.3ml， pH 8.8 Tris-HCL 2.5 ml, 10% SDS 0.1ml, 10 %AP0.1ml， TEMED0.01ml)室溫下聚合，時間盡量長。膠聚合好后在電泳緩沖液(Tris—SDS—甘氨酸) 條件下以200V電壓預(yù)電泳20—30min。上樣體系15 vl:核蛋白:DNA-10:1(5X結(jié)合緩沖液3vl，核蛋白 40vg，蛋白4vg， Poly DI-DC 1 vl, ddH20 Xvl)。于37度條件下?lián)嵊?0—30min。孵育后加入適量上樣 緩沖液，200v條件下跑電泳。待目的蛋白跑至膠的2/3時停止電泳。1.2.5轉(zhuǎn)膜及抗體結(jié)合用轉(zhuǎn)移緩沖液(Tris—SDS—甘氨酸一甲醇)轉(zhuǎn)膜，條件為100mA ， 1.5h。 5%的脫脂奶粉封閉過夜， 一定比例稀釋一抗和二抗，然后采用ECL法于暗室內(nèi)發(fā)光檢測。2. 實驗結(jié)果2.1 X射線照射MCF7細胞后Nucleolin蛋白的DNA結(jié)合活性的時程變化采用蛋白滯后實驗方法檢測了 4Gy X射線照射MCF7細胞后，核內(nèi)nucleolin蛋白同P53基因5'端非 翻譯區(qū)DNA片段結(jié)合活性的時程變化，附圖
l.為強度4 Gy的X射線照射MCF7細胞后Nucleolin蛋白的 DNA結(jié)合活性的時程變化電泳結(jié)果示意圖，附圖2.為強度4 Gy的X射線照射MCF7細胞后Nucleolin蛋 白的DNA結(jié)合活性的時程變化結(jié)果的線形示意圖，從附圖l.、表l和附圖2.可見4GyX射線照射后和假 照組(附圖l.中C組)相比2h, 4h， 8h和16h結(jié)合活性下降，4h結(jié)合活性最弱提示nucleolin對p53的控制減小。表1. 4Gy X射線照射MCF7細胞后Nucleolin蛋白的DNA結(jié)合活性的時程變化分組假照射組248162448絲A 口 未結(jié)合 結(jié)合/未結(jié)合2.53 0.76 3.332.47 0.85 2.912.59 0.91 2.851.07 0.81 1.321.89 0.93 2.031.76 0.97 1.811.98 1.01 1.962.2照射MCF7細胞后Nucleolin蛋白的DNA結(jié)合活性的量效變化采用蛋白滯后實驗方法檢測了不同劑量X射線照射MCF7細胞4h后核內(nèi)nucleolin蛋白同p53基因5' 端非翻譯區(qū)DNA片段結(jié)合活性的量效變化,附圖3.為時間4h不同強度X射線照射MCF7細胞后對Nucleolin 蛋白的DNA結(jié)合活性的量效變化的電泳結(jié)果示意圖，附圖4.為時間4h不同強度X射線照射MCF7細胞 后對Nucleolin蛋白的DNA結(jié)合活性的量效變化的條形示意圖，從附圖3.、表2.和附圖4可見4h量效實 驗顯示不同劑量照射后和假照組相比隨著劑量增加而結(jié)合活性減弱。提示隨著劑量增加nucleolin對p53 的控制減弱。表2.不同劑量X-射線照射MCF7細胞4小時后Nucleolin蛋白的DNA結(jié)合活性的量效變化分組假照射組0.5124結(jié)合 *娃厶 木5q 口 結(jié)合/未結(jié)合2.38 0.68 3.502.26 0.76 2.972.41 0.85 2.842.25 0.73 3.082.45 0.73 2.95(全文止)
權(quán)利要求
1. 一種用于生物醫(yī)學(xué)檢驗、診斷、研究的技術(shù)方案，它的技術(shù)特征是先將細胞蛋白質(zhì)提取物與相應(yīng)抗體分子結(jié)合為復(fù)合物，之后再與裸探針(null probe)結(jié)合,形成抗體-蛋白-裸探針三聯(lián)復(fù)合物，將其移 入非變性的聚丙酰胺凝膠中，電泳，最后應(yīng)用ECL法于暗室中發(fā)光檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗、診斷和研究的新技術(shù)方案，其技術(shù)特征是將細胞蛋白質(zhì)提取物先于相應(yīng)抗體分子結(jié)合為復(fù)合物，之后再與裸探針(null probe)結(jié)合，形成抗體-蛋白-裸探針三聯(lián)復(fù)合物，同樣將其移入非變性的聚丙酰胺凝膠中，電泳，最后應(yīng)用ECL法于暗室中發(fā)光檢測。與傳統(tǒng)方法比較，本技術(shù)操作簡便、可靠、無放射性核素污染。
文檔編號G01N33/68GK101144821SQ20071005555
公開日2008年3月19日 申請日期2007年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月23日
發(fā)明者劉曉東, 李文興, 趙銀龍 申請人:吉林大學(xué)