專利名稱：一種檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析及傳感領(lǐng)域，特別涉及一種基于水溶性共軛聚合物和核酸外切酶III檢測(cè)脫氧核糖核酸(DNA)結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白是生物蛋白組中一類能夠與序列特異性的脫氧核糖核酸發(fā)生結(jié)合并且產(chǎn)生重要功能的蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)在基因調(diào)控、基因重組、基因修復(fù)等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，目前已成為功能基因組和蛋白質(zhì)組研究的重要對(duì)象；許多疾病都與細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的異常相關(guān)。脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的檢測(cè)分析是研究其功能的主要手段。因此，有關(guān)檢測(cè)分析脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的研究一直受到科學(xué)界的高度重視。目前用于研究脫氧核糖核酸與蛋白質(zhì)相互作用的方法有很多，如凝膠遷移率分析法、印跡法等，雖然這些常規(guī)方法在脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的研究中發(fā)揮了重大的作用，但是這些技術(shù)工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且操作過(guò)程中容易造成放射性物質(zhì)污染。近年來(lái)，科學(xué)家們陸續(xù)報(bào)道了一些基于熒光染料的檢測(cè)方法，如分子信標(biāo)(Boon，Ε. Μ. ；Salas, J. Ε.； Barton, J. K. , Nat. Biotech. 2002, 20 (3) :282_286.)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Xu，X. ；Zhao, Ζ.； Qin, L. ；Wei, W. ；Levine, J. Ε. ；Mirkin C. Α.，Anal. Chem. 2008,80(14) :5616_5621·)等； 以及基于納米金的比色檢測(cè)(Ou，L. J. Jin, P. Y. ；Chu, X. Jiang, J. H. ；Yu, R. Q.，Anal. Chem. 2010，82，(14)，6015-24.)等，這些方法有效避免了放射性物質(zhì)的污染，但是由于這些熒光探針需要雙標(biāo)記，給實(shí)驗(yàn)造成復(fù)雜化、分析效率低等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有的脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白檢測(cè)方法存在的不足，提供一種核酸外切酶III輔助的，共軛聚合物熒光信號(hào)放大的脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白檢測(cè)方法，其具有較高的特異性和高靈敏度。有望在臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)中針對(duì)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的藥物篩選提供一種新的技術(shù)。技術(shù)方案本發(fā)明為一種基于水溶性共軛聚合物和核酸外切酶III檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法，運(yùn)用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白表達(dá)和活化水平的檢測(cè)分析，該技術(shù)的核心是利用水溶性共軛聚合物與熒光素標(biāo)記的單、雙鏈核酸之間不同的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率(Huang，Y. Q. ；Liu, X. F. ；Fan, Q. L. ；Wang，L. ；Song, S. ；Wang, L. H. ；Fan, C. ；Huang, W. , Biosensors and Bioelectronics 2009,24, (10), 2973-2978.)，以及脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白在核酸特定位點(diǎn)處結(jié)合使其不被核酸外切酶III 降解的技術(shù)巧妙地結(jié)合在一起，從而達(dá)到對(duì)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白表達(dá)和活化水平的高效分析。本發(fā)明檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法基于水溶性共軛聚合物和核酸
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外切酶III，包括以下步驟a.制備可特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的雙鏈脫氧核糖核酸熒光探針；b.將雙鏈脫氧核糖核酸熒光探針與脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白進(jìn)行結(jié)合；c.用核酸外切酶III對(duì)上述復(fù)合物進(jìn)行酶切；d.在上述的反應(yīng)體系中加入水溶性共軛聚合物進(jìn)行熒光檢測(cè)。步驟a制備的雙鏈脫氧核糖核酸熒光探針為兩條堿基序列反向互補(bǔ)的單鏈核酸分子A和B復(fù)性后形成的雙鏈核酸分子。所述的核酸分子A和B復(fù)性后形成的雙鏈核酸分子，含有脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白可識(shí)別并與之結(jié)合的核苷酸序列。所述的核酸分子A的3'端含有5個(gè)突出的核酸堿基，以便核酸外切酶III作用于雙鏈脫氧核糖核酸探針時(shí)，能從B的3'端開(kāi)始降解。所述的核酸分子B為5'端含有熒光素標(biāo)記的核苷酸。所述的步驟b將標(biāo)記的雙鏈脫氧核糖核酸探針與脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白進(jìn)行結(jié)合，是脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白與雙鏈脫氧核糖核酸探針間發(fā)生序列特異性識(shí)別并結(jié)合的過(guò)程。所述的步驟c用核酸外切酶III對(duì)上述復(fù)合物進(jìn)行酶切，是核酸外切酶III對(duì)核酸探針?lè)肿訌碾p鏈脫氧核糖核酸的3'發(fā)生降解反應(yīng)，逐個(gè)釋放單核苷酸的過(guò)程。所述的步驟d中的水溶性共軛聚合物的發(fā)射光譜與熒光素的吸收光譜有較好的重疊，以便發(fā)生高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移；熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率用529nm和450nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值來(lái)表示，即I529nm/I 450nm°所述的熒光發(fā)射強(qiáng)度，用島津RF-5301熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為 404nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為410_650nm。技術(shù)效果本發(fā)明所述的熒光檢測(cè)方法，無(wú)需大型儀器，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的三個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟即可完成對(duì)核因子NF-K B蛋白的分析檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí)間，并且該方法具有較高的選擇性和靈敏度，能在比較復(fù)雜的混合蛋白體系中靈敏的檢測(cè)出目標(biāo)蛋白，具有較高的分析效率。


圖1是基于水溶性共軛聚合物和核酸外切酶III檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的原理示意圖。圖2為基于核酸外切酶III和水溶性共軛聚合物檢測(cè)蛋白NF- κ B的熒光光譜圖。 a為共軛聚合物的熒光光譜圖；b為空白對(duì)照的熒光光譜圖；(為含有靶蛋白的熒光光譜圖。圖3是基于核酸外切酶III和水溶性共軛聚合物的熒光檢測(cè)方法對(duì)不同濃度的 NF-k B蛋白進(jìn)行檢測(cè)的熒光光譜圖。NF-K B濃度范圍為0 115nM。注解小圖為不同濃度蛋白對(duì)應(yīng)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率(I529mZI45tol)關(guān)系曲線圖。
具體實(shí)施例方式運(yùn)用該技術(shù)檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白時(shí)，首先要依據(jù)待檢測(cè)的脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的脫氧核糖核酸結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列，以及本技術(shù)運(yùn)用的核酸外切酶III保護(hù)分析對(duì)核酸探針結(jié)構(gòu)的要求，設(shè)計(jì)含有蛋白結(jié)合位點(diǎn)的標(biāo)記核酸探針，對(duì)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白進(jìn)行檢測(cè)時(shí)。若溶液中存在脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白，標(biāo)記的核酸探針就會(huì)與相應(yīng)的脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白發(fā)生序列特異性的結(jié)合反應(yīng)，形成的“核酸探針/脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白”復(fù)合物為核酸探針提供了空間保護(hù)，在酸外切酶III酶切時(shí)，核酸酶由于空間阻礙而不能降解核酸探針，因此在加入水溶性共軛聚合物時(shí)，會(huì)由于較強(qiáng)的靜電作用而與共軛聚合物結(jié)合，拉近熒光基團(tuán)與共軛聚合物之間的距離，使其發(fā)生高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移；當(dāng)溶液中不存在脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白時(shí)，裸露的核酸探針會(huì)被核酸外切酶III酶切，從而使熒光基團(tuán)游離出來(lái)，無(wú)法與共軛聚合物發(fā)生結(jié)合，因此二者之間的距離較遠(yuǎn)，在熒光檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)不到熒光共振能量轉(zhuǎn)移。運(yùn)用該技術(shù)包括如下四個(gè)步驟A.制備熒光標(biāo)記的雙鏈核酸探針；B.雙鏈核酸探針與脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白結(jié)合；C.核酸外切酶III酶切；D.對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行熒光檢測(cè)；其中步驟A制備熒光標(biāo)記的核酸探針是很重要的一步，為實(shí)現(xiàn)對(duì)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的檢測(cè)分析，核酸探針應(yīng)具備下列結(jié)構(gòu)a)核酸探針是由兩條堿基序列反向互補(bǔ)的單鏈核酸分子A和B復(fù)性后形成的雙鏈核酸分子；b)核酸分子A和B復(fù)性后形成的雙鏈核酸分子，含有脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白可識(shí)別并與之結(jié)合的核苷酸序列；c)核酸分子B為5'端標(biāo)記有熒光素的核苷酸；核酸分子A為3'端比5'端突出 5個(gè)核酸粘性末端，核酸分子B為3'端與5'端平齊的平末端，核酸探針?lè)N類可以表現(xiàn)為多種形式，但是需要在核酸探針中設(shè)立一個(gè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，因此，在設(shè)計(jì)寡核酸探針時(shí)要加入脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白(如核因子)的結(jié)合位點(diǎn)。本技術(shù)中制備的核酸探針為包含核因子NF-K B(p50)結(jié)合序列 "-^^===,3的脫氧核糖核酸。有些脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白需要在其結(jié)合序列外圍設(shè)計(jì)少量的側(cè)翼序列，才能在結(jié)合液中與相應(yīng)的結(jié)合蛋白結(jié)合，并且不同的脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白對(duì)側(cè)翼序列長(zhǎng)度的要求也不相同，在探針設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)注意在蛋白結(jié)合序列側(cè)翼添加有效長(zhǎng)度的側(cè)翼序列。步驟B核酸探針與脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白結(jié)合，是脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白與雙鏈探針間發(fā)生序列特異性識(shí)別并結(jié)合的過(guò)程。反應(yīng)過(guò)程的結(jié)合液為10% (ν/ν)甘油，0.5% (m/v)牛血清蛋白，0. 5mM 二硫蘇糖醇，IOmM Tris-HCl(pH 7. 5)。步驟C核酸外切酶III酶切，是核酸外切酶III對(duì)核酸探針?lè)肿訌碾p鏈脫氧核糖核酸的3'端發(fā)生降解反應(yīng)，逐個(gè)釋放單核苷酸的過(guò)程，在酶切完全后需加入20mM的乙二胺四乙酸溶液終止核酸外切酶III的酶切，酶切反應(yīng)的緩沖液為66mM Tris_HCl，0. 66mM MgCl2 (pH 8. 0)，37 °C 反應(yīng) 5-10 分鐘。步驟D對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行熒光檢測(cè)，水溶性的共軛聚合物對(duì)熒光信號(hào)的放大是一個(gè)關(guān)鍵，水溶性陽(yáng)離子型共軛聚合物的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，可根據(jù)文獻(xiàn)(Huang，Y. Q. ；Fan,
5Q. L. ；Lu, Χ. M. ；Fang, C. ；Liu, S. J. ；Yu-ffen, L. H. ；Wang, L. H. ；Huang, W. , J. Polym. Sci. Pol. Chem. 2006，44，(19)，5778-5794.)合成。該共軛聚合物與脫氧核糖核酸之間有較強(qiáng)的結(jié)合能力、熒光量子產(chǎn)率高、能與標(biāo)記在脫氧核糖核酸末端的熒光素之間發(fā)生高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而使熒光素的信號(hào)得到顯著的增強(qiáng)。本發(fā)明利用水溶性共軛聚合物優(yōu)越的熒光性能，以熒光素標(biāo)記雙鏈核酸為探針，結(jié)合核酸外切酶III的酶切作用，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記的熒光素與水溶性共軛聚合物之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率實(shí)現(xiàn)對(duì)體系中脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的檢測(cè)。以下僅以制備熒光素標(biāo)記的NF-K B核酸探針檢測(cè)核因子蛋白NF-K B的實(shí)驗(yàn)為例，說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)的具體實(shí)施方式
。a)熒光素標(biāo)記核酸探針的制備NF-κ B核酸探針A 5' -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCTTTTT-3‘B 3' -TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-FAM-5‘其中_為NF- κ B結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)AM為熒光素。制備NF- κ B核酸探針時(shí)，將兩個(gè)寡核苷酸鏈A和B溶液等摩爾在雜交緩沖液 (IOmM Tris-HCiaOOmM NaCl，pH 8.0)中混合，95°C保溫10分鐘，緩慢冷卻至室溫。然后用雜交液將探針溶液稀釋至濃度為10yM，4°C保存?zhèn)溆?。b)標(biāo)記的核酸探針與核因子NF- κ B結(jié)合將核因子NF-K B蛋白加入到脫氧核糖核酸結(jié)合緩沖液中，37°C孵育10分鐘，再加入10 μ M核酸探針，37 °C繼續(xù)孵育20-30分鐘。c)核酸外切酶III酶切將IOX 酶切反應(yīng)液(660mM Tris_HCl，6. 6mM MgCl2, pH 8. 0)和 20U/μ 1 核酸外切酶III加入反應(yīng)體系中，37°C孵育5-10分鐘。d)熒光檢測(cè)所用的儀器為熒光分光度計(jì)(RF-5301，日本)。熒光光譜測(cè)量條件氙燈激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)為404nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍410 650nm ；用3mL石英比色皿進(jìn)行測(cè)量，樣品體積 2mL ；室溫。酶切反應(yīng)結(jié)束后，加入0. 4M的乙二胺四乙酸溶液終止核酸外切酶III的酶切反應(yīng)，然后將其加入到含有水溶性共軛聚合物(濃度為2. 25X I(T7M)的檢測(cè)緩沖液(IOmM Tris-HCiaOOmM NaCl,pH 7.5)中檢測(cè)熒光。這時(shí)只有連接在脫氧核糖核酸探針末端的熒光素才能與水溶性共軛聚合物發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，這是由于長(zhǎng)鏈脫氧核糖核酸與聚合物形成靜電復(fù)合物使脫氧核糖核酸上的熒光素距離很近而發(fā)生有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。 若熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率(I 529raZI45tJ較高，則表明待測(cè)溶液中存在NF-kB蛋白，若能量轉(zhuǎn)移效率很低(I529mZI45tllJ，則表明待測(cè)溶液中不含NF- κ B蛋白。實(shí)施例1檢測(cè)核因子NF- κ B蛋白。檢測(cè)1 將核因子NF-KB蛋白加入脫氧核糖核酸結(jié)合緩沖液，37°C孵育10分鐘， 再加入10 μ M雙鏈核酸探針，37°C繼續(xù)孵育20-30分鐘。再將IOX酶切反應(yīng)液和20U/ μ L 核酸外切酶III加入反應(yīng)體系中，37°C孵育5-10分鐘。酶切反應(yīng)結(jié)束后，加入0. 4M的乙二胺四乙酸溶液終止核酸外切酶III的酶切反應(yīng)，然后加入到含有水溶性共軛聚合物的檢測(cè)緩沖液中，檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為404nm，發(fā)射波長(zhǎng)為410 650nm。由于帶有標(biāo)記的核酸探針會(huì)與核因子蛋白NF- κ B發(fā)生序列特異性的結(jié)合反應(yīng)，形成的“核酸探針/脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白”復(fù)合物為核酸探針提供了空間保護(hù)，核酸外切酶III不能降解核酸探針，可以發(fā)生高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。同時(shí)，做如下試驗(yàn)作為對(duì)比。檢測(cè)2 用等體積的脫氧核糖核酸結(jié)合緩沖液代替核因子NF-K B蛋白進(jìn)行試驗(yàn)， 作為空白對(duì)照，其它條件與檢測(cè)1中相同。檢測(cè)3 用等體積的相同濃度的其他蛋白質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，作為陰性對(duì)照，其他條件與檢測(cè)1中相同。結(jié)果空白對(duì)照(即檢測(cè)2)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率非常低(I529mZI45tol = 0. 4)。其他蛋白(即檢測(cè)3)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率遠(yuǎn)低于NF- κ B的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率(I529mZI45Clnm = 2. 2)。可見(jiàn)本發(fā)明對(duì)核因子NF-K B的檢測(cè)具有高度的特異性。實(shí)施例2檢測(cè)不同濃度的核因子蛋白NF- κ B。對(duì)不同濃度的核因子NF-K B蛋白進(jìn)行檢測(cè)，其它條件與實(shí)施例1中的檢測(cè)1相同。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法，其特征在于該方法基于水溶性共軛聚合物和核酸外切酶III，包括以下步驟a.制備可特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的雙鏈脫氧核糖核酸熒光探針；b.將雙鏈脫氧核糖核酸熒光探針與脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白進(jìn)行結(jié)合；c.用核酸外切酶III對(duì)上述復(fù)合物進(jìn)行酶切；d.在上述的反應(yīng)體系中加入水溶性共軛聚合物進(jìn)行熒光檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法，其特征是步驟 a制備的雙鏈脫氧核糖核酸熒光探針為兩條堿基序列反向互補(bǔ)的單鏈核酸分子A和B復(fù)性后形成的雙鏈核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法，其特征在于所述的核酸分子A和B復(fù)性后形成的雙鏈核酸分子，含有脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白可識(shí)別并與之結(jié)合的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法，其特征在于所述的核酸分子A的3'端含有5個(gè)突出的核酸堿基，以便核酸外切酶III作用于雙鏈脫氧核糖核酸探針時(shí)，能從B的3'端開(kāi)始降解。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法，其特征在于所述的核酸分子B為5'端含有熒光素標(biāo)記的核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟b將標(biāo)記的雙鏈脫氧核糖核酸探針與脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白進(jìn)行結(jié)合，是脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白與雙鏈脫氧核糖核酸探針間發(fā)生序列特異性識(shí)別并結(jié)合的過(guò)程。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟c用核酸外切酶III對(duì)上述復(fù)合物進(jìn)行酶切，是核酸外切酶III對(duì)核酸探針?lè)肿訌碾p鏈脫氧核糖核酸的3'發(fā)生降解反應(yīng)，逐個(gè)釋放單核苷酸的過(guò)程。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟d中的水溶性共軛聚合物的發(fā)射光譜與熒光素的吸收光譜有較好的重疊，以便發(fā)生高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移；熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率用529nm和450nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值來(lái)表示，即 I529nm/l450nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法，其特征是所述的熒光發(fā)射強(qiáng)度，用島津RF-5301熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為404nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為410-650nm。
全文摘要
本發(fā)明的檢測(cè)脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白的熒光檢測(cè)方法以熒光素標(biāo)記的含有蛋白結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈核酸為探針，該探針結(jié)合靶蛋白后形成的“核酸探針/脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白”復(fù)合物為核酸探針提供了空間保護(hù)，可以使其不被核酸酶水解，從而可以與陽(yáng)離子的水溶性共軛聚合物之間通過(guò)靜電反應(yīng)進(jìn)行結(jié)合，使熒光素與聚合物之間有較近的距離可以發(fā)生高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。該方法基于水溶性共軛聚合物和核酸外切酶Ⅲ，包括以下步驟a.制備可特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的雙鏈脫氧核糖核酸熒光探針；b.將雙鏈脫氧核糖核酸熒光探針與脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白進(jìn)行結(jié)合；c.用核酸外切酶Ⅲ對(duì)上述復(fù)合物進(jìn)行酶切；d.在上述的反應(yīng)體系中加入水溶性共軛聚合物進(jìn)行熒光檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102384978SQ20111025286
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者劉興奮, 歐陽(yáng)斕, 黃維, 黃艷琴 申請(qǐng)人:南京郵電大學(xué)