本發(fā)明涉及多糖類高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可注射水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

水凝膠材料是一種以物理或化學(xué)方式交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，親水殘基與水分子結(jié)合，將水分子連接在網(wǎng)狀內(nèi)部，而疏水殘基遇水膨脹的交聯(lián)聚合物，其具有含水量高、保水能力強(qiáng)、柔軟、擁有一定的粘彈性和形狀、生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)。水凝膠材料具有獨(dú)特的性能，是一類新型功能材料，已經(jīng)成為生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

可注射水凝膠是以溶液狀態(tài)存在，可以與藥物混合；當(dāng)通過注射的方法以溶液的狀態(tài)植入體內(nèi)后，能夠迅速發(fā)生溶膠-凝膠相轉(zhuǎn)變而原位成膠；同時(shí)，藥物被包埋于水凝膠內(nèi)部，然后通過擴(kuò)散或者水凝膠自身降解緩慢釋放，從而達(dá)到長(zhǎng)效緩釋的目的；并且，還具有使用方便，手術(shù)創(chuàng)傷微小，能夠填充任何形狀缺損部位的優(yōu)勢(shì)。因而，可注射水凝膠作為抗腫瘤藥物載體已經(jīng)在抗腫瘤領(lǐng)域引起眾多研究者極大的興趣與關(guān)注。另外，近年來，可注射水凝膠在傷口敷料和填料、燒傷感染、假體移植和組織工程等領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用。

生物相容性水凝膠材料的研究已經(jīng)引起眾多研究者極大的興趣與關(guān)注，也是其應(yīng)用于實(shí)際的關(guān)鍵。其中，生物相容性水凝膠擔(dān)載蛋白類藥物(ChemicalSociety Reviews,2012,41,4860-4883)能夠直接注射到病變部位，實(shí)現(xiàn)藥物的持續(xù)釋放，延長(zhǎng)藥物的半衰期，有效減輕病人的痛苦，但是面臨制備過程繁瑣的問題。隨著科研的不斷深入，研究人員又制備出了嵌段聚合物基水凝膠(Journal of Controlled Release,2002,85,51-59)，這類水凝膠具有溫度敏感型，細(xì)胞相容性良好，但是，這種嵌段聚合物往往不易生物降解，很難被機(jī)體吸收利用或最終排出體外。目前，盡管一些基于合成聚合物的水凝膠也不斷的被研制出來，但是很多此類凝膠的生物相容性并不理想，具有引發(fā)免疫反應(yīng)或炎癥的潛在風(fēng)險(xiǎn)，并且其制備過程復(fù)雜，在一定程度上限制了該類水凝膠的進(jìn)一步應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種可注射水凝膠及其制備方法，本發(fā)明提供的可注射水凝膠自身具有較高的可調(diào)空間，且具有良好的生物相容性和生物降解性。

本發(fā)明提供了一種可注射水凝膠，由精氨酸修飾的殼聚糖和交聯(lián)劑在溶劑中進(jìn)行自交聯(lián)反應(yīng)得到；

所述精氨酸修飾的殼聚糖，具有式(I)所示結(jié)構(gòu)：

其中，n為聚合度，10≤n≤3200；

所述精氨酸修飾的殼聚糖中精氨酸的取代度為0.1％～80％；

所述交聯(lián)劑為氧化葡聚糖。

優(yōu)選的，所述精氨酸修飾的殼聚糖的制備方法包括以下步驟：

a)將殼聚糖、精氨酸衍生物和活化劑混合，進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，得到式(II)所示化合物；

所述精氨酸衍生物具有式(III)所示結(jié)構(gòu)：

b)將式(II)所示化合物進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，得到精氨酸修飾的殼聚糖。

優(yōu)選的，步驟a)中所述活化劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、N,N-二異丙基碳二亞胺、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺中的一種或多種。

優(yōu)選的，步驟a)中所述殼聚糖、精氨酸衍生物和活化劑的質(zhì)量比為1：(0.1～3.2)：(0.15～4.8)。

優(yōu)選的，步驟a)中所述將殼聚糖、精氨酸衍生物和活化劑混合的過程具體為：

a1)將殼聚糖與酸溶液混合，得到第一混合溶液；

a2)將精氨酸衍生物、活化劑與有機(jī)溶劑混合，得到第二混合溶液；

a3)將第二混合溶液加入第一混合溶液中，得到殼聚糖、精氨酸衍生物和活化劑的混合溶液；

步驟a1)和a2)沒有順序限制。

優(yōu)選的，步驟a)中所述酰胺化反應(yīng)的溫度為20℃～40℃，時(shí)間為24h～72h。

優(yōu)選的，步驟b)中脫保護(hù)反應(yīng)的溫度為20℃～45℃，時(shí)間為2h～8h。

優(yōu)選的，所述精氨酸修飾的殼聚糖和交聯(lián)劑的質(zhì)量比為1：(0.1～20)。

優(yōu)選的，所述溶劑為水、生理鹽水、緩沖溶液、組織培養(yǎng)液或體液。

本發(fā)明還提供了一種可注射水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

將精氨酸修飾的殼聚糖和交聯(lián)劑在溶劑中進(jìn)行自交聯(lián)反應(yīng)，得到可注射水凝膠；

所述精氨酸修飾的殼聚糖，具有式(I)所示結(jié)構(gòu)：

其中，n為聚合度，10≤n≤3200；

所述精氨酸修飾的殼聚糖中精氨酸的取代度為0.1％～80％；

所述交聯(lián)劑為氧化葡聚糖。

本發(fā)明提供了一種可注射水凝膠及其制備方法，所述可注射水凝膠由具有式(I)結(jié)構(gòu)的精氨酸修飾的殼聚糖和交聯(lián)劑在溶劑中進(jìn)行自交聯(lián)反應(yīng)得到；其中，具有式(I)結(jié)構(gòu)的精氨酸修飾的殼聚糖的聚合度10≤n≤3200；所述精氨酸修飾的殼聚糖中精氨酸的取代度為0.1％～80％；所述交聯(lián)劑為氧化葡聚糖。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的可注射水凝膠具有良好的生物相容性，能夠在體內(nèi)原位形成，有利于藥物直接作用于病變部位并較長(zhǎng)久的發(fā)揮藥效；而采用氧化葡聚糖作為交聯(lián)劑安全無毒，環(huán)境污染?。煌瑫r(shí)，所述可注射水凝膠還具有良好的生物降解性，能夠在體內(nèi)降解，而且降解產(chǎn)物為氨基酸和多糖，可通過腎臟直接排除體外，對(duì)人體無害。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的可注射水凝膠含水量高，不同濃度的多糖衍生物及凝膠浸提液的細(xì)胞存活率均大于85％，說明本發(fā)明提供的可注射水凝膠沒有明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞相容性良好。

另外，本發(fā)明提供的可注射水凝膠具有較高的可調(diào)空間，能根據(jù)不同需要調(diào)節(jié)殼聚糖的分子量、殼聚糖側(cè)鏈上精氨酸的取代度、氧化葡聚糖的分子量、氧化葡聚糖的氧化度等，從而能夠制備各種不同物理化學(xué)性能的水凝膠材料。

此外，本發(fā)明提供的可注射水凝膠的制備方法原料簡(jiǎn)單易得，成本低；同時(shí)操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、制備工藝穩(wěn)定，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1得到的固體粉末的核磁共振氫譜圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例4得到的固體粉末的核磁共振氫譜圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例5得到的最終產(chǎn)物的核磁共振氫譜圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例45所述的不同濃度的氧化葡聚糖溶液的細(xì)胞存活率；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例46得到的不同濃度的精氨酸修飾的殼聚糖溶液的細(xì)胞存活率；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例47得到的不同濃度的凝膠浸提液的細(xì)胞存活率；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例48得到的不同濃度的凝膠浸提液的細(xì)胞存活率；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例49得到的不同濃度的凝膠浸提液的細(xì)胞存活率；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例50得到的不同濃度的凝膠浸提液的細(xì)胞存活率。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供了一種可注射水凝膠，由精氨酸修飾的殼聚糖和交聯(lián)劑在溶劑中進(jìn)行自交聯(lián)反應(yīng)得到；

所述精氨酸修飾的殼聚糖，具有式(I)所示結(jié)構(gòu)：

其中，n為聚合度，10≤n≤3200；

所述精氨酸修飾的殼聚糖中精氨酸的取代度為0.1％～80％；

所述交聯(lián)劑為氧化葡聚糖。

在本發(fā)明中，所述精氨酸修飾的殼聚糖，具有式(I)所示結(jié)構(gòu)：

其中，n為聚合度，10≤n≤3200；

所述精氨酸修飾的殼聚糖中精氨酸的取代度為0.1％～80％。

在本發(fā)明中，具有式(I)結(jié)構(gòu)的精氨酸修飾的殼聚糖，通過引入精氨酸，不僅改善了殼聚糖的水溶性，還提高其生物相容性，從而可賦予水凝膠生物功能性，如細(xì)胞粘附性、生物相容性、抗菌性等，也可進(jìn)行原位凝膠的使用。此外，本發(fā)明提供的精氨酸修飾的殼聚糖對(duì)生物體無毒，有利于在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

在本發(fā)明中，所述n為聚合度，10≤n≤3200。在本發(fā)明中，所述精氨酸修飾的殼聚糖中精氨酸的取代度為0.1％～80％，優(yōu)選為1％～50％，更優(yōu)選為3％～45％。在本發(fā)明中，所述精氨酸修飾的殼聚糖能根據(jù)不同需要調(diào)節(jié)殼聚糖的分子量、殼聚糖側(cè)鏈上精氨酸的取代度，從而能夠用于各種不同物理化學(xué)性能的水凝膠材料的制備。

在本發(fā)明中，所述精氨酸修飾的殼聚糖的制備方法優(yōu)選包括以下步驟：

a)將殼聚糖、精氨酸衍生物和活化劑混合，進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，得到式(II)所示化合物；

所述精氨酸衍生物具有式(III)所示結(jié)構(gòu)：

b)將式(II)所示化合物進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，得到精氨酸修飾的殼聚糖。

本發(fā)明首先將殼聚糖、精氨酸衍生物和活化劑混合，進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，得到式(II)所示化合物。在本發(fā)明中，所述殼聚糖具有式(IV)所示結(jié)構(gòu)：

在本發(fā)明中，所述殼聚糖的分子量?jī)?yōu)選為2000Da～500000Da，更優(yōu)選為8000Da～300000Da，更更優(yōu)選為10000Da～200000Da；本發(fā)明對(duì)所述殼聚糖的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的市售商品即可。

在本發(fā)明中，所述精氨酸衍生物具有式(III)所示結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明對(duì)所述精氨酸衍生物的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的市售商品即可。

在本發(fā)明中，所述活化劑優(yōu)選選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)中的一種或多種，更優(yōu)選為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。在本發(fā)明中，所述活化劑能夠?qū)彼嵫苌锏聂然鸹罨饔?；本發(fā)明對(duì)所述活化劑的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的上述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)的市售商品即可。

在本發(fā)明中，所述殼聚糖、精氨酸衍生物和活化劑的質(zhì)量比優(yōu)選為1：(0.1～3.2)：(0.15～4.8)。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述活化劑選自EDC和NHS；所述殼聚糖、精氨酸衍生物、EDC和NHS的質(zhì)量比優(yōu)選為1：0.1：0.1：0.05。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述活化劑選自EDC和NHS；所述殼聚糖、精氨酸衍生物、EDC和NHS的質(zhì)量比優(yōu)選為1：0.2：0.2：0.1。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述活化劑選自EDC和NHS；所述殼聚糖、精氨酸衍生物、EDC和NHS的質(zhì)量比優(yōu)選為1：0.4：0.4：0.2。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述活化劑選自EDC和NHS；所述殼聚糖、精氨酸衍生物、EDC和NHS的質(zhì)量比優(yōu)選為1：0.8：0.8：0.4。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述活化劑選自EDC和NHS；所述殼聚糖、精氨酸衍生物、EDC和NHS的質(zhì)量比優(yōu)選為1：1.6：1.6：0.8。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述活化劑選自EDC和NHS；所述殼聚糖、精氨酸衍生物、EDC和NHS的質(zhì)量比優(yōu)選為1：3.2：3.2：1.6。

在本發(fā)明中，所述將殼聚糖、精氨酸衍生物和活化劑混合的過程優(yōu)選具體為：

a1)將殼聚糖與酸溶液混合，得到第一混合溶液；

a2)將精氨酸衍生物、活化劑與有機(jī)溶劑混合，得到第二混合溶液；

a3)將第二混合溶液加入第一混合溶液中，得到殼聚糖、精氨酸衍生物和活化劑的混合溶液；

步驟a1)和a2)沒有順序限制。

本發(fā)明將殼聚糖與酸溶液混合，得到第一混合溶液。在本發(fā)明中，所述酸溶液優(yōu)選為鹽酸溶液和/或醋酸溶液，更優(yōu)選為鹽酸溶液。在本發(fā)明中，所述酸溶液的作用是促進(jìn)殼聚糖的溶解，本發(fā)明對(duì)此沒有特殊限制。在本發(fā)明中，所述殼聚糖與酸溶液的用量比優(yōu)選為1g：(25mL～200mL)，更優(yōu)選為1g：(50mL～150mL)，更更優(yōu)選為1g：100mL。

同時(shí)，本發(fā)明將精氨酸衍生物、活化劑與有機(jī)溶劑混合，得到第二混合溶液。在本發(fā)明中，所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)和乙腈中的一種或多種，更優(yōu)選為N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。本發(fā)明對(duì)所述有機(jī)溶劑的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的上述N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)和乙腈的市售商品即可。在本發(fā)明中，所述精氨酸衍生物與有機(jī)溶劑的用量比優(yōu)選為1g：(1mL～150mL)，更優(yōu)選1g：(3.125mL～100mL)。

分別得到所述第一混合溶液和第二混合溶液后，本發(fā)明將第二混合溶液加入第一混合溶液中，得到殼聚糖、精氨酸衍生物和活化劑的混合溶液，即完成混合過程。然后，本發(fā)明直接進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，得到式(II)所示化合物。本發(fā)明優(yōu)選在攪拌的條件下進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，本發(fā)明對(duì)此沒有特殊限制。在本發(fā)明中，所述酰胺化反應(yīng)的溫度優(yōu)選為20℃～40℃，更優(yōu)選為30℃；所述酰胺化反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為24h～72h，更優(yōu)選為48h。

完成所述酰胺化反應(yīng)后，本發(fā)明優(yōu)選還包括將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到固體粉末。在本發(fā)明中，由于反應(yīng)最終產(chǎn)物為精氨酸修飾的殼聚糖，而多糖核磁難以分析，精氨酸上氫的位移與多糖中氫的位移相近，難以進(jìn)行取代度的計(jì)算，而式(II)所示化合物中苯環(huán)結(jié)構(gòu)容易進(jìn)行核磁分析和取代度的計(jì)算，因此本發(fā)明對(duì)其進(jìn)行分析表征。

得到式(II)所示化合物后，本發(fā)明將式(II)所示化合物進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，得到精氨酸修飾的殼聚糖。在本發(fā)明中，所述脫保護(hù)反應(yīng)的過程優(yōu)選具體為：

將式(II)所示化合物分散在反應(yīng)介質(zhì)中，在溴化氫溶液存在下，進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，純化，得到精氨酸修飾的殼聚糖。在本發(fā)明中，所述反應(yīng)介質(zhì)優(yōu)選為三氟乙酸。在本發(fā)明中，所述反應(yīng)介質(zhì)的用量?jī)?yōu)選為50mL～200mL，更優(yōu)選為80mL～150mL；所述溴化氫溶液的用量?jī)?yōu)選為2mL～25mL，更優(yōu)選為4mL～20mL。

在本發(fā)明中，所述脫保護(hù)反應(yīng)的溫度優(yōu)選為20℃～45℃，更優(yōu)選為30℃；所述脫保護(hù)反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為2h～8h，更優(yōu)選為6h。

在本發(fā)明中，所述交聯(lián)劑為氧化葡聚糖。在本發(fā)明中，所述氧化葡聚糖的氧化度優(yōu)選為10％～100％，更優(yōu)選為15％～80％，更更優(yōu)選為20％～50％。本發(fā)明采用氧化葡聚糖為交聯(lián)劑安全無毒，環(huán)境污染小。本發(fā)明對(duì)所述氧化葡聚糖的來源沒有特殊限制，采用如下制備方法得到的自制品即可。

在本發(fā)明中，所述氧化葡聚糖的制備方法優(yōu)選具體為：

將葡聚糖與水混合，在高碘酸鈉存在下進(jìn)行避光反應(yīng)，然后加入異丙醇終止反應(yīng)，透析凍干，得到氧化葡聚糖。

在本發(fā)明中，所述葡聚糖的分子量?jī)?yōu)選為2000Da～500000Da，更優(yōu)選為8000Da～300000Da，更更優(yōu)選為10000Da～200000Da；本發(fā)明對(duì)所述葡聚糖的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的市售商品即可。

在本發(fā)明中，所述葡聚糖與水的用量比優(yōu)選為1g：(10mL～50mL)，更優(yōu)選為1g：(20mL～30mL)。在本發(fā)明中，所述葡聚糖與高碘酸鈉的質(zhì)量比優(yōu)選為1：(0.05～1.5)，更優(yōu)選為1：(0.1～1)。

本發(fā)明優(yōu)選在攪拌條件下進(jìn)行避光反應(yīng)，本發(fā)明對(duì)此沒有特殊限制。在本發(fā)明中，所述避光反應(yīng)的溫度優(yōu)選為15℃～50℃，更優(yōu)選為20℃～40℃，更更優(yōu)選為25℃～35℃；所述避光反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為1.5h～6h，更優(yōu)選為2h～5h。

在本發(fā)明中，所述可注射水凝膠由精氨酸修飾的殼聚糖和交聯(lián)劑在溶劑中進(jìn)行自交聯(lián)反應(yīng)得到。在本發(fā)明中，所述精氨酸修飾的殼聚糖和交聯(lián)劑的質(zhì)量比優(yōu)選為1：(0.1～20)，更優(yōu)選為1：(1～10)。

在本發(fā)明中，所述溶劑優(yōu)選為水、生理鹽水、緩沖溶液、組織培養(yǎng)液或體液，更優(yōu)選為緩沖溶液。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述溶劑為磷酸的緩沖溶液。

本發(fā)明還提供了一種可注射水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

將精氨酸修飾的殼聚糖和交聯(lián)劑在溶劑中進(jìn)行自交聯(lián)反應(yīng)，得到可注射水凝膠；

所述精氨酸修飾的殼聚糖，具有式(I)所示結(jié)構(gòu)：

其中，n為聚合度，10≤n≤3200；

所述精氨酸修飾的殼聚糖中精氨酸的取代度為0.1％～80％；

所述交聯(lián)劑為氧化葡聚糖。

在本發(fā)明中，所述將精氨酸修飾的殼聚糖和交聯(lián)劑在溶劑中進(jìn)行自交聯(lián)反應(yīng)的過程優(yōu)選具體為：

將交聯(lián)劑、精氨酸修飾的殼聚糖分別與溶劑混合，再進(jìn)行共混，自交聯(lián)得到可注射抗菌水凝膠。在本發(fā)明中，所述精氨酸修飾的殼聚糖、交聯(lián)劑、溶劑與上述技術(shù)方案所述的相同，在此不再贅述。

在本發(fā)明中，交聯(lián)劑與溶劑混合得到的溶液中交聯(lián)劑的質(zhì)量濃度優(yōu)選為2％～30％，更優(yōu)選為4％～20％，更更優(yōu)選為5％～15％。在本發(fā)明中，精氨酸修飾的殼聚糖與溶劑混合得到的溶液中精氨酸修飾的殼聚糖的質(zhì)量濃度優(yōu)選為2％～30％，更優(yōu)選為4％～20％，更更優(yōu)選為5％～15％。

在本發(fā)明中，所述自交聯(lián)的溫度優(yōu)選為10℃～50℃，更優(yōu)選為15℃～45℃，更更優(yōu)選為20℃～40℃。

本發(fā)明提供了一種可注射水凝膠及其制備方法，所述可注射水凝膠由具有式(I)結(jié)構(gòu)的精氨酸修飾的殼聚糖和交聯(lián)劑在溶劑中進(jìn)行自交聯(lián)反應(yīng)得到；其中，具有式(I)結(jié)構(gòu)的精氨酸修飾的殼聚糖的聚合度10≤n≤3200；所述精氨酸修飾的殼聚糖中精氨酸的取代度為0.1％～80％；所述交聯(lián)劑為氧化葡聚糖。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的可注射水凝膠具有良好的生物相容性，能夠在體內(nèi)原位形成，有利于藥物直接作用于病變部位并較長(zhǎng)久的發(fā)揮藥效；而采用氧化葡聚糖作為交聯(lián)劑安全無毒，環(huán)境污染??；同時(shí)，所述可注射水凝膠還具有良好的生物降解性，能夠在體內(nèi)降解，而且降解產(chǎn)物為氨基酸和多糖，可通過腎臟直接排除體外，對(duì)人體無害。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的可注射水凝膠含水量高，不同濃度的多糖衍生物及凝膠浸提液的細(xì)胞存活率均大于85％，說明本發(fā)明提供的可注射水凝膠沒有明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞相容性良好。

另外，本發(fā)明提供的可注射水凝膠具有較高的可調(diào)空間，能根據(jù)不同需要調(diào)節(jié)殼聚糖的分子量、殼聚糖側(cè)鏈上精氨酸的取代度、氧化葡聚糖的分子量、氧化葡聚糖的氧化度等，從而能夠制備各種不同物理化學(xué)性能的水凝膠材料。

此外，本發(fā)明提供的可注射水凝膠的制備方法原料簡(jiǎn)單易得，成本低；同時(shí)操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、制備工藝穩(wěn)定，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。

為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的可注射水凝膠及其制備方法進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明以下實(shí)施例所用的原料均為市售，其中，精氨酸衍生物由上海吉爾生化有限公司提供的BOC-Arg(Z)-OH，結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例1

(1)稱取2g殼聚糖與200mL鹽酸溶液混合，得到第一混合溶液；再稱取0.2g精氨酸衍生物、0.2g EDC、0.1g NHS于圓底燒瓶，加入20mL DMF使其溶解，得到第二混合溶液；將第二混合溶液加入到第一混合溶液中，30℃下攪拌反應(yīng)48h，純化，得到固體粉末；

(2)將步驟(1)得到的固體粉末以100mL三氟乙酸為反應(yīng)介質(zhì)分散，加入15mL溴化氫溶液，30℃下反應(yīng)6h，純化，得到精氨酸修飾的殼聚糖，產(chǎn)率為80％。

對(duì)步驟(1)得到的固體粉末進(jìn)行核磁共振分析，如圖1所示。結(jié)果表明，精氨酸成功接到殼聚糖上，同時(shí)精氨酸的取代度為3％。

實(shí)施例2

(1)稱取2g殼聚糖與200mL鹽酸溶液混合，得到第一混合溶液；再稱取0.4g精氨酸衍生物、0.4g EDC、0.2g NHS于圓底燒瓶，加入20mL DMF使其溶解，得到第二混合溶液；將第二混合溶液加入到第一混合溶液中，30℃下攪拌反應(yīng)48h，純化，得到固體粉末；

(2)將步驟(1)得到的固體粉末以100mL三氟乙酸為反應(yīng)介質(zhì)分散，加入15mL溴化氫溶液，30℃下反應(yīng)6h，純化，得到精氨酸修飾的殼聚糖，產(chǎn)率為85％。

對(duì)步驟(1)得到的固體粉末進(jìn)行核磁共振分析，結(jié)果表明，精氨酸成功接到殼聚糖上，同時(shí)精氨酸的取代度為6％。

實(shí)施例3

(1)稱取2g殼聚糖與200mL鹽酸溶液混合，得到第一混合溶液；再稱取0.8g精氨酸衍生物、0.8g EDC、0.4g NHS于圓底燒瓶，加入20mL DMF使其溶解，得到第二混合溶液；將第二混合溶液加入到第一混合溶液中，30℃下攪拌反應(yīng)48h，純化，得到固體粉末；

(2)將步驟(1)得到的固體粉末以100mL三氟乙酸為反應(yīng)介質(zhì)分散，加入15mL溴化氫溶液，30℃下反應(yīng)6h，純化，得到精氨酸修飾的殼聚糖，產(chǎn)率為83％。

對(duì)步驟(1)得到的固體粉末進(jìn)行核磁共振分析，結(jié)果表明，精氨酸成功接到殼聚糖上，同時(shí)精氨酸的取代度為10％。

實(shí)施例4

(1)稱取2g殼聚糖與200mL鹽酸溶液混合，得到第一混合溶液；再稱取1.6g精氨酸衍生物、1.6g EDC、0.8g NHS于圓底燒瓶，加入20mLDMF使其溶解，得到第二混合溶液；將第二混合溶液加入到第一混合溶液中，30℃下攪拌反應(yīng)48h，純化，得到固體粉末；

(2)將步驟(1)得到的固體粉末以100mL三氟乙酸為反應(yīng)介質(zhì)分散，加入15mL溴化氫溶液，30℃下反應(yīng)6h，純化，得到精氨酸修飾的殼聚糖，產(chǎn)率為81％。

對(duì)步驟(1)得到的固體粉末進(jìn)行核磁共振分析，如圖2所示。結(jié)果表明，精氨酸成功接到殼聚糖上，同時(shí)精氨酸的取代度為23％。

實(shí)施例5

(1)稱取2g殼聚糖與200mL鹽酸溶液混合，得到第一混合溶液；再稱取3.2g精氨酸衍生物、3.2g EDC、1.6g NHS于圓底燒瓶，加入20mLDMF使其溶解，得到第二混合溶液；將第二混合溶液加入到第一混合溶液中，30℃下攪拌反應(yīng)48h，純化，得到固體粉末；

(2)將步驟(1)得到的固體粉末以100mL三氟乙酸為反應(yīng)介質(zhì)分散，加入15mL溴化氫溶液，30℃下反應(yīng)6h，純化，得到精氨酸修飾的殼聚糖，產(chǎn)率為84％。

對(duì)步驟(1)得到的固體粉末進(jìn)行核磁共振分析，結(jié)果表明，精氨酸成功接到殼聚糖上，精氨酸的取代度為32％。此外，對(duì)最終產(chǎn)物進(jìn)行了核磁共振分析，如圖3所示，發(fā)現(xiàn)苯環(huán)峰消失，說明已成功完成了脫保護(hù)過程，生成了精氨酸修飾的殼聚糖。

實(shí)施例6

(1)稱取2g殼聚糖與200mL鹽酸溶液混合，得到第一混合溶液；再稱取6.4g精氨酸衍生物、6.4g EDC、3.2g NHS于圓底燒瓶，加入20mL DMF使其溶解，得到第二混合溶液；將第二混合溶液加入到第一混合溶液中，30℃下攪拌反應(yīng)48h，純化，得到固體粉末；

(2)將步驟(1)得到的固體粉末以100mL三氟乙酸為反應(yīng)介質(zhì)分散，加入15mL溴化氫溶液，30℃下反應(yīng)6h，純化，得到精氨酸修飾的殼聚糖，產(chǎn)率為86％。

對(duì)步驟(1)得到的固體粉末進(jìn)行核磁共振分析。結(jié)果表明，精氨酸成功接到殼聚糖上，同時(shí)精氨酸的取代度為45％。

實(shí)施例7

稱取2g葡聚糖于燒瓶中，再加入50ml水溶解，得到混合液，然后用錫箔紙包好燒瓶使其避光，再在避光條件下向混合液中加入0.5g高碘酸鈉，25℃下攪拌，進(jìn)行避光反應(yīng)4h，再加入異丙醇終止反應(yīng)，透析凍干，得氧化葡聚糖。

實(shí)施例8

稱取2g葡聚糖于燒瓶中，再加入50ml水溶解，得到混合液，然后用錫箔紙包好燒瓶使其避光，再在避光條件下向混合液中加入1g高碘酸鈉，25℃下攪拌，進(jìn)行避光反應(yīng)4h，再加入異丙醇終止反應(yīng)，透析凍干，得氧化葡聚糖。

實(shí)施例9

將實(shí)施例1中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比10∶1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例10

將實(shí)施例1中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1∶1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例11

將實(shí)施例1中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1∶10共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例12

將實(shí)施例2中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比10∶1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例13

將實(shí)施例2中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1∶1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例14

將實(shí)施例2中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1∶10共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例15

將實(shí)施例3中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比10：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例16

將實(shí)施例3中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例17

將實(shí)施例3中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：10共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例18

將實(shí)施例4中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比8：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例19

將實(shí)施例4中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例20

將實(shí)施例4中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：8共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例21

將實(shí)施例5中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比6：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例22

將實(shí)施例5中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例23

將實(shí)施例5中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：6共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例24

將實(shí)施例6中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比4：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例25

將實(shí)施例6中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例26

將實(shí)施例6中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例7中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為6％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：4共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例27

將實(shí)施例1中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為5％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比16：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例28

將實(shí)施例1中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為5％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例29

將實(shí)施例1中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為5％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：16共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例30

將實(shí)施例2中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為8％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比14：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例31

將實(shí)施例2中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為8％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例32

將實(shí)施例2中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為8％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：14共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例33

將實(shí)施例3中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為10％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比12：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例34

將實(shí)施例3中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為10％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例35

將實(shí)施例3中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為10％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：12共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例36

將實(shí)施例4中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為12％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比10：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例37

將實(shí)施例4中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為12％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例38

將實(shí)施例4中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為12％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：10共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例39

將實(shí)施例5中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為14％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比9：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例40

將實(shí)施例5中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為14％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例41

將實(shí)施例5中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為14％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：9共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例42

將實(shí)施例6中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為15％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比8：1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例43

將實(shí)施例6中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為15％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1∶1共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例44

將實(shí)施例6中得到的精氨酸修飾的殼聚糖與實(shí)施例8中得到的氧化葡聚糖，分別配制成質(zhì)量濃度為15％的磷酸緩沖溶液，將制成的兩種溶液以體積比1：8共混，采用小管倒置法觀察其在37℃的粘度變化，以小管倒置時(shí)，30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)為凝膠化，待其自交聯(lián)得到可注射水凝膠。

實(shí)施例45

將實(shí)施例7得到的氧化葡聚糖進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試：將細(xì)胞種植于96孔板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔，在37℃，5％CO₂的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；移除培養(yǎng)基，加入不同濃度倍比稀釋的多糖衍生物溶液(簡(jiǎn)稱ODex，最大濃度為10mg/mL，200μL/孔)，并以PEI25K作為陽性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24h，移除培養(yǎng)液后采用MTT方法測(cè)試。

結(jié)果參見圖4，圖4為本發(fā)明實(shí)施例45所述的不同濃度的氧化葡聚糖溶液的細(xì)胞存活率。由圖4可知，不同濃度溶液的細(xì)胞存活率均大于85％，說明本發(fā)明所述的氧化葡聚糖溶液沒有明顯的細(xì)胞毒性，且氧化葡聚糖中含有醛基可作為大分子交聯(lián)劑，因此可在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域進(jìn)一步應(yīng)用。

實(shí)施例46

將實(shí)施例4所述的精氨酸修飾的殼聚糖進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試：將細(xì)胞種植于96孔板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔，在37℃，5％CO₂的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；移除培養(yǎng)基，加入不同濃度倍比稀釋的多糖衍生物溶液(簡(jiǎn)稱CA，最大濃度為10mg/mL，200μL/孔)，并以PEI25K作為陽性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24h，移除培養(yǎng)液后采用MTT方法測(cè)試。

結(jié)果參見圖5，圖5為本發(fā)明實(shí)施例46得到的不同濃度的精氨酸修飾的殼聚糖溶液的細(xì)胞存活率。由圖5可知，不同濃度溶液的細(xì)胞存活率均大于85％，說明該精氨酸修飾的殼聚糖溶液沒有明顯的細(xì)胞毒性，因此可在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域進(jìn)一步應(yīng)用。

實(shí)施例47

將實(shí)施例12制備的可注射水凝膠進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試：用DMEM浸提實(shí)施例12中制備的可注射水凝膠，從而得到凝膠浸提液；將細(xì)胞種植于96孔板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔，在37℃，5％CO₂的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；移除培養(yǎng)基，加入不同濃度倍比稀釋的凝膠浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間(24h，48h)，移除培養(yǎng)液后采用MTT方法測(cè)試。

結(jié)果參見圖6，圖6為本發(fā)明實(shí)施例47得到的不同濃度的凝膠浸提液的細(xì)胞存活率。在圖6中，不同濃度凝膠浸提液的細(xì)胞存活率均大于85％，說明此種可注射水凝膠沒有明顯的細(xì)胞毒性。此外，混合溶液在37℃條件下能夠形成水凝膠，即可在體溫下形成水凝膠，因此能夠作為可注射性型水凝膠作為藥物載體或支架材料應(yīng)用。

實(shí)施例48

將實(shí)施例19制備的可注射水凝膠進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試：用DMEM浸提實(shí)施例19中制備的可注射水凝膠，從而得到凝膠浸提液；將細(xì)胞種植于96孔板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔，在37℃，5％CO₂的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；移除培養(yǎng)基，加入不同濃度倍比稀釋的凝膠浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間(24h，48h)，移除培養(yǎng)液后采用MTT方法測(cè)試。

結(jié)果參見圖7，圖7為本發(fā)明實(shí)施例48得到的不同濃度的凝膠浸提液的細(xì)胞存活率。在圖7中，不同濃度凝膠浸提液的細(xì)胞存活率均大于85％，說明此種可注射水凝膠沒有明顯的細(xì)胞毒性。此外，混合溶液在37℃條件下能夠形成水凝膠，即可在體溫下形成水凝膠，因此能夠作為可注射性型水凝膠作為藥物載體或支架材料應(yīng)用。

實(shí)施例49

將實(shí)施例15制備的可注射水凝膠進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試：用DMEM浸提實(shí)施例15中制備的可注射水凝膠，從而得到凝膠浸提液；將細(xì)胞種植于96孔板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔，在37℃，5％CO₂的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；移除培養(yǎng)基，加入不同濃度倍比稀釋的凝膠浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間(24h，48h)，移除培養(yǎng)液后采用MTT方法測(cè)試。

結(jié)果參見圖8，圖8為本發(fā)明實(shí)施例49得到的不同濃度的凝膠浸提液的細(xì)胞存活率。在圖8中，不同濃度凝膠浸提液的細(xì)胞存活率均大于85％，說明此種可注射水凝膠沒有明顯的細(xì)胞毒性。此外，混合溶液在37℃條件下能夠形成水凝膠，即可在體溫下形成水凝膠，因此能夠作為可注射性型水凝膠作為藥物載體或支架材料應(yīng)用。

實(shí)施例50

將實(shí)施例18制備的可注射水凝膠進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試：用DMEM浸提實(shí)施例18中制備的可注射水凝膠，從而得到凝膠浸提液；將細(xì)胞種植于96孔板中，細(xì)胞密度為1×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔，在37℃，5％CO₂的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；移除培養(yǎng)基，加入不同濃度倍比稀釋的凝膠浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間(24h，48h)，移除培養(yǎng)液后采用MTT方法測(cè)試。

結(jié)果參見圖9，圖9為本發(fā)明實(shí)施例50得到的不同濃度的凝膠浸提液的細(xì)胞存活率。在圖9中，不同濃度凝膠浸提液的細(xì)胞存活率均大于85％，說明此種可注射水凝膠沒有明顯的細(xì)胞毒性。此外，混合溶液在37℃條件下能夠形成水凝膠，即可在體溫下形成水凝膠，因此能夠作為可注射性型水凝膠作為藥物載體或支架材料應(yīng)用。

由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明提供的可注射水凝膠具有較高的可調(diào)空間，能根據(jù)不同需要進(jìn)行調(diào)節(jié)殼聚糖側(cè)鏈上精氨酸的取代度、氧化葡聚糖的氧化度、多糖濃度及多糖組分配比等，此外，也能調(diào)節(jié)殼聚糖及葡聚糖的分子量。同時(shí)，利用天然多糖衍生物大分子充當(dāng)交聯(lián)劑，避免引入額外的化學(xué)交聯(lián)劑，安全無毒，環(huán)境污染?。欢宜隹勺⑸渌z可以制備各種不同成凝膠時(shí)間和凝膠強(qiáng)度的水凝膠。再者，本發(fā)明所述精氨酸修飾的殼聚糖可賦予水凝膠生物功能性，如細(xì)胞粘附性、生物相容性、抗菌性等，也可以進(jìn)行原位凝膠的使用。更重要的是，本發(fā)明提供的可注射水凝膠含水量高，不同濃度的多糖衍生物材料及凝膠浸提液的細(xì)胞存活率均大于85％，說明此種可注射水凝膠沒有明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞相容性良好。并且，該水凝膠能夠生物降解，降解產(chǎn)物為氨基酸和多糖，能夠通過腎臟排出體外，對(duì)人體無毒，具備某些特殊的醫(yī)用功能，具有推廣應(yīng)用的潛力，市場(chǎng)前景廣闊。另外，混合溶液在37℃條件下能夠形成水凝膠，即可在體溫下形成水凝膠，因此能夠用作可注射性型凝膠，作為藥物載體或者支架材料應(yīng)用。再者，本發(fā)明提供的水凝膠材料制備工藝穩(wěn)定，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，原料簡(jiǎn)單易得，成本低、反應(yīng)條件溫和。

所公開的實(shí)施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。