技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于核酸的分子診斷領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及利用等位基因特異性抑制不需要序列變體擴(kuò)增的核酸序列擴(kuò)增的改進(jìn)方法。
背景技術(shù)：
：基于核酸的診斷測(cè)試廣泛地用于醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)和環(huán)境應(yīng)用中。檢測(cè)特定核酸序列中的變異提供關(guān)于多態(tài)性和突變(包括致病突變)的信息。例如，檢測(cè)個(gè)體的突變基因型為遺傳咨詢提供攜帶者的狀態(tài)。一個(gè)更具挑戰(zhàn)性的任務(wù)是檢測(cè)源于組織并引起疾病或疾病發(fā)展的體細(xì)胞突變。例如，許多癌癥由特定突變引起。隨后，在腫瘤進(jìn)展期間，其它的突變積累存在于癌細(xì)胞中。參見(jiàn)Lea等(2007)Geneticpathwaysandmutationprofilesofhumancancers：siteandexposure-specificpatterns，Carcinogenesis，28(9)：1851-1858；Downward，J.(2003)TargetingRASsignalingpathwaysincancertherapy(2005)，NatureRev.Cancer，3：11-22。這些突變預(yù)示疾病結(jié)果和對(duì)治療的響應(yīng)。參見(jiàn)Ikediobi等(2008)Somaticpharmacogenomicsincancer，PharmacogenomicsJ.，8：305-314；Pao等(2005)KRASmutationsandprimaryresistanceoflungadenocarcinomastogefitinibandorerlotinib，PLoSMedicine，2(1)，e17。檢測(cè)這種突變的能力對(duì)癌癥診斷和治療極其有用。然而，突變的檢測(cè)，尤其是早期檢測(cè)面臨很多技術(shù)難題。檢測(cè)癌癥相關(guān)突變的主要難題是其罕見(jiàn)的性質(zhì)，特別是癌發(fā)生中突變剛出現(xiàn)于單細(xì)胞時(shí)。最初，只有部分細(xì)胞攜帶突變，而周?chē)?xì)胞仍然攜帶野生型序列。因此在核酸的分離物中，新突變的核酸隱藏于過(guò)量的野生型核酸中。許多等位基因特異性檢測(cè)方法(例如等位基因特異性PCR)包括相對(duì)于不需要的序列(野生型序列)，優(yōu)先擴(kuò)增目標(biāo)序列(突變序列)。不幸的是，多數(shù)情況下該方法的選擇性并不完美，即不需要序列也被擴(kuò)增，雖然比所需要序列的擴(kuò)增效率低很多。因?yàn)榇嬖诘牟恍枰?野生型)序列的摩爾數(shù)大大超過(guò)突變序列，其擴(kuò)增劣勢(shì)被消除，并且野生型序列被顯著擴(kuò)增從而遮蔽了存在的突變序列。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了應(yīng)對(duì)該難題的一些方法。例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,849,497和2008年8月5日申請(qǐng)的申請(qǐng)順序號(hào)12/186,311教導(dǎo)了利用防止競(jìng)爭(zhēng)性不需要序列的擴(kuò)增的擴(kuò)增阻斷劑。在該方法中，阻斷劑是在一個(gè)擴(kuò)增引物的下游與不需要序列(但是不與所需序列)形成穩(wěn)定雜交體的不可延伸的寡核苷酸。當(dāng)阻斷劑穩(wěn)定雜交后，缺乏5’-3’核酸酶活性的DNA聚合酶不能完成引物的延伸。該方法的成功依賴于需要序列和不需要序列間的序列差異。該方法最好用于序列之間有多個(gè)差異的情形下，以確保阻斷劑和待抑制序列之間的雜交穩(wěn)定，而阻斷劑和待擴(kuò)增序列之間的雜交不穩(wěn)定。上述方法有幾個(gè)技術(shù)局限。較長(zhǎng)的阻斷劑寡核苷酸對(duì)阻斷更有效，但可能不能區(qū)分差異，因此阻斷了所有序列變體的擴(kuò)增。較短的阻斷劑可能不能有效阻斷任何擴(kuò)增。在某些序列組成中，可能差異很少以至于阻斷劑只能進(jìn)行非常微弱的區(qū)分。因此，在某些有臨床意義的基因座中，僅阻斷劑還不足以解決等位基因特異性擴(kuò)增的技術(shù)問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明是對(duì)目標(biāo)序列的需要變體進(jìn)行選擇性擴(kuò)增的改進(jìn)方法，其中所述目標(biāo)序列以多種變體形式存在，該方法包括如下步驟：提供在反應(yīng)混合物中可能包含至少一種目標(biāo)序列變體的樣品；提供能和目標(biāo)序列的多種變體雜交的第一寡核苷酸；提供能和目標(biāo)序列的多種變體雜交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的至少一部分在3’末端或3’末端附近的一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含修飾的堿基；提供第三寡核苷酸，其與所述目標(biāo)序列的需要變體雜交的親和力低于與目標(biāo)序列的不需要變體雜交的親和力，并設(shè)計(jì)為與所述第二寡核苷酸雜交相同的鏈且位于所述第二寡核苷酸下游0-60個(gè)核苷酸之間的位置；提供基本上沒(méi)有5’-3’核酸酶活性和具有熱啟動(dòng)能力的核酸聚合酶；使所述反應(yīng)混合物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中當(dāng)所述第三寡核苷酸雜交目標(biāo)序列的不需要變體時(shí)，所述第三寡核苷酸顯著抑制所述核酸聚合酶對(duì)所述第二寡核苷酸的延伸，但是當(dāng)所述第三寡核苷酸雜交于目標(biāo)序列的需要變體時(shí)，其基本上不抑制所述核酸聚合酶對(duì)所述第二寡核苷酸的延伸。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明方法的示意圖。圖2圖示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1，分別擴(kuò)增和解鏈分析野生型和KRAS突變靶的結(jié)果。圖3-8圖示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例2，在野生型和突變體樣品的混合物中，等位基因特異性擴(kuò)增和檢測(cè)KRAS突變的結(jié)果。圖9圖示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例3，在得自患者的福爾馬林固定石蠟包埋組織(FFPET)樣品中，等位基因特異性擴(kuò)增和檢測(cè)KRAS突變的結(jié)果。圖10圖示本發(fā)明的實(shí)施例中使用的目標(biāo)核酸序列。具體實(shí)施方式本發(fā)明是選擇性擴(kuò)增目標(biāo)序列的某些變體的改進(jìn)方法，其通過(guò)等位基因特異性抑制目標(biāo)序列的一種或多種其它變體的擴(kuò)增而得到增強(qiáng)。定義除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解一致的含義。在描述本發(fā)明和主張本發(fā)明權(quán)利中，將使用以下的定義?！吧飿悠贰被颉皹悠贰敝缚赡馨康暮怂岬娜魏挝镔|(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可用公知的任何方法獲得樣品。這樣的樣品可以是從人或其它動(dòng)物分離的一定量的組織或液體，或其純化部分，包括但不限于：體液(例如血漿、血清、脊髓液、唾液、腹水、淋巴液、水性或玻璃體液、滑液、尿液、眼淚、精液、陰道液體、肺積液、漿膜液)和組織(包括血液、正常組織、腫瘤和石蠟包埋組織)。樣品也可以是(或來(lái)自于)體外細(xì)胞培養(yǎng)物。樣品可以包括條件培養(yǎng)液(medium)、細(xì)胞和細(xì)胞組分。核酸可用本領(lǐng)域公知的方法從生物樣品中獲得。本文所用“阻斷劑寡核苷酸”指下列描述的寡核苷酸：(1)以足夠低的解鏈溫度和目標(biāo)序列的某些變體形成雙鏈體，以允許顯著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶移除(displace)阻斷劑寡核苷酸，使目標(biāo)序列的那些變體得以復(fù)制；和(2)以足夠高的解鏈溫度和目標(biāo)序列的其它變體形成雙鏈體，以削弱顯著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶復(fù)制目標(biāo)序列的那些變體。阻斷劑寡核苷酸通常在3’末端包含修飾以防止阻斷劑寡核苷酸通過(guò)聚合酶延伸?！澳繕?biāo)序列”指生物樣品中待檢測(cè)的核苷酸序列。目標(biāo)序列可以是較大序列或分離的核酸的一部分。短語(yǔ)“削弱擴(kuò)增”指消除或可檢測(cè)地減少序列的擴(kuò)增。如本文所述，和缺乏阻斷劑寡核苷酸的對(duì)照反應(yīng)相比，阻斷劑寡核苷酸可以削弱目標(biāo)序列的一種或多種變體的擴(kuò)增，使得這些變體的擴(kuò)增檢測(cè)不到，或較少檢測(cè)到。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”可交替使用，指RNA、DNA和其修飾形式(例如肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)等)的聚合體。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”之間的長(zhǎng)度并無(wú)有意的區(qū)分。“寡核苷酸”通常是較短的核酸，其常為單鏈。核酸是單鏈或雙鏈，通常包含磷酸二酯鍵，雖然在某些情況下，可能有替代骨架的核酸類(lèi)似物也包含其中，包括例如磷酰胺(Beaucage等(1993)Tetrahedron49(10)：1925；Letsinger(1970)J.Org.Chem.35：3800；Sprinzl等(1977)Eur.J.Biochem.81：579；Letsinger等(1986)Nucl.AcidsRes.14：3487；Sawai等(1984)Chem.Lett.805；Letsinger等(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；和Pauwels等(1986)ChemicaScripta26：1419)；硫代磷酸酯(Mag等(1991)NucleicAcidsRes.19：1437和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,644,048)；二硫代磷酸酯(Briu等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：2321)；O-甲基亞磷酰胺鍵(O-methylphophoroamiditelinkages)(Eckstein，OligonucleotidesandAnalogues：APracticalApproach，OxfordUniversityPress(1992))；以及肽核酸骨架和鍵(Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114：1895；Meier等(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31：1008；Nielsen(1993)Nature365：566；和Carlsson等(1996)Nature380：207)。其它類(lèi)似物核酸包括具有正電荷骨架的類(lèi)似物核酸(Denpcy等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：6097)；非離子骨架核酸類(lèi)似物(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863；Angew(1991)Chem.Intl.Ed.English30：423；Letsinger等(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；Letsinger等(1994)Nucleoside&Nucleotide13：1597；Chapters2and3，ASCSymposiumSeries580，″CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch″，Y.S.Sanghvi和P.DanCook主編；Mesmaeker等(1994)Bioorganic&MedicinalChem.Lett.4：395；Jeffs等(1994)J.BiomolecularNMR34：17；TetrahedronLett.37：743(1996))和非核糖骨架核酸類(lèi)似物，包括以下文獻(xiàn)所述的核酸類(lèi)似物：美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,235,033和5,034,506，和Chapters6and7，ASCSymposiumSeries580，CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch，Y.S.Sanghvi和P.DanCook主編。包含一種或多種碳環(huán)糖的核酸也包括于核酸的定義范圍內(nèi)(Jenkins等(1995)Chem.Soc.Rev.pp169-176)。數(shù)個(gè)核酸類(lèi)似物也描述于例如Rawls，C&ENewsJun.2，1997第35頁(yè)。磷酸核糖骨架的這些修飾可以促進(jìn)添加其它部分例如標(biāo)記部分，或者改變這些分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半壽期。核酸通常包含典型的含氮堿基(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶)。不過(guò)，核酸也可以包含非天然的雜環(huán)堿基或其它修飾堿基。具體地說(shuō)，這樣的堿基描述于Seela等(1991)Helv.Chim.Acta74：1790，Grein等(1994)Bioorg.Med.Chem.Lett.4：971-976，和Seela等(1999)Helv.Chim.Acta82：1640。其它堿基包括7-脫氮嘌呤(例如7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等)、吡唑并[3，4-d]嘧啶、丙炔基-dN(例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,990,303。其它代表性的雜環(huán)堿基包括次黃嘌呤；肌苷；黃嘌呤；以下堿基的8-氮雜衍生物：2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤；以下堿基的7-脫氮-8-氮雜衍生物：腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤；6-氮雜胞苷；5-氟胞苷；5-氯胞苷；5-碘胞苷；5-溴胞苷；5-甲基胞苷；5-丙炔基胞苷；5-溴乙烯尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、4-乙酰胞苷、5-(羧基-羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辮苷(galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯腺苷、1-甲基鳥(niǎo)苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥(niǎo)苷、7-脫氮腺苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥(niǎo)苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥(niǎo)苷、7-脫氮鳥(niǎo)苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D甘露糖基辮苷、5’-甲氧基羧基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N-6-異戊烯腺苷、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、假尿苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辮苷(queosine)、2-巰基胞苷、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w，2，6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶等。非天然堿基和核苷酸的其它實(shí)例是5-丙炔基嘧啶，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,484,908；和其它修飾嘧啶，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,645,985和5,830,653。[2.2.1]二環(huán)核苷酸描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,639,059中。其它修飾嘌呤和嘧啶描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,011,611中。術(shù)語(yǔ)“引物延伸”指核苷酸摻合生物催化劑(例如聚合酶)以在引物的3’端加上一個(gè)或多個(gè)核苷酸的能力?！斑m合引物延伸的條件”指在這樣的條件下雜交于模板核酸的引物通過(guò)核苷酸摻合生物催化劑(例如聚合酶)得以延伸。例如這種條件出現(xiàn)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的退火和延伸步驟中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解這種條件可以變化，并且通常受溶液的離子強(qiáng)度、溫度和特定模板核酸和引物的序列的影響。各種PCR條件描述于PCRStrategies(M.A.Innis，D.H.Gelfand和J.J.Sninsky主編，1995，AcademicPress，SanDiego，Calif.)的第14章；PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications(M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky和T.J.White主編，1990AcademicPress，N.Y.)。當(dāng)一種核酸的至少部分序列可以和另一種核酸的至少部分序列以反向平行的關(guān)系結(jié)合形成雙鏈體時(shí)，則所述一種核酸相對(duì)于另一種核酸是“互補(bǔ)的”。本發(fā)明中，如果寡核苷酸和特定核酸序列“完全互補(bǔ)”，則寡核苷酸的每個(gè)堿基都和特定序列的對(duì)應(yīng)堿基互補(bǔ)。當(dāng)一種寡核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)堿基和另一種特定核酸的對(duì)應(yīng)堿基并不互補(bǔ)(“錯(cuò)配”)，則所述一種寡核苷酸是和特定核酸序列“部分互補(bǔ)”。通常認(rèn)為修飾的堿基和他們沒(méi)有修飾的前體一樣與相同的堿基互補(bǔ)。例如7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤被認(rèn)為和胞嘧啶互補(bǔ)，而N6-芐基-腺嘌呤被認(rèn)為和胸腺嘧啶互補(bǔ)。“引物核酸”或“引物”是寡核苷酸，其在合適反應(yīng)條件下能雜交于目標(biāo)核酸(有時(shí)稱(chēng)作模板核酸)并通過(guò)核苷酸摻合生物催化劑(例如聚合酶)從而允許鏈延伸或延長(zhǎng)。引物核酸通常是天然的或合成的寡核苷酸，長(zhǎng)度范圍是約6-100個(gè)核苷酸，而最常見(jiàn)的引物長(zhǎng)度在15和35個(gè)核苷酸之間。短引物核酸通常需要較低的溫度以便和模板核酸形成足夠穩(wěn)定的雜交雙鏈復(fù)合體。與模板核酸至少部分互補(bǔ)的引物通常足以發(fā)生延伸。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增給定目標(biāo)序列的合適的引物是本領(lǐng)域公知的，且描述于本文引用的文獻(xiàn)中。如需要，可以通過(guò)摻入分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其它方法可檢測(cè)的標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記引物。為了舉例說(shuō)明，有用的標(biāo)記物包括：放射性同位素、熒光染料、電子致密試劑、酶(如在ELISA中常用的酶)、半抗原和抗血清或單抗體都可用的蛋白。這里的許多標(biāo)記物和其它標(biāo)記物在本文做了描述或者是本領(lǐng)域公知的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“探針”指寡核苷酸或其它核酸序列，其由于與目標(biāo)核酸的至少部分序列部分互補(bǔ)或完全互補(bǔ)，所以可以在合適的條件下與目標(biāo)核酸的局部區(qū)域形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。如在本文中討論的，探針通常被標(biāo)記從而允許檢測(cè)目標(biāo)核酸。探針的3’末端通常設(shè)計(jì)為防止探針通過(guò)摻入生物催化劑的核苷酸延伸。這可以利用非互補(bǔ)堿基或加入化學(xué)部分(例如生物素或磷酸基)到3’末端核苷酸的3’-羥基上來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些3’末端化學(xué)部分可具有接下來(lái)用作檢測(cè)標(biāo)記或者捕獲已雜交探針的核酸的雙重功能。通過(guò)去除3’-OH、利用缺乏3’-OH(例如雙脫氧核苷酸)的核苷酸或者添加利用位阻阻礙延伸的龐大基團(tuán)實(shí)現(xiàn)抑制延伸。如本文進(jìn)一步的討論，本發(fā)明的阻斷劑寡核苷酸可任選用作探針。術(shù)語(yǔ)“5’-3’核酸酶活性”指核酸聚合酶的活性，通常伴有核酸鏈合成，其中核苷酸從核酸鏈的5’端被除去，例如大腸桿菌DNA聚合酶I就具有這種活性，而Klenow片段則沒(méi)有。術(shù)語(yǔ)“基本上沒(méi)有5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶”或“5’-3’核酸酶缺陷型酶”或簡(jiǎn)化為“核酸酶缺陷型酶”指聚合酶的5’-3’活性比TaqDNA聚合酶的低50％以上。檢測(cè)5’-3’核酸酶活性的方法和檢測(cè)條件描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,466,591中。缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶的實(shí)例包括TaqDNA聚合酶的Stoffel片段(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,466,591)、非洲棲熱腔菌(Thermusafricanus)DNA聚合酶的突變體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,968,799)、海棲熱袍菌(Thermotogamaritime)DNA聚合酶的突變體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,624,833和5,420,029)、棲熱菌sps17和棲熱菌Z05DNA聚合酶的突變體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,466,591和5,405,774)。5’-3’核酸酶缺陷型酶也可以是嵌合體(即嵌合蛋白)，其由多種酶的結(jié)構(gòu)域組成并且具有消除5’-3’核酸酶活性的突變(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,795,762和6,228,628)。示例性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶包括來(lái)自以下細(xì)菌的聚合酶：嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)、Thermuscaldophilus、棲熱菌Z05(Thermussp.Z05)(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,674,738)、水生棲熱菌(Thermusaquaticus)、黃棲熱菌(Thermusflavus)、絲狀棲熱菌(Thermusfiliformis)、棲熱菌sps17(Thermussp.sps17)、抗輻射異常球菌(Deinococcusradiodurans)、溫泉家族B/克隆7(HotSpringfamilyB/clone7)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)、熱堅(jiān)芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)、那不勒斯海棲熱袍菌(Thermotoganeapolitana)和非洲棲熱腔菌(Thermosiphoafricanus)。無(wú)數(shù)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的全長(zhǎng)核酸和氨基酸序列可得自公共數(shù)據(jù)庫(kù)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“Tm”指“解鏈溫度”。解鏈溫度是指在該溫度下一半數(shù)量的雙鏈核酸分子(即完全或部分互補(bǔ)的核酸雙鏈體)解鏈成為單鏈。預(yù)測(cè)雙鏈多聚核苷酸的Tm要考慮堿基序列和其它因素，包括結(jié)構(gòu)和序列特征、互補(bǔ)程度、聚合鍵性質(zhì)和溶液的離子強(qiáng)度。本領(lǐng)域公知預(yù)測(cè)和試驗(yàn)性確定Tm的方法。例如，Tm傳統(tǒng)上由解鏈曲線分析確定，其中逐漸加熱雙鏈核酸分子，雙鏈體的結(jié)合/解離狀態(tài)通過(guò)檢測(cè)與雙鏈體的解鏈相關(guān)的可檢測(cè)參數(shù)的變化來(lái)監(jiān)測(cè)。標(biāo)繪相對(duì)于溫度改變的參數(shù)改變。從該解鏈曲線確定Tm。在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的術(shù)語(yǔ)“熱啟動(dòng)”是一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中在溫度升高到足以提供引物需要的雜交特異性之前，至少一種關(guān)鍵試劑不加入反應(yīng)混合物(或者，如果存在于反應(yīng)混合物中，則保持該試劑失活)?！盁釂?dòng)酶”是這樣一種酶(通常為核酸聚合酶)：其能在熱啟動(dòng)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中作為“保留”或失活的試劑。本發(fā)明是選擇性擴(kuò)增核酸的改進(jìn)，其使用等位基因特異性抑制目標(biāo)序列的不需要變體的擴(kuò)增。圖1是本發(fā)明方法的示意圖。該圖顯示雙鏈核酸靶和能退火結(jié)合于其中之一引物(箭頭所指)下游的核酸靶的阻斷劑寡核苷酸?；瘜W(xué)修飾位于阻斷劑上游的引物的3’末端。F代表熒光報(bào)告部分，Q代表綴合于阻斷劑寡核苷酸上的熒光猝滅劑。本發(fā)明的改進(jìn)基于引物和阻斷劑寡核苷酸相對(duì)鄰近以及引物和聚合酶的特定化學(xué)修飾的發(fā)現(xiàn)，其大大改善了選擇性擴(kuò)增。2008年8月5日提交的美國(guó)申請(qǐng)順序號(hào)12/186,311教導(dǎo)了抑制擴(kuò)增目標(biāo)序列的不需要變體的一般方法。通過(guò)阻斷劑寡核苷酸的等位基因特異性抑制擴(kuò)增的成功依賴于阻斷劑寡核苷酸和靶之間雜交的穩(wěn)定性。當(dāng)阻斷劑的雜交體越穩(wěn)定(如在不需要序列的情況下)，阻斷劑就抑制擴(kuò)增。當(dāng)阻斷劑的雜交體不太穩(wěn)定(如在待擴(kuò)增的序列的情況下)，擴(kuò)增發(fā)生。提高核酸雜交體穩(wěn)定性的傳統(tǒng)方法是增加雜交核酸的長(zhǎng)度。但是，增加阻斷劑寡核苷酸的長(zhǎng)度會(huì)降低區(qū)分度。目標(biāo)序列的所有變體的擴(kuò)增都將被抑制。因此，對(duì)于任何給定的目標(biāo)序列，優(yōu)化阻斷劑寡核苷酸的能力是受限的。如申請(qǐng)順序號(hào)12/186,311中所描述，阻斷劑寡核苷酸通常設(shè)計(jì)為在兩條引物寡核苷酸之間的任何位置進(jìn)行雜交。阻斷劑可以雜交至目標(biāo)核酸的一條或兩條鏈。唯一已知的要求是阻斷劑雜交的鏈必須和延伸將被抑制的引物結(jié)合的鏈相同而且必須位于該引物的下游。但是，在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)引物的3’末端和阻斷劑寡核苷酸的5’末端之間的距離影響阻斷的效率。一般來(lái)說(shuō)，引物和阻斷劑相應(yīng)末端之間的最佳距離是0-60個(gè)核苷酸。對(duì)于每個(gè)特定目標(biāo)序列，該范圍內(nèi)的最佳距離可以利用本文提供的指引經(jīng)驗(yàn)性確定。本文發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)創(chuàng)新是引物(位于阻斷劑寡聚核苷酸的上游并且雜交同一鏈)的3’末端可被化學(xué)修飾從而提升阻斷的程度。傳統(tǒng)上，化學(xué)修飾見(jiàn)于等位基因特異性引物，即引物與所需序列變體匹配但是與不需要的序列變體錯(cuò)配。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,011,611描述了影響擴(kuò)增引物特異性的化學(xué)修飾的實(shí)例。這些修飾包括在某些含氮堿基的環(huán)外氨基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。普遍已知于引物3’末端大約5個(gè)核苷酸內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的修飾增加擴(kuò)增的特異性。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，當(dāng)引物與所需的和不需要的序列變體同等互補(bǔ)時(shí)，則引物的化學(xué)修飾不是必需的。令人驚奇的是，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)引物化學(xué)修飾在通過(guò)阻斷劑寡核苷酸的等位基因特異性抑制擴(kuò)增的成功中起作用。這種作用尤其令人驚訝，因?yàn)橐镒陨聿⒉幌瘳F(xiàn)有技術(shù)要求的那樣是等位基因特異性的。引物與需要的和不需要的序列變體同等互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明是等位基因特異性的抑制不需要序列變體擴(kuò)增的選擇性擴(kuò)增分析，其是在少量的需要序列變體和摩爾過(guò)量的不需要序列變體存在下實(shí)施的。在某些實(shí)施方案中，需要的和不需要的序列變體的比例是1∶1、1∶20、1∶100、1∶1000或更高。本發(fā)明的阻斷劑寡核苷酸設(shè)計(jì)為退火和雜交于引物結(jié)合位點(diǎn)之間的目標(biāo)序列的部分。阻斷劑可設(shè)計(jì)為雜交至目標(biāo)核酸的一條或兩條鏈。設(shè)計(jì)阻斷劑寡核苷酸以形成與不需要形式的目標(biāo)序列形成的雜交體的解鏈溫度比需要形式的目標(biāo)序列的高。2008年8月5號(hào)提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)12/186,311中描述了用于抑制不需要序列變體擴(kuò)增的阻斷劑寡核苷酸的設(shè)計(jì)。通常，設(shè)計(jì)阻斷劑以摻入與目標(biāo)序列的需要變體相比具有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。對(duì)于目標(biāo)序列的其它變體，阻斷劑具有較少的錯(cuò)配或完全沒(méi)有錯(cuò)配。因?yàn)榛パa(bǔ)程度影響核酸雜交體的解鏈溫度，所以阻斷劑寡核苷酸和目標(biāo)序列的需要變體之間形成的雜交體的Tm優(yōu)選為阻斷劑寡核苷酸形成的所有雜交體中最低的Tm。除了互補(bǔ)程度以外，寡核苷酸的解鏈溫度也受非常規(guī)堿基的存在和數(shù)量的影響，其可以是如本領(lǐng)域公知的“穩(wěn)定化”(例如5-甲基胞嘧啶和丙炔基尿嘧啶核苷)或“去穩(wěn)定化”(例如N6-芐基腺苷)。任選地，這樣的堿基可以摻入阻斷劑寡核苷酸中以進(jìn)一步調(diào)節(jié)其解鏈溫度。綜合來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)阻斷劑寡核苷酸必須位于兩個(gè)擴(kuò)增引物之間，并且雜交至延伸將被抑制的引物的下游而且與該引物相同的雜交鏈雜交。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)阻斷劑和引物寡核苷酸的相對(duì)位置極大地影響阻斷劑抑制擴(kuò)增的能力。例如，阻斷劑可以位于引物3’末端下游的0-60個(gè)(例如0、1、2、3或更多個(gè))核苷酸的位置，并且與上游引物雜交相同的鏈。阻斷劑寡核苷酸可以“人工”設(shè)計(jì)或利用本領(lǐng)域從業(yè)者公知的任何一種寡核苷酸設(shè)計(jì)軟件程序，包括VisualOMP(DNASoftware，Inc.，AnnArbor，Mich.)、Oligo6(Stratagene，LaJolla，Calif.)、Sequencher(GeneCodes，AnnArbor，Mich.)和DNAStar(DNAStar，Inc.，Madison，Wis.)。設(shè)計(jì)的目的是產(chǎn)生阻斷劑寡核苷酸，使得在特定擴(kuò)增分析的溫度和條件下，目標(biāo)序列的不同變體和阻斷劑之間的雜交體具有不同熱力學(xué)穩(wěn)定性。在某些實(shí)施方案中，阻斷劑寡核苷酸有用于檢測(cè)目標(biāo)序列擴(kuò)增的探針的雙重功能。要用為探針，可以用本領(lǐng)域公知的任何類(lèi)型的可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記該阻斷劑寡核苷酸。例如，標(biāo)記物可以是熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性、酶等物質(zhì)。這種阻斷劑-探針寡核苷酸可以用于許多檢測(cè)方法，例如擴(kuò)增檢測(cè)(“生長(zhǎng)曲線”)和擴(kuò)增后解鏈分析。在根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)中，可使用一種或多種阻斷劑寡核苷酸。阻斷劑寡核苷酸可以設(shè)計(jì)為和待擴(kuò)增核酸的一條鏈雜交，或者不同的阻斷劑可設(shè)計(jì)為與兩條鏈雜交。當(dāng)設(shè)計(jì)多條寡核苷酸與核酸的相同鏈雜交時(shí)，寡核苷酸可用于擴(kuò)增反應(yīng)的相同或不同的輪次中。例如，當(dāng)?shù)诙啍U(kuò)增包含的引物位于第一輪所用引物的內(nèi)部時(shí)，位于該第二輪引物內(nèi)部的阻斷劑可用于第二輪或隨后輪次的擴(kuò)增。所有的或至少一種阻斷劑寡核苷酸應(yīng)該根據(jù)本發(fā)明的指引來(lái)設(shè)計(jì)。本發(fā)明的擴(kuò)增引物是至少部分互補(bǔ)于目標(biāo)序列的至少一種現(xiàn)存變體的寡核苷酸。引物的長(zhǎng)度可以在6-100個(gè)核苷酸之間，可是絕大多數(shù)的引物長(zhǎng)度通常在15-35個(gè)核苷酸之間。已經(jīng)描述了優(yōu)化用于核酸擴(kuò)增的引物的方法，例如PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications，Innis等主編，(1990)AcademicPress。通常引物為合成寡核苷酸，由A、C、G和T核苷酸組成。但是，也可用不常見(jiàn)于核酸的非常規(guī)堿基核苷酸。例如，已知可增加擴(kuò)增特異性的某些修飾的堿基，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,001,011。這些修飾包括與核酸堿基環(huán)外氨基基團(tuán)共價(jià)連接的烷基、芳基或烷基芳基基團(tuán)。擴(kuò)增引物中這些修飾堿基的傳統(tǒng)用途是減少非特異性擴(kuò)增。不過(guò)，本發(fā)明的一個(gè)方面，發(fā)現(xiàn)環(huán)外氨基基團(tuán)上有共價(jià)修飾的堿基的核苷酸也增加使用阻斷劑寡核苷酸的抑制擴(kuò)增的程度。各種核苷酸摻入生物催化劑(例如DNA聚合酶)在本領(lǐng)域是公知的。任何缺乏5’-3’核酸酶活性的熱穩(wěn)定性聚合酶都可用于本發(fā)明。有時(shí)最好使用沒(méi)有校正閱讀(3’-5’核酸外切酶)活性的酶。合適酶的一個(gè)實(shí)例是ΔZ05聚合酶。有時(shí)最好酶具有“熱啟動(dòng)”能力，例如描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,677,152和5,773,528中的可逆修飾的酶。熱啟動(dòng)酶的一個(gè)實(shí)例是ΔZ05-Gold聚合酶。根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法完成。這些檢測(cè)方法包括使用標(biāo)記引物和探針以及各種核酸結(jié)合染料。檢測(cè)方法可以特異性地針對(duì)目標(biāo)序列的一種變體，或者普適于目標(biāo)序列的所有變體，甚至普適于所有的雙鏈DNA。非特異性檢測(cè)方法可以在目標(biāo)序列的不需要變體的擴(kuò)增極少且預(yù)期低于該方法檢測(cè)極限水平時(shí)使用。檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物可以在擴(kuò)增結(jié)束后，例如通過(guò)未標(biāo)記產(chǎn)物的凝膠電泳和用核酸結(jié)合染料對(duì)凝膠染色?；蛘撸ㄟ^(guò)利用合成時(shí)摻入或者利用標(biāo)記的引物擴(kuò)增產(chǎn)物可攜帶放射性或化學(xué)標(biāo)記。電泳后或電泳期間，可用本領(lǐng)域公知的合適的放射學(xué)或化學(xué)工具檢測(cè)標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳后，也可通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何一種方法標(biāo)記的靶特異性的探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物。標(biāo)記的探針也可以作用于靶序列而無(wú)需電泳，即用“斑點(diǎn)印跡”分析等。在其它實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物的存在可以用均相分析檢測(cè)，即新生的產(chǎn)物在擴(kuò)增循環(huán)中檢測(cè)而不需要擴(kuò)增后處理的分析方法。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,210,015中描述了使用核酸酶探針的均相擴(kuò)增分析方法。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,871,908和6,569,627中描述了使用嵌入核酸染料的均相擴(kuò)增分析方法。均相分析也可以采用熒光探針或用兩種互相作用的熒光團(tuán)標(biāo)記的探針。這種探針的實(shí)例包括“分子信標(biāo)”探針(Tyagi等(1996)Nat.Biotechnol.，14：303-308)或熒光標(biāo)記的核酸酶探針(Livak等(1995)PCRMeth.Appl.，4：357-362)。本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)確定擴(kuò)增產(chǎn)物獨(dú)特的解鏈溫度(Tm)來(lái)檢測(cè)和鑒定它們的方法。在一個(gè)變型解鏈分析中，使用了特異性結(jié)合雙鏈體核酸的熒光化合物來(lái)監(jiān)測(cè)完整擴(kuò)增子的解鏈。具體地說(shuō)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,871,908中描述了檢測(cè)嵌入雙鏈體染料的熒光溫度依賴性變化。熒光的減少反映了擴(kuò)增子的解鏈，從而允許人們確定擴(kuò)增子的Tm。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交體形成于目標(biāo)DNA和一種或多種熒光標(biāo)記的探針之間。通常，探針用至少兩種熒光團(tuán)部分標(biāo)記，形成FRET對(duì)。在某些實(shí)施方案中，形成FRET對(duì)的其中一個(gè)部分是非熒光性的猝滅劑。形成FRET對(duì)的部分可以綴合于相同或不同的探針?lè)肿?。因?yàn)镕RET對(duì)成員之間的物理距離的改變，模板-探針雜交體的解鏈或形成導(dǎo)致的溫度改變伴隨熒光可檢測(cè)的變化。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,174,670描述了檢測(cè)綴合于探針對(duì)或單個(gè)探針的染料溫度依賴性熒光改變。利用標(biāo)記的引物對(duì)通過(guò)特定基因型獨(dú)特的Tm對(duì)其進(jìn)行鑒定的方法描述于DeSilva等(1998)“RapidgenotypingandquantificationontheLightCyclerTMwithhybridizationprobes，”Biochemica，2：12-15。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括不對(duì)稱(chēng)PCR。在不對(duì)稱(chēng)PCR混合物中，其中一種擴(kuò)增引物的量大于另一種引物。引物分別稱(chēng)為“過(guò)量引物”和“限制引物”。這些引物的延伸得到的核酸鏈分別稱(chēng)為“過(guò)量鏈”和“限制鏈”?？梢赃x擇性操作過(guò)量引物和限制引物的比例，其可以是200∶1到2∶1，但通常是9∶1到5∶1。由于引物過(guò)量，過(guò)量鏈以單鏈形式線性積累。這種過(guò)量單鏈在某些PCR后分析中有用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括不對(duì)稱(chēng)PCR，隨后通過(guò)解鏈溫度分析表征PCR后的擴(kuò)增子。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2007/0072211描述了不對(duì)稱(chēng)PCR后進(jìn)行Tm分析。在典型的反應(yīng)中，不對(duì)稱(chēng)PCR是在一種或多種標(biāo)記探針存在下進(jìn)行的。探針的解鏈和退火與熒光的可檢測(cè)改變相關(guān)聯(lián)，其反映了核酸雙鏈體的形成和解鏈。典型地，在不對(duì)稱(chēng)PCR中，設(shè)計(jì)解鏈探針以雜交“過(guò)量鏈”，即擴(kuò)增子鏈得自過(guò)量引物的延伸并且其以單鏈形式累積。本領(lǐng)域公知雜交探針的設(shè)計(jì)。不論探針是作為核酸酶探針，還是單雜交探針或雜交探針對(duì)的一個(gè)成員，探針寡核苷酸的設(shè)計(jì)遵循本領(lǐng)域公知的和本文描述的相同原理指導(dǎo)，并通過(guò)人工或者軟件的幫助來(lái)完成。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，為了抑制序列的不需要變體的擴(kuò)增，結(jié)合于相鄰的一個(gè)引物的阻斷劑寡核苷酸也可以作為雜交探針或解鏈探針或兩者。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)迅速識(shí)別出適用于這種雙重功能寡核苷酸的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。具體地，寡核苷酸應(yīng)該與目標(biāo)序列的不同變體具有不同的雜交體解鏈溫度，但是每個(gè)解鏈溫度應(yīng)該在特定系統(tǒng)的檢測(cè)范圍之內(nèi)。在大多數(shù)情況下，這包括解鏈溫度既可檢測(cè)性不同，但又相對(duì)接近。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，探針是與阻斷劑寡核苷酸分開(kāi)的寡核苷酸。探針寡核苷酸可以通過(guò)摻入各種方法可檢測(cè)的部分標(biāo)記，包括放射學(xué)、分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)方法。對(duì)于基于熒光的檢測(cè)，標(biāo)記物可以包括染料，例如熒光素家族(FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE)、羅丹明家族(TexasRed、ROX、R110、R6G和TAMRA)、花菁家族(Cy2、Cy3、Cy5和Cy7)、香豆素家族、噁嗪家族、噻嗪家族、squaranine家族和其它適合標(biāo)記和檢測(cè)核酸的熒光染料家族。此外，熒光染料可與非熒光的猝滅劑部分配對(duì)，其實(shí)例參見(jiàn)BlackHoleQuenchersTM(BiosearchTech.，Novato，Calif.)、EclipseDarkQuenchersTM(EpochBiosciences，Bothell，Wash.)和IowaBlack(IntegratedDNATech.，Coralville，Iowa)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括檢測(cè)疾病相關(guān)的突變，包括野生型(即未突變核酸序列)存在下癌癥相關(guān)的突變。一般已知在癌癥進(jìn)展過(guò)程中，癌細(xì)胞累積賦予突變細(xì)胞選擇有利性的突變，參見(jiàn)Downward，J.(2003)TargetingRASsignalingpathwaysincancertherapy(2005)，NatureRev.Cancer，3：11-22。通常突變賦予對(duì)用于治療的抗腫瘤藥物的耐藥性，參見(jiàn)Pao等(2005)KRASmutationsandprimaryresistanceoflungadenocarcinomastogefitinibandorerlotinib，PLoSMedicine，2(1)，e17。檢測(cè)這種突變會(huì)使患者免于所述腫瘤和服用伴有不良副作用的無(wú)效藥物關(guān)聯(lián)的不必要的風(fēng)險(xiǎn)。從更寬泛的角度來(lái)說(shuō)，檢測(cè)癌癥相關(guān)的突變可為現(xiàn)有疾病的預(yù)后以及初期癌癥篩查提供信息。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于檢測(cè)細(xì)胞亞群中出現(xiàn)的體細(xì)胞突變。為了成功擴(kuò)增和檢測(cè)突變核酸序列，擴(kuò)增引物可設(shè)計(jì)為雜交懷疑突變位置側(cè)翼的序列。為了抑制野生型序列的擴(kuò)增，阻斷劑寡核苷酸可以設(shè)計(jì)為完美地(或接近完美地)互補(bǔ)于野生型序列，但是相對(duì)于突變序列具有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。設(shè)計(jì)阻斷劑寡核苷酸必須確保在特異性引物退火和延伸將發(fā)生的條件下，其和野生型序列形成穩(wěn)定的雜交體但和突變序列形成不穩(wěn)定(或顯著較不穩(wěn)定)的雜交體。例如，利用可用的寡核苷酸設(shè)計(jì)工具，人們能夠設(shè)計(jì)阻斷劑寡核苷酸，以便在擴(kuò)增反應(yīng)的典型條件下，阻斷劑和野生型序列形成的雜交體的解鏈溫度將高于熱循環(huán)中所用的退火溫度。同時(shí)，阻斷劑和突變序列形成的雜交體的解鏈溫度將低于熱循環(huán)中所用的退火溫度。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸引物可以設(shè)計(jì)成側(cè)接針對(duì)特定疾病或癥狀的任何數(shù)目的目標(biāo)懷疑突變位點(diǎn)，例如Downward，J.(2003)(同上)中所列的突變。根據(jù)本發(fā)明，核酸樣品可得自新鮮的或保存的患者組織和非患病對(duì)照組織，包括福爾馬林固定的石蠟包埋組織(FFPET)。僅作為說(shuō)明并不限制本發(fā)明的范圍，該方法用于檢測(cè)已知與許多人實(shí)體腫瘤相關(guān)的KRAS基因的突變。KRAS突變發(fā)現(xiàn)于20-30％的非小細(xì)胞肺癌、30-40％的結(jié)直腸癌和高達(dá)90％的胰腺癌，參見(jiàn)Yeang等(2008)Combinatorialpatternofsomaticgenemutationsincancer，F(xiàn)ASEBJ，22：2605-2622。KRAS突變賦予針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的藥物的耐藥性。這種耐藥性似乎適用于與靶向EGFR的藥物，不管作用的機(jī)理如何，酪氨酸激酶抑制劑和抗EGFR抗體都失去了它們抗KRAS突變細(xì)胞的效力。KRAS基因是一種特別適合突變檢測(cè)分析的靶基因：所有突變的99％只出現(xiàn)于三個(gè)密碼子：密碼子12(88％)、密碼予13(10％)和密碼子61(1-3％)。這種突變集群允許設(shè)計(jì)少量的等位基因特異性引物或探針就會(huì)覆蓋臨床相關(guān)突變的完整譜系。另一方面，本發(fā)明提供了選擇性擴(kuò)增核酸并等位基因特異性抑制不需要序列變體擴(kuò)增的反應(yīng)混合物。該反應(yīng)混合物包括能和目標(biāo)序列的多種變體雜交的第一和第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸的至少部分在3’末端或其附近的一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含修飾的堿基；第三寡核苷酸，其與目標(biāo)序列的需要變體雜交的親和力小于和目標(biāo)序列的不需要變體雜交的親和力，并設(shè)計(jì)為與所述第二寡核苷酸的下游0-60個(gè)核苷酸雜交；一種基本上沒(méi)有5’-3’核酸酶活性且具有熱啟動(dòng)能力的核酸聚合酶；并任選一種已知存在多種序列變體的目標(biāo)核酸。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含擴(kuò)增和任選檢測(cè)核酸通常需要的試劑和溶液，包括核酸前體(即三磷酸核苷)、適合支持聚合酶活性的有機(jī)和無(wú)機(jī)離子以及任選檢測(cè)標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物中第一和第二寡核苷酸的量不相等，使第一寡核苷酸過(guò)量存在。在某些實(shí)施方案中，所述第三寡核苷酸是標(biāo)記的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，目標(biāo)核酸包含所有或部分的KRAS基因序列。在某些實(shí)施方案中，目標(biāo)序列包括KRAS密碼子12、13和61的一個(gè)或多個(gè)。另一方面，本發(fā)明提供實(shí)施選擇性擴(kuò)增核酸并等位基因特異性抑制不需要序列變體擴(kuò)增的試劑盒。該試劑盒通常包含分析特異性的組分和一般進(jìn)行核酸擴(kuò)增分析需要的組分。作為分析特異性組分，本發(fā)明的試劑盒通常包含能與目標(biāo)序列的多種變體雜交的第一和第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸的至少部分在3’末端或其附近的一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含修飾的堿基；第三寡核苷酸，其與目標(biāo)序列的需要變體雜交的親和力小于和目標(biāo)序列的不需要變體雜交的親和力，并設(shè)計(jì)為與所述第二寡核苷酸的下游0-60個(gè)核苷酸雜交；一種基本上沒(méi)有5’-3’核酸酶活性且具有熱啟動(dòng)能力的核酸聚合酶；和任選包含一定量的至少一種類(lèi)型目標(biāo)序列的對(duì)照核酸序列。在某些實(shí)施方案中，還包含多種類(lèi)型的對(duì)照核酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述第三寡核苷酸是標(biāo)記的。作為核酸擴(kuò)增和任選檢測(cè)通常需要的組分，本發(fā)明的試劑盒通常包含：一種或多種核酸前體，例如三磷酸核苷(三磷酸脫氧核糖核苷或三磷酸核糖核苷)、任選用于最小化核酸焦磷酸解作用的焦磷酸酶、用于預(yù)防擴(kuò)增反應(yīng)遺留污染的尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)、擴(kuò)增反應(yīng)和任選檢測(cè)需要的預(yù)制試劑和緩沖液，以及進(jìn)行本發(fā)明等位基因特異性擴(kuò)增的一套使用說(shuō)明書(shū)。實(shí)施例以下的實(shí)施例使用了KRAS基因的片段-外顯子2((SEQIDNO：1)，圖10)作為目標(biāo)序列。突變序列在外顯子2的密碼子12或密碼子13包含不同的錯(cuò)義突變。圖10中SEQIDNO：1的密碼子12和13是用下劃線標(biāo)注的堿基。探針(SEQIDNO：5)與野生型序列完美匹配。突變序列和探針有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。在以下的實(shí)施例中，同樣的探針(SEQ.ID.NO：5)用作擴(kuò)增檢測(cè)探針和解鏈探針。另外，該探針還用作野生型序列擴(kuò)增的抑制子。利用上游引物SEQIDNO.6、下游引物SEQIDNO.7和檢測(cè)探針SEQIDNO.8，外顯子3序列與KRAS外顯子2序列在同一反應(yīng)中被共同擴(kuò)增。為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，沒(méi)有顯示在分開(kāi)的波長(zhǎng)通道里檢測(cè)的外顯子3序列的擴(kuò)增結(jié)果。引物和探針序列示于表1。表1KRAS引物和探針序列外顯子2上游引物序列(5’-3’)SEQIDNO：2GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGT外顯子2下游引物序列(5’-3’)SEQIDNO：3GAAUUAGEUGUAUEGUEAAGGEACTCSEQIDNO：4GAAUUAGEUGUAUEGUEAAGGEACTM外顯子2探針序列(5’-3’)SEQIDNO：5FUGEEUAEIEEIEEAGEUEQp外顯子3上游引物序列(5’-3’)SEQIDNO：6GAGAAAEEUGUEUEUEUUGGAUAUUCTC外顯子3下游引物序列(5’-3’)SEQIDNO：7TCATGTACTGGTCCCTCATTGCAM外顯子3探針序列(5’-3’)SEQIDNO：8LAEUEEUCTTGACEUGEUQpE＝5-甲基dCU＝5-丙炔基dUM＝N4-芐基dCI＝dI(脫氧肌苷)F＝cx-FAM供體熒光團(tuán)(熒光素)Q＝BHQ-2BlackHoleTM猝滅劑L＝cx-HEX供體熒光團(tuán)(HEX-染料)p＝3’磷酸基實(shí)施例1野生型和KRAS突變靶單獨(dú)的擴(kuò)增和解鏈分析每50μl反應(yīng)物包含：104拷貝的野生型或突變目標(biāo)序列、0.7μM外顯子2上游(過(guò)量)引物(SEQIDNO：2)、0.025μM的第一外顯子2下游(限制)引物(SEQIDNO：3，無(wú)化學(xué)修飾)和0.075μM的第二外顯子2下游(限制)引物(SEQ.IDNO：4，被化學(xué)修飾)、0.3μM的外顯子2溶解探針(SEQIDNO：5)、0.7μM外顯子3上游(過(guò)量)引物(SEQIDNO：6)、0.1μM外顯子3下游(限制)引物(SEQIDNO：7)、0.3μM的外顯子3解鏈探針(SEQIDNO：8)、50mMTricine(pH7.7)、57mM醋酸甲(pH7.5)、8％甘油、1％DMSO、200μMdATP、200μMdCTP、200μMdGTP、400μMdUTP、50μMdTTP、0.01％Tween-20、0.04單位/μl的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、0.6單位/μl的ΔZ05GOLDDNA聚合酶和3mM的醋酸鎂。兩種限制引物的混合物用于外顯子2：1/4的具有未修飾的3’末端胞嘧啶的第一引物(SEQIDNO：3)，和3/4的N4芐化的3’末端胞嘧啶的第二引物(SEQIDNO：4)。反應(yīng)中兩種限制引物的比例允許最佳程度的野生型抑制(參見(jiàn)實(shí)施例2)：當(dāng)突變型DNA不存在時(shí)，野生型DNA被擴(kuò)增。但是，當(dāng)突變型DNA也存在時(shí)，突變型DNA相對(duì)于野生型被優(yōu)先擴(kuò)增(數(shù)據(jù)未顯示)。用RocheLightCycler480儀器進(jìn)行擴(kuò)增和解鏈分析。反應(yīng)用如下的溫度條件：50℃5分鐘(UNG步驟)，95℃10分鐘(聚合酶激活)，隨后50個(gè)循環(huán)包括95℃10秒鐘和61℃40秒。熒光數(shù)據(jù)收集于每個(gè)61℃步驟的末端，進(jìn)而生成生長(zhǎng)曲線(未顯示)。反應(yīng)物然后用作解鏈分析：最后一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后，升高溫度到95℃1秒鐘，然后降低到40℃1分鐘，再增高到95℃，期間溫度每升高1.0℃檢測(cè)熒光。最后，溫度降低到40℃結(jié)束解鏈分析。解鏈分析的結(jié)果示于圖2。原始數(shù)據(jù)(“解鏈曲線”)顯示為450-500nm波長(zhǎng)間隔的熒光隨溫度改變。導(dǎo)數(shù)(“解鏈峰”)顯示為相同溫度間隔下熒光的第一導(dǎo)值(dF/dT)。突變型靶顯示為實(shí)線，野生型模板顯示為虛線。在本實(shí)施例中，當(dāng)解鏈探針(SEQIDNO：5)與目標(biāo)核酸結(jié)合形成雙鏈體時(shí)，該探針?lè)派涑鏊璨ㄩL(zhǎng)的熒光。隨著溫度的升高，因?yàn)樘结槒碾p鏈體中解離，因此觀察到熒光的降低。分離和單鏈形式的探針形成構(gòu)象，其中猝滅劑(BHQ-2)猝滅熒光團(tuán)(FAM)的熒光。圖2的結(jié)果顯示突變型序列(實(shí)線)和野生型序列(虛線)截然不同的解鏈曲線圖。突變體樣品是通過(guò)解鏈峰最大值(Tm)比野生型樣品的低來(lái)鑒定的。較低的Tm是因?yàn)樘结樅屯蛔冃托蛄兄g互補(bǔ)程度比較低。突變體峰顯示出Tm的變化是因?yàn)闃悠分忻艽a子12或密碼子13包含不同的突變。實(shí)施例2在野生型和突變型樣品的混合物中等位基因特異性擴(kuò)增和檢測(cè)KRAS突變?cè)诒緦?shí)施例中，對(duì)于野生型靶和突變型靶的混合物的擴(kuò)增和解鏈分析是在同一管中進(jìn)行。每50μl反應(yīng)物包含8,000拷貝的目標(biāo)DNA(包含野生型和突變型序列的混合物)。反應(yīng)中突變型序列為總拷貝數(shù)的1％或5％，余下的99％或95％為野生型序列。利用大體如實(shí)施例1描述的條件和溫度設(shè)置以及每個(gè)特定試驗(yàn)的指定修飾進(jìn)行擴(kuò)增和解鏈分析。結(jié)果示于圖3-8。突變型靶的鑒定是通過(guò)解鏈峰最大值(Tm)比野生型靶的低來(lái)鑒定的。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)指定實(shí)線代表“抑制條件”，而虛線代表“對(duì)照條件”。圖3中，抑制條件是：限制引物是SEQIDNO：3和4的混合物，酶具有熱啟動(dòng)的能力(ΔZ05GOLD)。對(duì)照條件是：限制引物僅是SEQIDNO：3(無(wú)3’末端化學(xué)修飾)，酶沒(méi)有熱啟動(dòng)能力(ΔZ05)。對(duì)于ΔZ05酶，調(diào)整pH到8.3，并且從循環(huán)設(shè)置中去除聚合酶激活步驟。圖4顯示與圖3相同的試驗(yàn)的結(jié)果，除了抑制和對(duì)照條件都采用了熱啟動(dòng)酶ΔZ05GOLD外。SEQIDNO：3和4的混合物用于抑制條件，僅SEQIDNO：3(無(wú)化學(xué)修飾)用于對(duì)照條件。圖5顯示與圖3相同的試驗(yàn)的結(jié)果，除了抑制和對(duì)照條件都采用了熱啟動(dòng)酶ΔZ05GOLD外。SEQIDNO：3和4的混合物用于抑制條件，僅SEQIDNO：4(有化學(xué)修飾)用于對(duì)照條件。該結(jié)果表明使用引物的組合調(diào)節(jié)抑制的量，并確保在突變型序列不存在的情況下野生型序列被擴(kuò)增。圖6顯示與圖3相同的試驗(yàn)的結(jié)果，除了抑制和對(duì)照條件都采用了SEQNO：3和4的混合物外。抑制條件采用了熱啟動(dòng)酶ΔZ05GOLD，而對(duì)照條件采用了非熱啟動(dòng)酶ΔZ05。圖7顯示與圖3相同的試驗(yàn)的結(jié)果，除了抑制和對(duì)照條件僅采用了SEQNO：4(有化學(xué)修飾)外。抑制條件采用了熱啟動(dòng)酶ΔZ05GOLD，而對(duì)照條件采用了非熱啟動(dòng)酶ΔZ05。圖8顯示與圖7相同的試驗(yàn)的結(jié)果，除了抑制和對(duì)照條件僅采用了SEQNO：3(無(wú)化學(xué)修飾)外。如在圖7的圖示性實(shí)施例中，抑制條件采用了熱啟動(dòng)酶ΔZ05GOLD，而對(duì)照條件采用了非熱啟動(dòng)酶ΔZ05。在這個(gè)試驗(yàn)中，“抑制”條件不能產(chǎn)生抑制。該結(jié)果表明，抑制野生型的擴(kuò)增促進(jìn)突變體擴(kuò)增子的產(chǎn)量。當(dāng)突變型序列構(gòu)成了總目標(biāo)序列的1％時(shí)，沒(méi)有野生型的抑制則不能檢測(cè)到突變序列。在突變序列的較高濃度時(shí)，通過(guò)抑制野生型而使突變體擴(kuò)增子的產(chǎn)量也顯著改善。實(shí)施例3來(lái)自患者的福爾馬林固定石蠟包埋組織(FFPET)樣品中KRAS突變的等位基因特異性的擴(kuò)增和檢測(cè)在本實(shí)施例中，對(duì)自7例商購(gòu)的FFPET樣品中提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增和解鏈分析。每50μl反應(yīng)物包含25ngFFPETDNA，該DNA提取自3x10μm的組織切片，用Nanodrop分光光度計(jì)定量。5％突變靶與95％野生型靶混合的反應(yīng)物用作對(duì)照(虛線)。擴(kuò)增和解鏈分析所用的條件和溫度設(shè)置描述于實(shí)施例1，只是反應(yīng)混合物中沒(méi)有外顯子3的引物和探針、ΔZ05GOLD聚合酶的量降低到0.3單位/μl和醋酸鎂降低到2.5mM。圖9顯示解鏈峰的結(jié)果。突變靶是通過(guò)解鏈峰最大值(Tm)比野生型靶的低來(lái)鑒定的。虛線表示野生型序列，實(shí)線表示存在突變序列的患者樣品。某些患者樣品同時(shí)包含野生型和突變型序列。公知FFPETDNA是高度碎裂的，并且難于進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。但是，圖9的結(jié)果清晰地顯示出存在于FFPET樣品中的野生型DNA背景下的突變型DNA的成功擴(kuò)增和檢測(cè)。如測(cè)序所證實(shí)，突變靶的Tm變化反映KRAS基因的不同密碼子12或密碼子13的突變(數(shù)據(jù)未顯示)。雖然本發(fā)明用具體的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但是在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行各種修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。因此本發(fā)明的范圍并不限于本文描述的任何實(shí)施例，而體現(xiàn)在隨附權(quán)利要求書(shū)中。序列表<110>F.Hoffmann-LaRocheAGRocheDiagnosticsGmbH<120>利用等位基因特異性抑制序列變體的核酸擴(kuò)增<130>24874WO<140>未知<141>未知<150>61/143,113<151>07.01.2009<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>178<212>DNA<213>人<400>1tgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatga60ctgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatac120agctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgt178<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明：合成引物<400>2ggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgt32<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明：合成引物<220><223>混合型DNA/RNA分子說(shuō)明：合成引物<400>3gaauuagcuguaucgucaaggcactc26<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明：合成引物<220><223>混合型DNA/RNA分子說(shuō)明：合成引物<400>4gaauuagcuguaucgucaaggcactc26<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明：合成探針<220><223>混合型DNA/RNA分子說(shuō)明：合成探針<220><221>修飾堿基<222>(8)..(8)<223>脫氧肌苷<220><221>修飾堿基<222>(11)..(11)<223>脫氧肌苷<400>5ugccuacnccnccagcuc18<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明：合成引物<220><223>混合型DNA/RNA分子說(shuō)明：合成引物<400>6gagaaaccugucucucuuggauauuctc28<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明：合成引物<400>7tcatgtactggtccctcattgcac24<210>8<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明：合成探針<220><223>混合型DNA/RNA分子說(shuō)明：合成探針<400>8acuccucttgaccugcu17當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3