本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種鑒定轉(zhuǎn)基因植物或者轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5外源基因插入染色體位置的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

最新數(shù)據(jù)表明：2015年，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1.81億公頃，比1996年的170萬公頃增長了100倍以上(James 2015)。以基因工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)已廣泛滲入到農(nóng)業(yè)的各個領(lǐng)域，逐步改變了傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的研究和生產(chǎn)模式。轉(zhuǎn)基因作物已被快速、持續(xù)地用于商業(yè)化生產(chǎn)。無論在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，轉(zhuǎn)基因作物都對環(huán)境、經(jīng)濟(jì)、能源、衛(wèi)生及社會產(chǎn)生了巨大影響。在我國轉(zhuǎn)基因植物必須經(jīng)過轉(zhuǎn)基因植物安全評價后才能在國內(nèi)進(jìn)行種植并進(jìn)行相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品的加工貿(mào)易，其中對于轉(zhuǎn)基因外源片段插入在本體植物染色體的位置是對其分子特征安全性評價以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品溯源，鑒定的關(guān)鍵分子數(shù)據(jù)(Codex Alimentarius Commission 2003；OECD 1986,1992,2003；Sparrow 2010)。

目前鑒定轉(zhuǎn)基因植物外源片斷插入染色體位置的方法主要根據(jù)載體特異片段設(shè)計引物進(jìn)行染色體步移的方式獲取側(cè)翼片段，然后通過生物信息學(xué)比對來確外源片斷插入染色體位置(Codex 2003)，獲得側(cè)翼片段的方法主要有熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)等，通過這種方法成功的獲得了我國自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1和KF6等一系列轉(zhuǎn)基因植物的外源基因插入位置(Cao et al.2011；Wang et al.2011)。然而這種方法在遇到像小麥，玉米等基因組復(fù)雜并且基因組中富含多個相似重復(fù)片段的物種時就很難通過序列比對的方式獲取外源片段插入染色體位置的信息。

因此，就需要提供一種能夠準(zhǔn)確識別外源基因插入轉(zhuǎn)基因植物染色體位置的方法。有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定轉(zhuǎn)基因植物外源基因插入染色體位置的方法，以準(zhǔn)確的鑒定外源基因插入染色體的位置。

本發(fā)明提供的一種鑒定轉(zhuǎn)基因植物外源基因插入染色體位置的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)以轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株為親本進(jìn)行雜交，獲得F1代，所述F1代自交獲得F2代分離群體；

(b)從植物基因組數(shù)據(jù)庫中，隨機下載大量的SSR引物，再從所述SSR引物中，篩選出與所述轉(zhuǎn)基因植株和所述非轉(zhuǎn)基因植株存在多態(tài)性的多態(tài)性SSR引物；

(c)從所述F2代分離群體中篩選出陰性轉(zhuǎn)基因個體；

(d)將所述多態(tài)性SSR引物與所述陰性轉(zhuǎn)基因個體進(jìn)行連鎖分析，得到與所述陰性轉(zhuǎn)基因個體連鎖的分子標(biāo)記的引物，所述分子標(biāo)記的引物在染色體的位置即為所述外源基因插入染色體的位置。

進(jìn)一步的，所述植物包括玉米或者大豆。

進(jìn)一步的，步驟(b)中，所述多態(tài)性SSR引物的篩選方法包括：

分別以所述轉(zhuǎn)基因植株和所述非轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板，用所述SSR引物進(jìn)行PCR，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，能夠使所述轉(zhuǎn)基因植株的PCR產(chǎn)物和所述非轉(zhuǎn)基因植株的PCR產(chǎn)物不相同的所述SSR引物，即為所述多態(tài)性SSR引物。

進(jìn)一步的，步驟(d)中，所述連鎖分析的方法包括：

以所述陰性轉(zhuǎn)基因個體、所述轉(zhuǎn)基因植株和所述非轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板，用所述多態(tài)性SSR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，能夠使所述陰性轉(zhuǎn)基因個體與所述非轉(zhuǎn)基因植株的PCR反應(yīng)產(chǎn)物相同的所述多態(tài)性SSR引物，即為與所述陰性轉(zhuǎn)基因個體連鎖的分子標(biāo)記的引物。

另外本發(fā)明的第二個目的在于提供一種鑒定轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5外源基因插入染色體位置的方法，為準(zhǔn)確的識別轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5品種中，外源基因在染色體中的插入位置提供一種新方法。

本發(fā)明提供了一種鑒定轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5外源基因插入染色體位置的方法，所述外源基因為cry1Ab/cry2Aj基因以及G10evo基因，所述方法包括以下步驟：

(a)以轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5和非轉(zhuǎn)基因玉米昌7為親本進(jìn)行雜交，獲得F1代，所述F1代自交獲得F2代分離群體；

(b)從玉米數(shù)據(jù)庫MaizeGDB中，隨機下載大量的SSR引物，再從所述SSR引物中，篩選出與所述轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5和所述非轉(zhuǎn)基因玉米昌7存在多態(tài)性的多態(tài)性SSR引物；

(c)從所述F2代分離群體中篩選出陰性轉(zhuǎn)基因個體；

(d)將所述多態(tài)性SSR引物與所述陰性轉(zhuǎn)基因個體進(jìn)行連鎖分析，得到與所述陰性轉(zhuǎn)基因個體連鎖的分子標(biāo)記的引物，所述分子標(biāo)記的引物在染色體的位置即為所述外源基因插入染色體的位置。

進(jìn)一步的，

步驟(b)中，篩選得到的所述多態(tài)性SSR引物共85對；

步驟(c)中，所述從所述F2代分離群體中篩選出陰性轉(zhuǎn)基因個體的方法采用PCR方法以及草甘膦篩選法，篩選得到的所述陰性轉(zhuǎn)基因個體共29個。

進(jìn)一步的，所述分子標(biāo)記的引物為引物umc1191和引物umc1691，

所述引物umc1191的序列為：

umc1191-F：5'-ACTCATCACCCCTCCAGAGTGTC-3'(SEQ ID NO.1)

umc1191-R：5'-AAGTCATTGCCCAAAGTGTTGC-3'(SEQ ID NO.2)

所述引物umc1691的序列為：

umc1691-F：5'-TCGTCTAAACTGCATAAAAGGGGA-3'(SEQ ID NO.3)

umc1691-R：5'-ACGGAGATAGATGCACACAAACAC-3'(SEQ ID NO.4)。

另外，本發(fā)明還提供了所述鑒定轉(zhuǎn)基因植物外源基因插入染色體位置的方法和所述鑒定轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5外源基因插入染色體位置的方法，在轉(zhuǎn)基因作物育種、分子特征安全性評價以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品溯源中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的鑒定轉(zhuǎn)基因植物外源基因插入染色體位置的方法，通過篩選與分離群體中陰性轉(zhuǎn)基因個體連鎖的分子標(biāo)記的引物，并根據(jù)分子標(biāo)記的引物所在染色體的位置得到外源基因的位置，該方法準(zhǔn)確可靠，能夠?qū)崿F(xiàn)對基因組相對復(fù)雜的物種如玉米，大豆等作物的外源基因插入位置的快速準(zhǔn)確識別。此外，本發(fā)明還提供了鑒定轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5外源基因插入染色體位置的方法，準(zhǔn)確識別了轉(zhuǎn)基因玉米品種雙抗12-5中，外源基因插入染色體的位置。另外，本發(fā)明還提供了上述方法在轉(zhuǎn)基因作物的育種、分子特征安全性評價以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品溯源等方面的應(yīng)用，具有良好的應(yīng)用前景和可觀的市場價值。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例2中篩選出與轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5和非轉(zhuǎn)基因玉米C7存在多態(tài)性SSR引物的PCR結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實施例2中與陰性轉(zhuǎn)基因個體連鎖的兩個分子標(biāo)記的PCR結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實施例2中轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5外源基因插入染色體位置示意圖；

圖4為本發(fā)明實施例2提供的方法的流程示意圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

為了有助于更清楚的理解本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)的介紹。如未明確指出，實施例中涉及的方法為常見的分子生物學(xué)方法，所述的試劑為市售常規(guī)試劑。

實施例1

本實施例提供了一種鑒定轉(zhuǎn)基因植物外源基因插入染色體位置的方法，包括以下步驟：

(a)以轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株為親本進(jìn)行雜交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代分離群體。

需要注意的是，以外源基因A為例，轉(zhuǎn)基因植株為含有外源基因A的植株；非轉(zhuǎn)基因植株為不含有外源基因A的植株(即也可以含有與外源基因A不相關(guān)的外源基因B)。

(b)從植物基因組數(shù)據(jù)庫中，隨機下載大量的SSR引物，再從SSR引物中，篩選出與轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株存在多態(tài)性的多態(tài)性SSR引物。

本步驟中，首先從植物基因組數(shù)據(jù)庫中選取SSR引物，這些SSR引物最好均勻分布在待鑒定植株的基因組上。然后再從這些SSR引物中，篩選出與轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株存在多態(tài)性的多態(tài)性SSR引物。

其中，幾個常用的植物基因組數(shù)據(jù)庫如表1所示。

表1常見的植物基因組數(shù)據(jù)庫

本步驟中，篩選多態(tài)性SSR引物的方法為：分別以轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板，用SSR引物進(jìn)行PCR，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，能夠使轉(zhuǎn)基因植株的PCR產(chǎn)物和非轉(zhuǎn)基因植株的PCR產(chǎn)物不相同的SSR引物，即為多態(tài)性SSR引物。

(c)從F2代分離群體中篩選出陰性轉(zhuǎn)基因個體。

本步驟中，篩選陰性轉(zhuǎn)基因個體的方法，可以采用PCR方法，也可以根據(jù)外源基因產(chǎn)生的具體性狀進(jìn)行篩選，也可以采用兩種方法的結(jié)合，優(yōu)選采用PCR方法進(jìn)行篩選。其中PCR方法為以F2代分離群體的DNA為模板，用外源基因的引物進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物有目標(biāo)條帶即為陽性轉(zhuǎn)基因個體，PCR產(chǎn)物沒有目標(biāo)條帶即為陰性轉(zhuǎn)基因個體。

(d)分別提取F2代分離群體中的陰性轉(zhuǎn)基因個體、轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株親本的DNA，并分別以三個樣本的DNA為模板，用步驟(b)中的獲得的多態(tài)性SSR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，篩選得到能夠使陰性轉(zhuǎn)基因個體與非轉(zhuǎn)基因植株的PCR反應(yīng)產(chǎn)物帶型一致的多態(tài)性SSR引物，即為與陰性轉(zhuǎn)基因個體連鎖的分子標(biāo)記的引物，該分子標(biāo)記的引物在染色體的位置即為外源基因插入染色體的位置。

該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對基因組相對復(fù)雜的物種，例如玉米、大豆或者小麥等作物的外源基因插入染色體位置的快速準(zhǔn)確識別，且對轉(zhuǎn)入的外源基因沒有限制，對任何已知序列的外源基因均適用。該方法克服了當(dāng)外源基因插入到植物基因組的重復(fù)序列區(qū)域而導(dǎo)致無法精確識別外源基因在染色體位置的困擾。

實施例2

本實施例提供了一種鑒定轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5外源基因插入染色體位置的方法。其中，轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的外源基因為cry1Ab/cry2Aj基因以及G10evo基因。轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5品種來自于浙江大學(xué)，昆蟲所。

該方法具體包括以下步驟：

(a)以轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5(以下簡稱“雙抗12-5”)和非轉(zhuǎn)基因玉米昌7(以下簡稱“C7”)為親本進(jìn)行雜交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代分離群體。

(b)從玉米數(shù)據(jù)庫MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)中，隨機下載大量的SSR引物，再從這些SSR引物中，篩選出與雙抗12-5和C7存在多態(tài)性的多態(tài)性SSR引物共85對。

篩選多態(tài)性SSR引物的方法采用PCR方法，分別以雙抗12-5和C7的基因組DNA為模板，用SSR引物進(jìn)行PCR(針對每一對引物分別進(jìn)行PCR)，然后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株的PCR產(chǎn)物和非轉(zhuǎn)基因植株的PCR產(chǎn)物不相同時，表明該SSR引物即為多態(tài)性SSR引物。

具體的PCR方法如下：

PCR引物為：從玉米數(shù)據(jù)庫MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)中，隨機下載的大量SSR引物。

PCR反應(yīng)體系為：10μL的反應(yīng)體系，包括1μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液、0.6μL 25mmol/L dNTP溶液、1μL 5μmol/L正向引物，1μmol/L 5μmol/L反向引物，0.25μL 2U/μL Taq DNA聚合酶，4.35μL超純水，1μL樣品DNA(即雙抗12-5或者C7的基因組DNA)。若緩沖液含有MgCl₂，則不再加MgCl₂溶液，以加等體積無菌水替代。

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，50℃-65℃(根據(jù)引物序列Tm值確定)退火45s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃延伸8min，4℃保存。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，以雙抗12-5和C7的基因組為模板出現(xiàn)大小不一致的擴(kuò)增條帶則說明該引物存在多態(tài)性，如圖1列出了10對多態(tài)性SSR引物的電泳圖。由圖1可以看出，分別以雙抗12-5和C7的基因組為模板時，10對SSR引物的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條帶均不相同，即表明這10對SSR引物為多態(tài)性SSR引物。圖1中，P1表示轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5；P2表示非轉(zhuǎn)基因玉米C7；F1表示雙抗12-5與C7的雜交一代；M表示分子量Marker。

按照上述方法，分別對隨機下載的大量SSR引物進(jìn)行PCR篩選，最終得到了85對多態(tài)性SSR引物，具體的多態(tài)性SSR引物的序列如表2所示。雖然本實施例對大量的SSR引物進(jìn)行了篩選，但考慮到除了篩選得到的85對多態(tài)性SSR引物之外的，不具有多態(tài)性的SSR引物對本實施例的最終結(jié)果不具有突出的貢獻(xiàn)，因此，本實施例中僅記載了85對多態(tài)性SSR引物的核苷酸序列。

表2 85對多態(tài)性SSR引物的核苷酸序列

(c)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的外源基因為cry1Ab/cry2Aj基因以及G10evo基因。其中，cry1Ab/cry2Aj基因能夠使玉米具有抗蟲性，G10evo基因能夠使玉米具有耐除草劑(草甘膦)性。

為了篩選出不含cry1Ab/cry2Aj基因的個體，本實施例采用了PCR方法，具體方法如下。

PCR引物為：

Cry1Ab/Cry2Aj-F：5'-TTCACCACCCCCTTCAACTTC-3'(SEQ ID NO.5)

Cry1Ab/Cry2Aj-R：5'-TTCCACTCGGTCCACTCCTTC-3'(SEQ ID NO.6)

PCR反應(yīng)體系為：10μL的反應(yīng)體系，包括1μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液、0.6μL 25mmol/L dNTP溶液、1μL 5μmol/L正向引物，1μmol/L5μmol/L反向引物，0.25μL 2U/μL Taq DNA聚合酶，4.35μL超純水，1μL樣品DNA。若緩沖液含有MgCl₂，則不再加MgCl₂溶液，以加等體積無菌水替代。

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃延伸8min，4℃保存。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，PCR檢測陰性的個體，即不含有cry1Ab/cry2Aj基因。

為了篩選出不含有G10evo基因的個體，本實施例采用了耐除草劑(草甘膦)篩選法。

除草劑的施用量為：農(nóng)藥登記標(biāo)簽的中劑量或者推薦劑量。

用藥時間：轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的V3-V5生育期。

不能夠在草甘膦除草劑存在的條件下存活的個體，即不含有G10evo基因。

采用上述PCR方法以及耐除草劑(草甘膦)篩選法相結(jié)合，從F2代分離群體中篩選得到不抗草甘膦且PCR陰性的個體，即為陰性轉(zhuǎn)基因個體，共計29個。

(d)分別提取F2代分離群體中的陰性轉(zhuǎn)基因個體、雙抗12-5和C7的葉片DNA，并分別以三個樣本的DNA為模板，用步驟(b)中的獲得的多態(tài)性SSR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用引物umc1191和引物umc1691分別進(jìn)行PCR時，C7的擴(kuò)增帶型與29個陰性轉(zhuǎn)基因個體的擴(kuò)增帶型均一致(如圖2所示，其中P1表示轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5；P2表示非轉(zhuǎn)基因玉米C7；M表示分子量Marker)，而其他的引物在陰性轉(zhuǎn)基因個體中帶型為正常的自由分離。上述結(jié)果表明，用引物umc1191和引物umc1691進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物是與陰性轉(zhuǎn)基因個體連鎖的分子標(biāo)記，而引物umc1191和引物umc1691則是與陰性轉(zhuǎn)基因個體連鎖的分子標(biāo)記的引物，外源基因插入染色體的位置則與引物umc1191和引物umc1691在染色體的位置連鎖。又根據(jù)根據(jù)玉米數(shù)據(jù)庫MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)的信息得知，這兩個引物位于第九染色體Bin9.03，因此外源基因也位于第九染色體Bin9.03處(如圖3所示)。

其中，引物umc1191的序列為：

umc1191-F：5'-ACTCATCACCCCTCCAGAGTGTC-3'(SEQ ID NO.1)

umc1191-R：5'-AAGTCATTGCCCAAAGTGTTGC-3'(SEQ ID NO.2)

引物umc1691的序列為：

umc1691-F：5'-TCGTCTAAACTGCATAAAAGGGGA-3'(SEQ ID NO.3)

umc1691-R：5'-ACGGAGATAGATGCACACAAACAC-3'(SEQ ID NO.4)。

為了有助于對本實施例的理解，圖4描繪了本實施例的流程示意圖，其中“鄭58”為轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的商品名稱，“昌7”即為非轉(zhuǎn)基因玉米昌7。

按照本實施例提供的方法，能夠快速、準(zhǔn)確的鑒定轉(zhuǎn)基因玉米品種雙抗12-5中，外源基因cry1Ab/cry2Aj和G10evo的插入位置在第九染色體Bin9.03處。

需要注意的是，本實施例中的轉(zhuǎn)基因玉米品種也可以為其他植物或者品種，轉(zhuǎn)入的外源基因可以為其他基因，只需確定外源基因的基因序列，即可應(yīng)用本方法快速、準(zhǔn)確的鑒定外源基因插入轉(zhuǎn)基因植物中染色體的位置。

除此之外，本發(fā)明還提供了上述鑒定轉(zhuǎn)基因植物外源基因插入染色體位置的方法，以及鑒定轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5外源基因插入染色體位置的方法在轉(zhuǎn)基因作物育種、分子特征安全性評價以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品溯源等方面的應(yīng)用。在我國轉(zhuǎn)基因植物必須經(jīng)過轉(zhuǎn)基因植物安全評價后才能在國內(nèi)進(jìn)行種植并進(jìn)行相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品的加工貿(mào)易，其中獲取轉(zhuǎn)基因外源片段插入在本體植物染色體的位置是必要的(轉(zhuǎn)基因植物安全評價指南)，本方法通過篩選與雙抗12-5外源基因連鎖的分子標(biāo)記獲得了外源基因插入在玉米第九號染色體上，有利于轉(zhuǎn)基因雙抗12-5順利獲得安全證書并進(jìn)一步商業(yè)化。同時本發(fā)明方法提供了轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5與外源基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，因此在后代雜交育種時可采用分子標(biāo)記輔助選擇育種對優(yōu)良資源進(jìn)行篩選。

此外，本發(fā)明提供的方法還可以與TAIL-PCR方法結(jié)合，相互補充，也可用于轉(zhuǎn)基因作物育種，分子特征安全性評價以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品溯源等方面，具有良好的應(yīng)用前景和可觀的市場價值。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進(jìn)行限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 鑒定轉(zhuǎn)基因植物或者轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5外源基因插入染色體位置的方法及

其應(yīng)用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actcatcacc cctccagagt gtc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagtcattgc ccaaagtgtt gc 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgtctaaac tgcataaaag ggga 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acggagatag atgcacacaa acac 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttcaccaccc ccttcaactt c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttccactcgg tccactcctt c 21