本發(fā)明涉及一種同步檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌的雙重PCR引物及其檢測(cè)方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae)屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌屬(Klebsiella)，為有莢膜的革蘭氏陰性菌，包含肺炎亞種(subsp.pneumoniae)、鼻炎亞種(subsp.azaenae)和鼻硬結(jié)亞種(subsp.rhinoscleromatis)3個(gè)亞種。肺炎克雷伯氏菌于1882年首次分離出來，是革蘭氏陰性菌感染中僅次于大腸桿菌的條件致病菌。它是一種人畜共患致病菌，主要引起人的肺炎、呼吸道疾病、腸炎、敗血癥等，研究人員陸續(xù)從鯉、小鼠、梅花鹿、牛、大熊貓等多種動(dòng)物上分離發(fā)現(xiàn)該菌。由于機(jī)體免疫力的降低，抗菌藥物的濫用，物種間的交叉感染，肺炎克雷伯氏菌對(duì)畜禽、水產(chǎn)動(dòng)物等的危害越來越嚴(yán)重，引起鯉、白鰱、中華鱉等大規(guī)模的感染及發(fā)病。

豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)屬于氣單胞菌屬(Aeromonas)，為嗜溫有動(dòng)力氣單胞菌(mesophilic motile aeromonas)，普遍存在于淡水、海水、淤泥和污水等環(huán)境中，是一種條件致病菌，其宿主范圍很廣，能引起人類和動(dòng)物的腹瀉。豚鼠氣單胞菌單獨(dú)或與其他病原菌混合感染也能引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物如鰻鱺、鰱鳙、金魚、鯉、對(duì)蝦等的敗血癥及甲魚、中華絨螯蟹等的病害，造成水產(chǎn)動(dòng)物的大量死亡。

近年來，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物大規(guī)模暴發(fā)細(xì)菌性敗血癥引起了研究者的重點(diǎn)關(guān)注。經(jīng)過病原分離鑒定，發(fā)現(xiàn)了致病菌肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌。通過對(duì)現(xiàn)有資料文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌的檢測(cè)方法主要有:細(xì)菌培養(yǎng)法、核酸PCR檢測(cè)法(TaqMan real-time PCR法和SYBR Green real-time PCR法)和DNA堿基序列測(cè)定技術(shù)、基因芯片技術(shù)、LAMP結(jié)合示差脈沖伏安法、PCR-DHPLC檢測(cè)技術(shù)等。這幾種方法具有不受病程影響、快速、敏感性和特異性高、新穎的優(yōu)點(diǎn)，但成本高，實(shí)驗(yàn)條件要求高，需要精密昂貴的儀器、操作復(fù)雜，不適合在基層進(jìn)行檢測(cè)和推廣。尋求一種在實(shí)際生產(chǎn)中快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的檢測(cè)方法，對(duì)于病原的確定及診治尤為重要。由于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)適合早期和大量樣品的檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，試驗(yàn)要求不高，能大批量檢測(cè)樣本，具有普遍適用性，能很好的滿足水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的檢測(cè)需求。本試驗(yàn)選擇肺炎克雷伯氏菌的毒力外膜蛋白C基因和豚鼠氣單胞菌的外膜蛋白Aha1基因，來建立一種雙重PCR檢測(cè)方法，為引起魚體暴發(fā)性出血病病原肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌的檢測(cè)提供可靠、可行的技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，建立一種同步檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌的雙重PCR方法，該方法可用于肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)，具有檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)。

按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種同步檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌的雙重PCR引物，引物對(duì)如下：

引物ompC：

正向引物F：5’-AACACTGAAA GCTCCAGCGA-3’；

反向引物R：5’-CGTCGGTACG TTTGGAGTGA-3’；

引物ahal：

正向引物F：5’-AGACGGTACC ACTTTCGACG-3’

反向引物R：5’-ATGTGACGCG GGTCTATGTC-3’。

以引物ompC和引物ahal為靶基因，通過雙重PCR方法，以待檢樣品DNA為模板，以引物ompC和引物ahal擴(kuò)增靶基因，檢測(cè)是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物，有對(duì)應(yīng)條帶則表明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

具體步驟如下：

(1)肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌的DNA提?。簲U(kuò)大培養(yǎng)肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌，采用常規(guī)細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌菌液的DNA，溶解在pH7.5的TE緩沖液中，置于-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)雙重PCR反應(yīng)：引物ompC和引物ahal在同一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，其中取濃度均為100mmol/L的上下游引物各0.5-1μL，

(3)電泳檢測(cè)：取5-10μL PCR檢測(cè)產(chǎn)物，在1％含goldview染色劑的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，結(jié)束后將膠放在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照記錄；

(4)結(jié)果分析：在418bp位置處有擴(kuò)增條帶代表樣品中含有肺炎克雷伯氏菌，213bp位置處有擴(kuò)增條帶代表樣品中含有豚鼠氣單胞菌；若對(duì)應(yīng)位置無擴(kuò)增條帶，表示樣品為陰性，待檢測(cè)樣品中不含有肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌。

步驟(2)中PCR反應(yīng)條件及檢測(cè)體系具體如下：

PCR檢測(cè)體系：兩組濃度均為100mmol/L的上下游引物各0.5-1μL，含Mg²⁺的10×Buffer 3-4μL，濃度為25g/L dNTP 2-3μL，Taq酶0.2μL，DNA模板各1-3μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)齊至25μL；

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3-5min，94℃變性30-45s、56℃復(fù)性30-45s、72℃延伸30-60s、30-35個(gè)循環(huán)，然后72℃溫育7min，最后降溫至4-12℃。

步驟(3)所述電泳檢測(cè)條件為電壓為100-140V，時(shí)間為40-60min。

本發(fā)明建立的用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌的雙重PCR方法，可用于檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物是否攜帶肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌，與國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

(1)準(zhǔn)確性高，特異性強(qiáng)：從肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌的ompC和ahal兩個(gè)基因序列來檢測(cè)，可同時(shí)特異性檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌，無擴(kuò)增產(chǎn)物。

(2)操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，易推廣；本發(fā)明建立的雙重PCR技術(shù)，在同一體系中同時(shí)擴(kuò)增兩對(duì)引物，模板為新鮮培養(yǎng)的菌液提取的DNA；整個(gè)過程簡(jiǎn)單，上手快，可大批量檢測(cè)，一般整個(gè)檢測(cè)過程可在短時(shí)間內(nèi)完成?；鶎蛹夹g(shù)人員易于掌握，推廣性很強(qiáng)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌雙重PCR引物的特異性檢測(cè)。

圖2為實(shí)施例3肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌雙重PCR方法的靈敏度檢測(cè)。

圖3為實(shí)施例4肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌雙重PCR的臨床樣本檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。其中，goldview染色劑購(gòu)自SBS賽百盛生物工程有限公司。

本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)中的特異性引物均通過核酸合成設(shè)備制備。核酸合成設(shè)備可委托相關(guān)基因公司合成。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌雙重PCR引物獲得

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上已收錄的肺炎克雷伯氏菌ompC序列(Genbank登錄號(hào)KJ579291)和豚鼠氣單胞菌ahal序列(Genbank登錄號(hào)JQ946880)運(yùn)用在線網(wǎng)站Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)出兩組特異性引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：

引物ompC：

正向引物F：5’-AACACTGAAAGCTCCAGCGA-3’

反向引物R：5’-CGTCGGTACGTTTGGAGTGA-3’；

引物ahal：

正向引物F：5’-AGACGGTACCACTTTCGACG-3’

反向引物R：5’-ATGTGACGCGGGTCTATGTC-3’；

實(shí)施例2肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌雙重PCR引物的特異性檢測(cè)

1、肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、遲鈍愛德華氏菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌的基因組DNA提取。

細(xì)菌菌株DNA提取：采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)的手冊(cè)指南進(jìn)行(公眾可從上海生工獲取詳細(xì)資料)，具體如表1所示，DNA溶解在50μL、pH7.5的TE緩沖液中，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1

2、雙重PCR反應(yīng)體系及程序：

雙重PCR檢測(cè)體系為25μL的總量，具體包括：

ompC和ahal上下游引物各0.5μL(100mmol/L)

10×Buffer(含Mg²⁺)3μL

dNTP 2μL(25g/L)

Taq酶0.2μL

DNA模板各3μL

最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL

其中，DNA模板3μL：每個(gè)管中分別加入肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、遲鈍愛德華氏菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌的基因組DNA模板3μL，或者兩株菌各1.5μL混合DNA。

雙重PCR檢測(cè)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，接94℃變性30s、56℃復(fù)性45s、72℃延伸30s、30個(gè)循環(huán)，然后72℃溫育7min。

電泳檢測(cè)：取5μL的PCR產(chǎn)物在1％含goldview染色劑的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，結(jié)束后將膠放在在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照記錄。

3、雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖1所示，其中，M:DL2000 DNA Marker；1:肺炎克雷伯氏菌DNA；2:大腸桿菌DNA；3:遲鈍愛德華氏菌DNA；4:嗜水氣單胞菌DNA；5:維氏氣單胞菌DNA；6:豚鼠氣單胞菌DNA；7:大腸桿菌DNA；8:遲鈍愛德華氏菌DNA；9:嗜水氣單胞菌DNA；10:維氏氣單胞菌DNA；11:肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌混合DNA；12:大腸桿菌和遲鈍愛德華氏菌混合DNA；13:大腸桿菌和嗜水氣單胞菌混合DNA；14:大腸桿菌和維氏氣單胞菌混合DNA；15:遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌混合DNA；16:遲鈍愛德華氏菌和維氏氣單胞菌混合DNA；17:嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌混合DNA。

泳道1在418bp位置有一條擴(kuò)增條帶，表示樣品為陽(yáng)性，待檢測(cè)樣品中含有肺炎克雷伯氏菌；泳道6在213bp位置有一條擴(kuò)增條帶，表示樣品為陽(yáng)性，待檢測(cè)樣品中含有豚鼠氣單胞菌；泳道11在418bp和213bp位置有兩條擴(kuò)增條帶，表示樣品為陽(yáng)性，待檢測(cè)樣品中同時(shí)含有肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌；泳道2、3、4、5、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17沒有擴(kuò)增條帶，表示樣品為陰性，待檢測(cè)樣品中不含有肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌。

實(shí)施例3肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌雙重PCR方法的靈敏度檢測(cè)

通過肺炎克雷伯氏菌ompC序列和豚鼠氣單胞菌ahal序列基因克隆和濃度調(diào)整，使得肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌DNA最高濃度均為2.5×10⁵pg/μL，后進(jìn)行3倍梯度稀釋制備，直至3.3×10pg/μL。按實(shí)施例1中加入除DNA模板外的其他PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

雙重PCR靈敏性檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，其中，M:DL2000 DNA Marker；1～9分別為：肺炎克雷伯氏菌DNA濃度分別為2.5×10⁵pg/μL,8.3×10⁴pg/μL,2.8×10⁴pg/μL,9.3×10³pg/μL,3.1×10³pg/μL,1.0×10³pg/μL,3.3×10²pg/μL,1.1×10²pg/μL,3.3×10pg/μL；豚鼠氣單胞菌DNA濃度分別為2.5×10⁵pg/μL,8.3×10⁴pg/μL,2.8×10⁴pg/μL,9.3×10³pg/μL,3.1×10³pg/μL,1.0×10³pg/μL,3.3×10²pg/μL,1.1×10²pg/μL,3.3×10pg/μL。

本圖說明建立的雙重PCR體系對(duì)肺炎克雷伯氏菌DNA的檢測(cè)限為3.3×10²pg/μL，對(duì)豚鼠氣單胞菌的檢測(cè)限為1.0×10³pg/μL。

實(shí)施例4肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌雙重PCR的臨床樣本檢測(cè)

根據(jù)實(shí)施例1所述方法，隨機(jī)抽取不同養(yǎng)殖塘口發(fā)病團(tuán)頭魴、鯽、鰱等養(yǎng)殖動(dòng)物，無菌剪取出血病灶組織少許，經(jīng)無菌生理鹽水清洗后進(jìn)行研磨，制備組織勻漿液置于1.5mL無菌離心管中，離心取上清置于1.5mL無菌離心管中。按照動(dòng)物組織DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，并作為檢測(cè)模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)證實(shí)在抽取的患病魚體出血病灶組織處可檢測(cè)出肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌。

臨床樣本檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，其中，M:DL2000 DNA Marker；1:樣品1；2:樣品2；3:樣品3；4:樣品4；5:樣品5；6:樣品6；7:樣品7；8:樣品8；9:樣品9；10:樣品10。

泳道2代表檢測(cè)出肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌，泳道4代表檢測(cè)出豚鼠氣單胞菌，泳道7代表檢測(cè)出肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌，泳道9代表檢測(cè)出肺炎克雷伯氏菌，其余抽檢組織未檢測(cè)出肺炎克雷伯氏菌和豚鼠氣單胞菌，整個(gè)過程簡(jiǎn)單，可大批量檢測(cè)，一般整個(gè)檢測(cè)過程可在短時(shí)間內(nèi)完成。