本發(fā)明屬于工業(yè)中分離纖維素酶的方法，涉及一種從海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法。

背景技術(shù)：

纖維素酶是地球上分布最廣、最廉價(jià)、含量最豐富的多糖類物質(zhì)，對(duì)人類而言，它同時(shí)又是自然界數(shù)量最大的可再生能源，它的降解是自然界碳循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。纖維素酶能夠通過水解作用將纖維素物質(zhì)徹底降解，其水解產(chǎn)物能夠進(jìn)一步發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、氫氣及生產(chǎn)生物柴油的原料油脂等。因此，利用纖維素酶轉(zhuǎn)化纖維素對(duì)于解決目前世界環(huán)境污染以及能源危機(jī)等問題具有十分重要的意義。目前，纖維素酶已被廣泛用于洗滌劑工業(yè)、麻棉混紡織物后整理工業(yè)、食品工業(yè)、飼料工業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，而且取得了良好的效果。

生產(chǎn)纖維素酶的微生物多種多樣，有細(xì)菌、真菌、放線菌等，目前基本上均為陸生微生物，用陸生微生物生產(chǎn)的纖維素酶，其穩(wěn)定性和環(huán)境耐受性一般都不是特別理想，而纖維素植物的降解一般均需要在粗獷的條件下進(jìn)行，其纖維素降解效率常受到限制。海洋微生物由于其環(huán)境所致，具有不同于陸生微生物的獨(dú)特技能。海洋寡養(yǎng)、高鹽的獨(dú)特環(huán)境為孕育出顯著不同于陸生微生物特性的微生物提供了一個(gè)特殊的環(huán)境。生活在寡養(yǎng)環(huán)境的微生物往往具有降解大分子物質(zhì)成為自身可利用的營養(yǎng)物質(zhì)的酶系，纖維素酶的降解為可利用的糖類是寡養(yǎng)環(huán)境里的微生物采用的有限獲取營養(yǎng)的主要方式。

纖維素酶的制取方法有兩種：液體發(fā)酵和固體發(fā)酵，固體發(fā)酵具有液體發(fā)酵沒有的優(yōu)勢(shì)，菌絲能有效附著在固體發(fā)酵基質(zhì)表面，提高發(fā)酵效率、比酶活高，設(shè)備單位體積生產(chǎn)能力高，因此固體發(fā)酵成為發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)化的一個(gè)重要方向。

從發(fā)酵液中分離提取纖維素酶的工業(yè)級(jí)制備方面，柱層析分離方式由于高成本與操作的復(fù)雜性等原因很難有效的放大到工業(yè)規(guī)模。目前，工業(yè)中纖維素酶的分離方法主要有硫酸銨鹽析和乙醇沉淀等。但是硫酸銨鹽析后會(huì)產(chǎn)生大量的鹽較難除去與回收，而乙醇沉淀的成本又相對(duì)較高，從而制約了木質(zhì)纖維素原料及纖維素酶的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)一般提取纖維素酶方法的弊端,提供一種從微生物海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法,本發(fā)明采用改進(jìn)的單寧沉淀法分離提取經(jīng)產(chǎn)纖維素酶微生物發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶,并采用真空冷凍干燥法制備成粉末狀纖維素酶產(chǎn)品,使纖維素酶的回收率能夠達(dá)到90-95％,具有用時(shí)短，能耗小，操作簡(jiǎn)單，纖維素酶收率高的優(yōu)點(diǎn),克服了分離提取 纖維素酶階段在整個(gè)木質(zhì)纖維素制乙醇工藝中成本過高！操作復(fù)雜等難題,適用于纖維素酶工業(yè)化大規(guī)模制備。

本發(fā)明從海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

1、發(fā)酵液澄清：將海洋微生物固態(tài)發(fā)酵7-8天后生產(chǎn)的固態(tài)發(fā)酵液進(jìn)行過濾、離心，得到發(fā)酵澄清液；所述的海洋微生物為海洋黑曲霉菌，Aspergillus sp.ZJUBE2010,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCC NO.M2010132，保藏日期：2010年6月2日；

2、單寧沉淀：將上述發(fā)酵澄清液加入攪拌罐中,以一定的轉(zhuǎn)攪拌一定時(shí)間,將一定量的單寧溶液加入攪拌罐中的發(fā)酵澄清液中,并持續(xù)攪拌一定時(shí)間,然后靜置1-2h，進(jìn)行纖維素酶的沉淀；

3、沉淀收集：將經(jīng)過單寧沉淀的發(fā)酵液以一定的進(jìn)行離心，上清液去掉，收集沉淀；

4、沉淀復(fù)溶：將上述沉淀用一定體積的濃度為20mg/ml的聚乙二醇溶液復(fù)溶，并持續(xù)攪拌一定時(shí)間，然后靜置1-2h，進(jìn)行復(fù)溶；

5、產(chǎn)品收集：將上述溶液，置于離心機(jī)中以一定的轉(zhuǎn)速離心一段時(shí)間，上清液即為濃縮之后的纖維素酶液，將濃縮液置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品。

所述的從海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法中,對(duì)步驟1中得到的所述發(fā)酵澄清液和步驟4中經(jīng)單寧沉淀聚乙二醇解析之后收集到的纖維素酶液分別用濾紙酶活力測(cè)定方法測(cè)定其纖維素酶活力。

所述的從海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法中，步驟2中單寧的用量按照10g/L的用量向發(fā)酵澄清液中添加。

所述的從海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法中步驟2和步驟4中，攪拌的轉(zhuǎn)速為80r/min,攪拌時(shí)間為10min。

所述的從海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法中，步驟3和步驟5中，離心的轉(zhuǎn)速為4000r/min，離心時(shí)間為20min。

所述的從海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法中，步驟4中，聚乙二醇溶液的濃度為20g/L，溶質(zhì)為分子量為6000的PEG，溶劑為自然水。

所述的從海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法中，步驟4中，聚乙二醇溶液的復(fù)溶體積根據(jù)其原發(fā)酵液體積的1/10來定。

所述從海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法中,步驟5中真空冷凍干燥的條件是真空度為9-19Pa，溫度為-50℃～-80℃，抽真空12-36h直至成粉末狀無水分時(shí)為止。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述方法在海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下有益效果：通過采用改進(jìn)的單寧-聚乙二醇法分離提取纖維素酶,并采用真空冷凍干燥法制備成粉末狀纖維素酶產(chǎn)品,使纖維素酶的回收率能夠達(dá)到90-95％,具有用時(shí)短、能耗小、操作簡(jiǎn)單、纖維素酶收率高的優(yōu)點(diǎn),克服了分離提取纖維素酶階段在整個(gè)木質(zhì)纖維素制乙醇工藝中成本過高、操作復(fù)雜等難題。本發(fā)明選用的海洋黑曲霉所具有其抗鹽性、酶系豐富、表達(dá)量高、分泌能力強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，操作簡(jiǎn)單可行，投入設(shè)備成本低，能耗小，收率高，適用于大規(guī)模分離提取纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明,以令本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參閱本說明書后能夠據(jù)以實(shí)施。

所述的海洋微生物為海洋黑曲霉菌，Aspergillus sp.ZJUBE2010,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCC NO.M2010132，保藏日期：2010年6月2日。

實(shí)施例1

一種從海洋黑曲霉微生物發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

1、發(fā)酵液澄清：將海洋黑曲霉固態(tài)發(fā)酵7d-8d左右的發(fā)酵液進(jìn)行5層紗布過濾、在離心機(jī)中以4000r/min，離心20min，得到發(fā)酵澄清液；

2、單寧沉淀：將所述發(fā)酵澄清液加入攪拌罐中,將一定量的單寧加入到所述發(fā)酵澄清液中,以80r/min的轉(zhuǎn)速攪拌10min，靜置1h，進(jìn)行纖維素酶的沉淀；

3、沉淀收集：將經(jīng)過單寧沉淀的發(fā)酵液，以4000r/min，離心20min，將上清液去掉，收集沉淀；

4、沉淀復(fù)溶：將上述沉淀用原體積的1/10的20mg/ml的聚乙二醇溶液復(fù)溶，以80r/min持續(xù)攪拌5min時(shí)間，然后靜置1h，進(jìn)行復(fù)溶；

5、產(chǎn)品收集，將上述復(fù)溶的溶液，置于離心機(jī)中以4000r/min，離心20min，上清液即為濃縮之后的纖維素酶液，將濃縮液置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品。

所述真空冷凍干燥的條件是真空度為9-19Pa，溫度為-50℃～-80℃，抽真空12-36h直至成粉末狀無水分時(shí)為止。

濾紙酶活(FPA)測(cè)定:取50mg(1x6cm)whatman濾紙,加入酶液0.5mL,再加入pH4.8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液2mL,50℃反應(yīng)1h,加入2.5mlDNS終止反應(yīng),沸水浴5min顯色,測(cè)定A54O。

酶活力定義:在上述反應(yīng)條件下,每分鐘催化底物水解生成1umol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位U。

所述的從海洋黑曲霉發(fā)酵液中回收纖維素酶的方法中,對(duì)步驟1中得到的所述發(fā)酵澄清液和步驟3中經(jīng)單寧沉淀收集到纖維素酶沉淀分別用濾紙酶活力測(cè)定方法測(cè)定其纖維素酶活力。

單寧作為纖維素酶的沉淀劑,是應(yīng)用單寧能與纖維素酶蛋白通過氫鍵結(jié)合的原理,并且這種氫鍵的結(jié)合具有可逆性，聚乙二醇可將纖維素酶從酶-單寧復(fù)合物中解析出來，用單寧沉淀法制備的酶制劑不含鹽，純度高，不但符合食用的要求，而且可以作為口服藥用酶制劑，亦可用于紡織加工和發(fā)酵工業(yè)等，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定,利用單寧沉淀纖維素酶后，采用聚乙二醇解析纖維素酶，可以有效地提取粗酶液中的纖維素酶。本發(fā)明操作工藝簡(jiǎn)單可行，投入設(shè)備成本低，能耗小，收率高,適用于大規(guī)模分離提取纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

實(shí)施例2

將海洋黑曲霉固態(tài)發(fā)酵7d的發(fā)酵液先用5層紗布進(jìn)行一級(jí)過濾，再經(jīng)4000r/min的離心機(jī)進(jìn)行離心20min，得到澄清發(fā)酵液。產(chǎn)纖維素酶的微生物發(fā)酵7d-8d左右的發(fā)酵液進(jìn)行過濾、離心，得到發(fā)酵澄清液。

將所述發(fā)酵澄清液加入攪拌罐中，以80r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，稱取單寧加入到所述發(fā)酵澄清液中,使得單寧的濃度為10g/ml,并持續(xù)攪拌10min,靜置1h,進(jìn)行纖維素酶的沉淀。

將經(jīng)過單寧沉淀的發(fā)酵液在離心機(jī)上離心，4000r/min，離心20min，將上清液去掉，收集沉淀。

將上述沉淀用1/10原發(fā)酵液體積的聚乙二醇溶液復(fù)溶，聚乙二醇溶液濃度為20g/L,以80r/min持續(xù)攪拌5min，然后靜置1h.

將上述復(fù)溶的溶液，置于離心機(jī)中以4000r/min，離心20min，上清液即為濃縮之后的纖維素酶液，酶活回收率為96.2％。

采用真空冷凍干燥劑在真空度為10Pa，-50℃條件下凍干30h制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品，測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1，采用國際標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活，酶活回收率為75％。

實(shí)施例3

將海洋黑曲霉固態(tài)發(fā)酵7d的發(fā)酵液先用5層紗布進(jìn)行一級(jí)過濾，再經(jīng)4000r/min的離心機(jī)進(jìn)行離心20min，得到澄清發(fā)酵液。

將所述發(fā)酵澄清液加入攪拌罐中，以80r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，稱取單寧加入到所述發(fā)酵澄清液中，使得單寧的濃度為10g/ml，并持續(xù)攪拌10min，靜置1h，進(jìn)行纖維素酶的沉淀。

將經(jīng)過單寧沉淀的發(fā)酵液在離心機(jī)上離心，4000r/min，離心20min，將上清液去掉，收集沉淀。

將上述沉淀用1/10原發(fā)酵液體積的聚乙二醇溶液復(fù)溶，聚乙二醇溶液濃度為20g/L，以80r/min持續(xù)攪拌5min，然后靜置1h.

將上述復(fù)溶的溶液，置于離心機(jī)中以4000r/min，離心20min，上清液即為濃縮之后的纖維素酶液，測(cè)定酶活率為97.4％。

采用真空冷凍干燥劑在真空度為10Pa，-50℃條件下凍干30h制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品，測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1，采用國際標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活，測(cè)得酶活收率為73％。

實(shí)施例4

將海洋黑曲霉固態(tài)發(fā)酵7d的發(fā)酵液先用5層紗布進(jìn)行一級(jí)過濾，再經(jīng)4000r/min的離心機(jī)，離心20min，得到澄清發(fā)酵液。

將所述發(fā)酵澄清液加入攪拌罐中，以80r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，稱取單寧加入到所述發(fā)酵澄清液中,使得單寧的濃度為10g/ml，并持續(xù)攪拌10min，靜置1h，進(jìn)行纖維素酶的沉淀。

將經(jīng)過單寧沉淀的發(fā)酵液在離心機(jī)上離心，4000r/min，離心20min，將上清液去掉，收集沉淀。

將上述沉淀用1/10原發(fā)酵液體積的聚乙二醇溶液復(fù)溶，聚乙二醇溶液濃度為20g/L，以80r/min持續(xù)攪拌5min，然后靜置1h。

將復(fù)溶液，置于離心機(jī)中以4000r/min，離心20min，上清液即為濃縮之后的纖維素酶液，測(cè)定酶活率為97.9％。

采用真空冷凍干燥劑在真空度為10Pa，-50℃條件下凍干30h制得粉末狀纖維素酶產(chǎn)品，測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1，采用國際標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活，測(cè)得酶活收率為78％。

參照與傳統(tǒng)的硫酸銨沉淀法，在60％飽和度(390g/L)下，硫酸銨沉淀較為完全，將其進(jìn)行冷凍干燥回收，經(jīng)過三次實(shí)驗(yàn)減小誤差，測(cè)定纖維素酶活回收率31.25％，且硫酸銨添加量大，酶活損失嚴(yán)重，相比較于單寧-聚乙二醇法造成回收成本增加，酶活回收率低。比較結(jié)果見表1。

表1