本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)促進(jìn)臍帶血造血干細(xì)胞快速穩(wěn)定增殖的細(xì)胞培養(yǎng)方法

背景技術(shù)：

造血干細(xì)胞移植是臨床上治療嚴(yán)重創(chuàng)傷、惡性血液性疾病、重癥再生障礙性貧血、免疫缺陷綜合征、地中海貧血等疾病的有效手段。自20世紀(jì)80年代末，世界首例臍血造血干細(xì)胞移植成功治療地中海貧血患者及全世界范圍內(nèi)臍血庫的逐步建立、完善以來，臍血以其獨(dú)特而不可替代的優(yōu)勢作為外周血造血干細(xì)胞移植和骨髓移植的良好補(bǔ)充，現(xiàn)已越來越多地用于多種血液系統(tǒng)疾病的治療。目前世界范圍內(nèi)已有超過上萬例的兒童和成人患者接受了UCBT。然而在臨床實(shí)踐中，臍血移植也遇到了障礙。由于臍血造血干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量較少，臍血移植常常只能用于兒童和低體重成人患者，難以滿足成人移植的需要。另外，臍血移植后中性粒細(xì)胞和血小板的恢復(fù)也較骨髓及動(dòng)員的外周血慢。從而限制了其在臨床上的應(yīng)用。

為了擴(kuò)大臍血移植的范圍和加快移植后的中性粒細(xì)胞和血小板的恢復(fù)，就需要對(duì)臍血造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，通過體外擴(kuò)增方法產(chǎn)生足夠的移植給成人的祖細(xì)胞，并且臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增后的細(xì)胞中應(yīng)含有具有長期重建造血活性的造血干細(xì)胞和早期造血祖細(xì)胞。目前常規(guī)的體外擴(kuò)增造血干祖細(xì)胞的方法多為二維培養(yǎng)，是將造血干祖細(xì)胞單個(gè)懸浮培養(yǎng)，依賴于較高劑量多種細(xì)胞因子的聯(lián)合作用培養(yǎng)，或者將造血干細(xì)胞與外源性細(xì)胞因子與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、AGM區(qū)細(xì)胞等與造血相關(guān)的飼養(yǎng)層細(xì)胞混合培養(yǎng)，但此體外擴(kuò)增方法有明顯的局限性，①細(xì)胞僅能在水平線形成單層，難以接近體內(nèi)三維環(huán)境。②二維環(huán)境培養(yǎng)的細(xì)胞在細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，細(xì)胞與底物的相互作用均與生理?xiàng)l件下三維空間體系有異。③攝取營養(yǎng)的限制及細(xì)胞代謝的變化導(dǎo)致細(xì)胞活性的限制等。因此，在這樣的培養(yǎng)體系里擴(kuò)增后的細(xì)胞無法長期重建造血。

HSC在體內(nèi)能很好地維持其自我更新與多向分化的潛能，依賴于體內(nèi)微環(huán)境，包括細(xì)胞因子和造血生長因子，與支持細(xì)胞類型和細(xì)胞外基質(zhì)分子的相互作用，三維空間構(gòu)型等。本研究發(fā)明將造血干細(xì)胞與外源性細(xì)胞因子和飼養(yǎng)層細(xì)胞在三維培養(yǎng)體系下進(jìn)行共培養(yǎng)，可以更充分地模擬體內(nèi)造血微環(huán)境，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此體系培養(yǎng)結(jié)果顯示出強(qiáng)大的體外擴(kuò)增能力，并且具有維持HSC自我更新和多向分化的潛能。鑒于此，本發(fā)明能夠在體外培養(yǎng)過程中快速、穩(wěn)定的擴(kuò)增臍血造血干細(xì)胞，獲得高質(zhì)量的功能性造血干細(xì)胞，對(duì)臨床而言意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種利用三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)促進(jìn)臍帶血造血干細(xì)胞快速穩(wěn)定增殖的細(xì)胞培養(yǎng)方法，解決了臨床上現(xiàn)有技術(shù)的造血干細(xì)胞移植治療中造血干細(xì)胞數(shù)量不足的技術(shù)瓶頸。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種利用三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)促進(jìn)臍帶血造血干細(xì)胞快速穩(wěn)定增殖的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1)提取制備共培時(shí)作為基質(zhì)細(xì)胞使用的細(xì)胞，并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定；2)處理三維培養(yǎng)過程中使用的微載體或其他載體等材料，備用；3)將基質(zhì)細(xì)胞接種到微載體上，在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)；4)待基質(zhì)細(xì)胞增殖到覆蓋微載體表面80％以上后，對(duì)細(xì)胞進(jìn) 行處理，破壞有絲分裂，阻止細(xì)胞增殖；5)制備均質(zhì)的造血干細(xì)胞培養(yǎng)基；6)從臍帶血中分離PBMC，得到PBMC后分選出CD34+細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定；7)將分選得到的CD34+細(xì)胞與經(jīng)過處理的基質(zhì)細(xì)胞在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中加入均質(zhì)的造血干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

所述造血干細(xì)胞是由人臍帶血中分選所得，臍帶血在產(chǎn)婦知情情況下獲得。

所述細(xì)胞三維培養(yǎng)材料包括微載體、海藻、納米材料等。

所述細(xì)胞共培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞包括人的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、AGM區(qū)細(xì)胞等或其他相關(guān)誘導(dǎo)造血分化的基質(zhì)細(xì)胞。

所述破壞細(xì)胞有絲分裂阻止細(xì)胞增殖的方法包括絲裂霉素C處理或射線照射。

所述培養(yǎng)基是指添加10％FBS的IMDM中添加的小分子-芳香烴受體拮抗劑StemRegenin-1(SR1)。

所述培養(yǎng)基是指添加10％FBS的IMDM中添加的SCF、TPO、Flt3L等細(xì)胞因子。

流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34+細(xì)胞比例：分別在剛剛分選之后和在擴(kuò)增培養(yǎng)的過程中，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CD34+表達(dá)情況及所占比例。結(jié)果顯示，本發(fā)明在培養(yǎng)10天后，CD34+增殖了近20倍，且CD34+細(xì)胞的陽性率依然非常高(99％)。

本發(fā)明利用三維培養(yǎng)系統(tǒng)，聯(lián)合共培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞，在SR1和各種細(xì)胞因子的共同作用下，促進(jìn)臍帶血造血干細(xì)胞增殖，建立了快速穩(wěn)定的增殖臍帶血造血干細(xì)胞的方法，本發(fā)明可獲得大量的功能性造血干細(xì)胞，為臨床上解決造血干細(xì)胞移植中細(xì)胞不足的瓶頸問題，提供理論技術(shù)和技術(shù)平臺(tái)。

附圖說明

下面以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為基質(zhì)細(xì)胞，用CULTISPHER-GL作為三維培養(yǎng)的載體，使用流式分選技術(shù)分選CD34+細(xì)胞，聯(lián)合SR1和細(xì)胞因子共培養(yǎng)進(jìn)行說明。

圖1是提取培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長狀態(tài)(P1代，4×)。

圖2是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果。

圖3是經(jīng)過處理的未接種細(xì)胞的微載體(10×)。

圖4是接種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后經(jīng)過絲裂霉素C的微載體(胎盤蘭染色，10×)。

圖5是流式細(xì)胞儀分選示意圖。

圖6是分選后CD34+細(xì)胞檢測圖。

圖7是共培養(yǎng)4天后造血干細(xì)胞狀態(tài)(10×)。

圖8是共培養(yǎng)4天后流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34+細(xì)胞比例。

圖9是共培養(yǎng)7天后造血干細(xì)胞狀態(tài)(10×)。

圖10是共培養(yǎng)7天后流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34+細(xì)胞比例。

圖11是共培養(yǎng)10天后造血干細(xì)胞狀態(tài)(10×)。

圖12是共培養(yǎng)10天后流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34+細(xì)胞比例。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描 述。

一種利用三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)促進(jìn)臍帶血造血干細(xì)胞快速穩(wěn)定增殖的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1.實(shí)施例中的所有材料、試劑等，無特殊說明情況下，均可以從商業(yè)途徑獲得。

2.基質(zhì)細(xì)胞臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定(新生兒臍帶在產(chǎn)婦知情情況下獲得，產(chǎn)婦身體健康。)

1)取出臍帶，在預(yù)先裝有75％酒精的小燒杯中快速浸泡30秒至1分鐘，取出放在150mm的平皿中，PBS洗滌2次，洗去酒精。

2)將臍帶剪成4-5cm小段，PBS清洗2-3遍，去除血管內(nèi)殘留血液。用有齒鑷撕開每段臍帶，小心剝離除去臍帶外皮層和血管(2根動(dòng)脈1根靜脈，靜脈如去不掉也可)，然后用鑷子將臍帶撕成細(xì)絲，越細(xì)越好。

3)將撕碎的臍帶在100ml的小燒杯中用眼科剪剪成碎塊，大約1mm³左右，越碎越好。

4)剪碎的臍帶均分到2支50ml的離心管中，各加入0.2％的I型膠原酶15ml，將2管反復(fù)顛倒混勻。

5)混勻后的2管組織放入CO₂培養(yǎng)箱37℃進(jìn)行消化過夜，期間取出顛倒混勻幾次。

6)I型膠原酶一次消化后(此時(shí)2管組織渾濁，有部分稍大的組織塊未消化完全，且粘度非常大)，向2管組織中加入0.25％胰酶，使胰酶終濃度達(dá)到0.05％，放入CO₂培養(yǎng)箱37℃對(duì)未消化完全的組織塊進(jìn)行進(jìn)一步消化。

7)配制2瓶0.05％的胰酶(400ml PBS加入100ml 0.25％胰酶)各500ml，將經(jīng)過0.05％胰酶和0.2％I型膠原酶消化過的組織(此時(shí)液體已經(jīng)比較澄清透明，除個(gè)別組織塊外均已消化完全)直接加入到上述500ml液體中，每管1瓶。反復(fù)顛倒混勻，放入37℃培養(yǎng)箱，消化60min。

8)取出2瓶液體，輕輕吹打，至組織塊已散，此時(shí)液體仍有一定粘度。取一滴，鏡下觀察細(xì)胞分散情況和細(xì)胞量。

9)將液體移至50ml離心管中，3000rpm，10min離心，離心后棄上清，將沉淀收集至新50ml離心管中。

10)收集2個(gè)500ml瓶中的消化細(xì)胞至4個(gè)50ml離心管中，加PBS至45ml，吹打均勻，1500rpm，6min離心。

11)收集離心后細(xì)胞，重懸至細(xì)胞培養(yǎng)基中。將重懸后細(xì)胞平均接種至2個(gè)150mm培養(yǎng)皿中，每皿加培養(yǎng)基20ml，放入CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，3日內(nèi)不動(dòng)，每日隔窗觀察培養(yǎng)基是否變渾濁(是否污染)即可。

12)接種后第3日，取出細(xì)胞顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，臍帶MSC細(xì)胞貼壁生長，分布均勻，大多呈長梭形或多邊形，有上皮、血細(xì)胞的雜細(xì)胞，拍照。然后給細(xì)胞半換液。

13)待細(xì)胞長至鋪滿培養(yǎng)皿90％時(shí)，消化傳代。然后取P2代細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定。

3.三維培養(yǎng)細(xì)胞支架處理

本實(shí)施例中使用的微載體為商業(yè)化產(chǎn)品CULTISPHER-GL，處理方法如下：稱取微載體0.1g，加入20mlPBS浸泡3-4小時(shí)，換新的20mlPBS浸泡過夜，之后121℃，0.1Mpa，高壓滅菌20min。滅菌后，去掉PBS加入20ml完全培養(yǎng)基浸泡待用。

4.三維共培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞接種、處理

取生長狀態(tài)良好的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，PBS洗滌兩次，每瓶加入胰酶2ml，消 化2min，加入5ml完全培養(yǎng)基終止消化，將消化下來的細(xì)胞吸入離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，離心后將細(xì)胞重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取計(jì)數(shù)后細(xì)胞4×10⁶個(gè)，重懸至30ml。先將微載體混勻全部加入三維培養(yǎng)瓶中，然后將細(xì)胞加入三維培養(yǎng)瓶，混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，儀器設(shè)置為35轉(zhuǎn)/分鐘，運(yùn)轉(zhuǎn)5分鐘，停止15分鐘，12個(gè)循環(huán)，之后再加入培養(yǎng)基50ml終體積100ml，儀器設(shè)置為50轉(zhuǎn)/分鐘，連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)。細(xì)胞終培養(yǎng)密度4×10⁴個(gè)/ml。待細(xì)胞鋪滿微載體表面80％以上時(shí)，加入終濃度10μg/ml的絲裂霉素C對(duì)細(xì)胞處理2小時(shí)，更換新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)待用。

5.造血干細(xì)胞的獲得

本實(shí)施例中，產(chǎn)婦身體健康，臍帶血在產(chǎn)婦知情情況下獲得。

1)將所得臍血3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去除血清。

2)用PBS將離心后沉淀稀釋至離心前體積的兩倍。

3)吸取30ml緩慢加入預(yù)先裝有15ml Ficoll的50ml離心管中。

4)所有血液加好后，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，離心結(jié)束時(shí)緩慢降速。

5)吸取第二層的白膜細(xì)胞層到離心管中，加入30ml PBS洗滌兩次。

6)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照每10⁶個(gè)細(xì)胞加入3μl CD34抗體，進(jìn)行染色，室溫染色20分鐘。染色后，PBS洗滌2遍，將重懸細(xì)胞濃度調(diào)整至10⁷/ml，進(jìn)行分選。分選后細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度。

6.造血干細(xì)胞接種、培養(yǎng)

將分選得到的CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)。棄掉三維培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入造血干細(xì)胞培養(yǎng)基50ml，取CD34+細(xì)胞1.5×10⁶個(gè)，重懸至50ml造血干細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入到三維培養(yǎng)瓶中共培養(yǎng)，儀器設(shè)置為50轉(zhuǎn)/分鐘，連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)。臍血造血干細(xì)胞培養(yǎng)基為含10％FBS的IMDM，添加終濃度為1μM小分子-芳香烴受體拮抗劑StemRegenin-1(SR1)，添加SCF100ng/ml，F(xiàn)lt3L 40ng/ml，TPO 2ng/ml，IL-6 20ng/ml。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，在第4天、第7天、第10天對(duì)培養(yǎng)的造血干細(xì)胞半換液，而后在細(xì)胞混勻后，吸出細(xì)胞培養(yǎng)懸液2ml，200目細(xì)胞篩篩除微載體，放入6孔板中拍照、計(jì)數(shù)。另外吸出2ml，200目細(xì)胞篩篩除微載體，將含有臍帶血造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，PBS洗滌一遍，加入CD34抗體，進(jìn)行染色，4℃染色30分鐘，染色結(jié)束后PBS再洗滌1遍，加入200μl 2％多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測CD34+細(xì)胞百分比。

培養(yǎng)10天后的結(jié)果顯示，CD34+細(xì)胞和低表達(dá)的百分比為99％，與剛分選之后檢測的CD34+百分率相當(dāng)；細(xì)胞濃度為23.6×10⁴個(gè)/ml，為最初培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞濃度的近20倍。