本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細胞的預處理方法，具體涉及一種提高人脂肪來源間充質(zhì)干細胞增殖與遷移能力的預處理方法。

背景技術(shù)：

人脂肪來源間充質(zhì)干細胞(hAD-MSC)是干細胞家族中重要的一類具有再生醫(yī)學應(yīng)用的細胞，其表面表達間充質(zhì)特異性標記CD73、CD90、CD105，不表達CD34、CD43、CD45，可以分化為脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞^[1]。有研究表明將干細胞在體外暴露于低氧環(huán)境，模擬干細胞在受損組織經(jīng)歷的微環(huán)境，可以增強干細胞移植后在體內(nèi)的抵抗力，其它的方案如熱休克處理誘導熱休克蛋白(HSP)表達，或者過氧化氫暴露增加抗氧化應(yīng)激能力。將干細胞種植在3D條件下例如3D聚集體和水凝膠，也提供了有利的微環(huán)境，通過細胞-細胞或細胞-基質(zhì)的相互作用以及干細胞分泌的營養(yǎng)因子的調(diào)節(jié)作用，促進了干細胞在缺血條件下的滯留率和存活率。阻礙上述方法被廣泛接受的原因之一是在預處理所需的參數(shù)較難控制，可能因處理不當造成干細胞的死亡。對增加干細胞移植后在受損組織中的存活率進而不損害組織完整性的非遺傳學操作將被優(yōu)先考慮在干細胞移植前預處理方案中。

周圍環(huán)境中的信號對間充質(zhì)干細胞的功能起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，協(xié)調(diào)諸如增殖、遷移和分化等活動。許多工作都集中在調(diào)節(jié)干細胞功能的生化信號，生物物理刺激的影響正待揭示^[2,3]。光生物調(diào)節(jié)作用(photobiomodulation,PBM)使用光來影響內(nèi)源性酶活性，以引發(fā)細胞信號通路和細胞或組織的代謝改變。PBM通過各種類型的光源，如發(fā)光二極管(LED)和低能量激光(LLL)，發(fā)出的頻譜可以穿透組織但不至于像紫外線的致突變效應(yīng)^[4]。低能量激光近年來作為一種非侵入性的物理療法被臨床用于骨質(zhì)疏松癥的治療，低能量激光可以直接或間接影響骨髓間充質(zhì)干細胞的狀態(tài)^[5]。

因此，亟需開發(fā)一種有助于提高干細胞存活率、簡便、安全、有效的脂肪來源間充質(zhì)干細胞的移植前預處理方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明目的是提供一種人脂肪來源間充質(zhì)干細胞的預處理方法，其包括：

a)提供人脂肪來源間充質(zhì)干細胞；

b)對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行原代培養(yǎng)；

c)對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)；

d)在傳代培養(yǎng)過程中，采用波長660nm±20nm低能量激光照射人脂肪來源間充質(zhì)干細胞，照射劑量為11-16J/cm²；

e)獲得處理后的人脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可以采用本領(lǐng)域任何適合方式來提供人脂肪來源間充質(zhì)干細胞。例如，在一些實施方案中，由成人吸脂術(shù)后，收取無菌脂肪組織，消化分離獲得人脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可以采用本領(lǐng)域任何適合方式和任何適合的培養(yǎng)基對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行原代培養(yǎng)。在一些實施方案中，采用貼壁的培養(yǎng)方式對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行原代培養(yǎng)。在一些實施方案中，在hAD-MSC工作液(DMEM/F12，添加有10ng/ml表皮生長因子、10ng/ml血小板衍生生長因子、1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸、1×亞油酸-牛血清白蛋白、50μM巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、4％胎牛血清、100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸鏈霉素雙抗生素)中對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行原代培養(yǎng)。在本發(fā)明的上下文中，原代培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行的首次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的人脂肪來源間充質(zhì)干細胞稱為P0代。原代培養(yǎng)后進行首次傳代后培養(yǎng)的人脂肪來源間充質(zhì)干細胞稱為P1代或第1代，將P1代進行傳代后培養(yǎng)的人脂肪來源間充質(zhì)干細胞為P2代或第2代。

在一些實施方案中，可以采用本領(lǐng)域任何適合方式和任何適合的培養(yǎng)基對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)。在一些實施方案中，采用貼壁的培養(yǎng)方式對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)。在一些實施方案中，在hAD-MSC工作液中對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)。

在傳代培養(yǎng)過程中，采用波長660nm±20nm低能量激光照射人脂肪來源間充質(zhì)干細胞，照射劑量為11-16J/cm^2，，優(yōu)選15J/cm²。在一個優(yōu)選的實施方案中，對第1-3代的人脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行低能量激光照射。在一個優(yōu)選的實施方案中，對培養(yǎng)至第3代的細胞進行照射，進行細胞增殖、計數(shù)后，可用于干細胞移植。

在具體的實施方案中，可以使用醫(yī)療器械量子血管外照射儀(LXW660-II，沈陽吉星醫(yī)療器械有限公司)對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞照射1h±10min，優(yōu)選1h。具體地，該量子血管外照射儀具有以下技術(shù)參數(shù)：電源：220V±22V，50Hz±1Hz；光輸出波長：660nm±20nm；單點輸出光功率：3mw-4.5mw。

本發(fā)明在另一方面還提供了一種細胞制品，其包含經(jīng)上述的方法預處理的人脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

本發(fā)明在另一方面還提供了一種細胞制品，其包含經(jīng)上述的方法預處理的人脂肪來源間充質(zhì)干細胞；和藥學上可接受的載體。

本發(fā)明在另一方面還提供了上述的細胞制品在制備用于治療移植物抗宿主病、再生障礙性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及多發(fā)性硬化的藥物中的用途。

可見，通過本發(fā)明提供的提高人脂肪來源間充質(zhì)干細胞增殖和遷移能力的預處理方法對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行預處理，可以增加移植前人脂肪來源間充質(zhì)干細胞的存活率和遷移能力。提供了簡便、安全、有效的脂肪來源間充質(zhì)干細胞的移植前預處理方法，用于干細胞移植前預處理方案。

附圖說明

圖1A和圖1B：LLL處理組(圖1A)及對照組(圖1B)的hAD-MSC在顯微鏡下的形態(tài)良好(20X)。

圖2A和圖2B：其中圖2A顯示MTS檢測LLL處理組較對照組hAD-MSC增殖加快；圖2B顯示LLL處理組的細胞數(shù)目倍增時間減少。

圖3：LLL處理組細胞的S期比例上升。

圖4A至圖4E：細胞劃痕實驗檢測LLL處理組劃痕愈合加快。其中，圖4A為使用槍頭進行劃線的LLL處理組的細胞；圖4B為使用槍頭進行劃線后培養(yǎng)12小時的LLL處理組的細胞；圖4C為使用槍頭進行劃線的對照組的細胞；圖4D為使用槍頭進行劃線后培養(yǎng)12小時的對照組的細胞；圖4E顯示LLL處理組和對照組細胞使用槍頭進行劃線后培養(yǎng)12小時后細胞遷移距離的比較。

圖5A至圖5F：Transwell檢測LLL促進hAD-MSC遷移，對侵襲能力無影響。其中，圖5A為LLL處理組培養(yǎng)24小時后基底膜基質(zhì)膠侵襲情況；圖5B為對照組培養(yǎng)24小時后基底膜基質(zhì)膠侵襲情況；圖5C為LLL處理組培養(yǎng)24小時后細胞遷移情況；圖5D為對照組培養(yǎng)24小時后細胞遷移情況；圖5E顯示LLL處理組和對照組細胞基底膜基質(zhì)膠侵襲的比較；圖5F為LLL處理組和對照組細胞遷徙的比較。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖，通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。以下提供了本發(fā)明實施方式中所使用的具體材料及其來源。但是，應(yīng)當理解的是，這些僅僅是示例性的，并不意圖限制本發(fā)明，與如下試劑和儀器的類型、型號、品質(zhì)、性質(zhì)或功能相同或相似的材料均可以用于實施本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1：hAD-MSC的分離及原代培養(yǎng)

hAD-MSC由成人吸脂術(shù)后收取無菌脂肪組織消化分離獲得，成人脂肪樣品取自整形醫(yī)院，所有樣品均與供者簽訂知情同意書。

具體地，吸脂術(shù)采集的脂肪放入含雙抗生素(青霉素、鏈霉素(購自華北制藥廠))的D-Hanks’液(購自北京索萊寶科技有限公司)保存運輸。吸脂術(shù)采集的脂肪組織，用上述含有雙抗生素的D-Hanks’液洗滌2次，去除血細胞及麻藥，800rpm離心3min。將洗滌后的下層液體用移液管吸出，去盡，將脂肪組織轉(zhuǎn)至新的50ml離心管內(nèi)，加入0.2％膠原酶P(購自Sigma)(脂肪:膠原酶P體積比3:1)消化，于37℃恒溫培養(yǎng)震蕩器震蕩30min。加入適量D-Hanks’液將消化后的脂肪組織，100μm細胞濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織，1500rpm離心10min。將上層油脂用移液管吸出后，棄上清，D-Hanks’重懸細胞沉淀，洗滌1次，1500rpm離心10min。棄上清，用12ml含適量100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸鏈霉素雙抗生素hAD-MSC工作液(DMEM/F12(Gibco)添加表皮生長因子(10ng/ml)(Gibco)、血小板衍生生長因子(10ng/ml)(Sigma)、1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸(Gibco)、1×亞油酸-牛血清白蛋白(Gibco)、50μM巰基乙醇(Merck)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，4％胎牛血清(Gibco)重懸細胞，將2×10⁶個細胞接種于T75培養(yǎng)瓶(購自Corning)內(nèi)，于37℃恒溫、5％CO₂飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中，進行原代細胞培養(yǎng)。原代細胞接種24h后，除去上層未貼壁的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2-3天全量換液一次；細胞達80％匯合時，可進行傳代培養(yǎng)或凍存保種。

實施例2：hAD-MSC的傳代培養(yǎng)

將實施例1中獲得的原代培養(yǎng)的hAD-MSC進行傳代培養(yǎng)，具體地，1)當細胞達70％-80％匯合時，棄培養(yǎng)基，D-Hanks’液洗細胞2遍，加入0.25％的胰酶(含0.01％EDTA)消化液(Gibco)，室溫消化，顯微鏡下觀察，待細胞變?yōu)閳A形時，F(xiàn)BS終止胰蛋白酶的作用；

2)用移液管輕輕吹打培養(yǎng)瓶的細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，并收集細胞懸液于15ml離心管內(nèi)，取出少量培養(yǎng)液稀釋至適當倍數(shù)細胞計數(shù)儀計數(shù)，剩余細胞1200rpm離心5min，棄上清；

3)傳代：將細胞重懸于新培養(yǎng)基中，按1:3傳代，接種于新的培養(yǎng)瓶，置于37℃，5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

實施例3：低能量激光(LLL)照射處理

采用低能量激光照射實施例2中傳代培養(yǎng)的hAD-MSC，照射第1代細胞至第3代之間的細胞，直接對貼壁細胞進行照射，照射時間約為1h±10min(照射劑量11-16J/cm²)。具體地，在本實施例中，使用沈陽吉星醫(yī)療器械有限公司LXW660-II型量子血管外照射儀對hAD-MSC進行照射。該量子血管外照射儀的工作條件為：電源220V±22V，50hz±1HZ；光輸出波長660nm±20nm，紅色至近紅外范圍(630-1000nm)，單點光源的輸出功率3mw-4.5mw。所有照射在室溫下超凈臺內(nèi)進行，對照組在相同條件下處理，無激光照射。

實施例4：采用MTS檢測細胞生長曲線及倍增時間實驗

將實施例3中經(jīng)照射后的細胞(第3代，照射后直接實驗)進行接種：用含10％胎小牛血清(購自：Gibco)的DMEM/F12培養(yǎng)液(購自：Gibco)配成單個細胞懸液，以每孔1000個細胞接種到96孔板，每孔體積100μl，設(shè)置照射處理組和對照組。呈色：到達設(shè)計時間點后取樣，每孔加MTS溶液20μl(購自：promega)。37℃培養(yǎng)箱孵育3h。設(shè)空白對照：與試驗孔平行設(shè)置不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。最后比色時，以空白孔調(diào)零。

比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。計算細胞對數(shù)生長期倍增時間(Td＝T×lg2/lg(N/N0)；Td：倍增時間，T：時間間隔，N：終點細胞OD，N0：初始細胞OD)[Td1＝T(72h)×lg2/lg(N96h/N0)，Td2＝T(48h)×lg2/lg(N72h/N0)，Td3＝T(24h)×lg2/lg(N48h/N0)→Td(平均值)+SD]。

實施例5：碘化丙錠(PI)染色流式細胞術(shù)測定細胞周期

接種細胞：采用實施例3中的方法，將第3代hAD-MSC的T75置于量子血管外照射儀下分別處理1h，處理完畢后樣本以2.0×10⁵個/孔接種于6孔板，每孔體積2ml DMEM/F12，每個樣本設(shè)置3個復孔，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞常規(guī)胰酶(購自Gibco)消化后1000rpm離心5min，PBS(0.01mol/L)重懸細胞置于EP管中，1000rpm離心5min，向EP管中逐滴加入-20℃預冷無水乙醇700μl，混勻后于4℃固定過夜。次日上午，1000rpm離心5min，PBS洗2遍，500μl PBS重懸細胞，加RNaseA(購自：北京索萊寶科技有限公司)250μl(終濃度10μg/ml)，置37℃恒溫水浴箱，孵育30min。加12.5μl(終濃度50μg/ml)碘化丙錠(PI)染色，避光孵育1min。BD FACScan(Becton Dickinson)流式細胞儀，汞燈488nm波長激發(fā)光激發(fā)。每個樣品分析10,000個細胞的DNA含量。實驗重復3次。分析細胞周期各時相的細胞百分數(shù)(％)，所得結(jié)果進行t檢驗。

實施例6：細胞劃痕實驗

準備實施例3中經(jīng)照射后的細胞(第3代，照射后直接實驗)：實驗組和對照組按2×10⁵/孔接種于六孔板中。過夜貼壁后觀察細胞生長到70％-80％匯合，用10μl的槍頭進行劃線，顯微鏡下拍照記錄。D-Hanks’液貼壁緩慢加入孔板洗2遍，去除懸浮細胞。加入低血清(1％胎牛血清(FBS)購自：Gibco)的培養(yǎng)基DMEM(購自：Hyclone)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)12h后，于顯微鏡下觀察并拍照，檢測劃痕愈合情況。

實施例7：體外侵襲和遷移實驗

鋪膠(侵襲)：用無血清培養(yǎng)基將基底膜基質(zhì)膠(Matrigel，購自：BD)稀釋10倍，每個小室加30μl，均勻晾干。細胞準備(第3代，照射后直接實驗)：實驗組與對照組細胞按2×10⁵每孔接種于六孔板中，每組3孔。過夜貼壁后觀察細胞生長到70％-80％匯合。水化小室：在上室中加入500μl含1％BSA(購自：碧云天)的無血清高糖DMEM(購自：Hyclone)，放培養(yǎng)箱中孵育2h。從培養(yǎng)箱中取出小室，小心吸去培養(yǎng)液，在下室中加入含10％FBS(作為趨化劑)的培養(yǎng)液。在上室中立即加入以含1％BSA的無血清DMEM培養(yǎng)液(購自Hyclone)重懸的細胞懸液。檢查上室底部與下室接觸液面間沒有氣泡后，將24孔板放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。觀察各組細胞的遷移情況，待遷移(侵襲)最快的小室上表面還有少量未穿過上室膜(或Matrigel)的細胞存在時(約24～48h)終止實驗。以無菌棉棒輕輕揩去上室殘留細胞后，用4％的多聚甲醛固定上室底面的細胞，室溫放置15min。蒸餾水洗去固定液后，結(jié)晶紫染色30min。蒸餾水沖洗后觀察拍照，在40倍或20倍視野下，對膜的上下左右及中間計數(shù)，取平均數(shù)。

實驗結(jié)果

1)光學顯微鏡下觀察LLL處理組和對照組的MSC貼壁生長，呈現(xiàn)成纖維樣細胞的梭形，細胞核清晰，折光率均勻(圖1A和圖1B)。

2)使用LLL分別照射細胞1h后MTS實驗顯示LLL處理能增加細胞增殖能力(圖2A)，同時細胞倍增時間從對照組的19.64±3.63h縮減到12.44±4.48h(圖2B)。

3)通過PI染色測細胞周期，與對照組相比照射后MSC處于S期的細胞(32.47±2.08％對比12.78±1.37，p<0.05)顯著增多，意味著細胞增殖活動加強(圖3)。

4)照射1h后的MSC用于劃痕實驗，采用10μl白色槍尖劃痕細胞，劃好后顯微拍照，繼續(xù)培養(yǎng)12h后觀察劃痕愈合情況。結(jié)果顯示，LLL處理組較對照組劃痕較窄，細胞遷移較快，即照射后細胞愈合能力增強(圖4A至圖4E)。

5)細胞以2x10⁵cell/孔接種于Matrigel處理的8μm transwell(24孔板)上室，或者1x10⁵cell/孔直接接種于8μm transwell(24孔板)上室。實驗組照射1h后，觀察各組細胞，待遷移最快的小室膜上表面還有少量未穿膜的細胞存在時(約24h)終止實驗，固定，染色。結(jié)果顯示：LLL對MSC的侵襲能力沒有影響，但顯著上調(diào)MSC的遷移能力(圖5A至圖5F)。

受傷組織的部位通常與缺血、細胞外基質(zhì)(ECM)降解、氧化應(yīng)激、炎癥和急性免疫反應(yīng)有關(guān)，結(jié)果是干細胞通常顯示出有限的存活率和損傷組織低保留率，降低它們的治療效果。在移植前對干細胞進行激光照射處理可以提高其在細胞療法中的長期效率。這個干細胞的長期存活并整合入受損組織將依靠預處理來增加它在缺氧缺血、營養(yǎng)剝奪與氧化應(yīng)激區(qū)域的長效抵抗。

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