本發(fā)明涉及一種體外痤瘡炎癥模型的建立方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

痤瘡又稱粉刺、青春痘，是一種慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于青少年，發(fā)病率高達(dá)70％-87％。痤瘡累及部位在毛囊皮脂腺，常伴有皮脂溢出，可表現(xiàn)為多種不同的皮損類型，包括粉刺、丘疹、結(jié)節(jié)、膿皰、囊腫、瘢痕等，好發(fā)于頭面、胸、背和肩。痤瘡病因復(fù)雜，但未完全明了，主要有以下四個(gè)方面：(1)皮脂腺過度分泌；(2)毛囊導(dǎo)管阻塞；(3)痤瘡丙酸桿菌感染；(4)炎癥因子的產(chǎn)生和作用。為研究痤瘡，人們模仿痤瘡的發(fā)病機(jī)理制造各種痤瘡動(dòng)物模型，這些模型用于研究痤瘡粉刺的形成抑制和皮脂腺細(xì)胞中雄激素的代謝等研究。

目前的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕畜w內(nèi)動(dòng)物模型和體外模型。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型包括兔耳模型、金黃地鼠模型，犀牛模型和墨西哥無毛犬模型。雖然有許多痤瘡的動(dòng)物模型，但沒有一種完全能模仿人的痤瘡臨床表現(xiàn)和病理改變的模型。動(dòng)物模型主要有四個(gè)方面的問題：(1)痤瘡丙酸桿菌只存在于人體皮膚的表面，動(dòng)物模型沒有看到這種細(xì)菌，需人為接種；(2)動(dòng)物皮脂腺分泌的皮脂和人類的不同，人體皮脂成分的變化與皮脂腺角化異常有關(guān)；(3)動(dòng)物模型痤瘡粉刺形成的機(jī)理和人類是不同的；(4)人類的尋常痤瘡是依賴于雄激素，而動(dòng)物模型是由外用化學(xué)物質(zhì)引起，和人類氯痤瘡相類似。

體外模型主要集中在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和皮脂腺細(xì)胞培養(yǎng)。永生化細(xì)胞系SZ95，SEB-1，和SEB-E6E7細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功克服了以前培養(yǎng)不超過6周的缺點(diǎn)，使得能夠從供體獲得了大量的皮脂腺細(xì)胞成為可能，可是國內(nèi)沒有這三種細(xì)胞株。體外角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)大部分用于藥物的抗炎作用并研究其機(jī)制。從新生兒包皮中分離角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并用加熱滅活P.acnes誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生，但是臨床上新生兒包皮不容易獲得。

由于痤瘡的發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜，單一痤瘡型不能很好的滿足實(shí)驗(yàn)要求，因此人們?nèi)圆粩鄬ふ茵畀彽男履Ｐ汀?/p>

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種原材料易獲得、操作簡單的體外痤瘡炎癥模型的建立方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種體外痤瘡炎癥模型的建立方法，用痤瘡丙酸桿菌感染RAW264.7細(xì)胞，建立炎癥模型。

所述的體外痤瘡炎癥模型的應(yīng)用，用于治療痤瘡藥物的體外活性篩選和活性評(píng)價(jià)。

較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

該體外痤瘡炎癥模型的建立方法不僅操作簡單，而且所用的RAW264.7細(xì)胞株是永生化細(xì)胞株，較體外角質(zhì)形成細(xì)胞更易獲得。

本發(fā)明建立的體外痤瘡炎癥模型可用于研究痤瘡粉刺的形成抑制和皮脂腺細(xì)胞中雄激素的代謝等研究。

本發(fā)明建立的體外痤瘡炎癥模型還可用于治療痤瘡藥物的體外活性篩選和活性評(píng)價(jià)中。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明：

一種體外痤瘡炎癥模型的建立方法，用痤瘡丙酸桿菌感染RAW264.7細(xì)胞，建立炎癥模型。

所述的體外痤瘡炎癥模型的建立方法，它的具體操作步驟如下：

(1)制備痤瘡丙酸桿菌滅活液；

(2)培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，并將培養(yǎng)后的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分為空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組這5個(gè)組；

(3)除空白組外，其他4組均接種相同濃度的痤瘡丙酸桿菌滅活液進(jìn)行感染刺激；

(4)配制5-氨基酮戊酸液；在經(jīng)步驟(3)后的治療一組、治療二組以及治療三組中分別給予等量的不同終濃度的5-氨基酮戊酸液；而經(jīng)步驟(3)后的模型組以及空白組中加入PBS液，其中，PBS液的加入量與治療一組中的5-氨基酮戊酸液加入量相同；之后空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組分別置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h；

(5)給予經(jīng)步驟(4)后的空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組15-20J/cm²的紅光照射，之后吸出舊的培養(yǎng)基，加入0.5-1.5mL新的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-30h后取出；

(6)收集經(jīng)步驟(5)后的空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組中的上清液；

(7)采用ELISA法檢測(cè)步驟(6)所得的上清液中的TNF-α濃度和IL-6濃度。

其中，步驟(1)中制備痤瘡丙酸桿菌滅活液的具體步驟如下：挑取單個(gè)痤瘡丙酸桿菌(痤瘡丙酸桿菌來自廣東省微生物研究所，ATCC6919)的菌落，并接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(所述厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司)中，在37.0-37.5℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)2-4d，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ?jì)數(shù)，以生理鹽水調(diào)配痤瘡丙酸桿菌濃度至2.25×10⁷cells/ml，90.0-98.0℃水滅活10-20min。

步驟(2)中小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng)方法為：將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株(購自上海細(xì)胞生物研究所)按濃度為2.25×10⁵個(gè)/mL接種于黑色6孔板中，每孔1-3mL，置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。

步驟(3)的具體操作方法為：除空白組外，其他4組均給予終濃度為2.25×10⁷cells/ml的痤瘡丙酸桿菌滅活液刺激1-3h，其中痤瘡丙酸桿菌的接種量為感染復(fù)數(shù)MOI＝100：1～1000:1，即痤瘡丙酸桿菌與小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的數(shù)量比為100：1～1000:1。

步驟(4)中，經(jīng)步驟(3)后的治療一組、治療二組以及治療三組中給予的5-氨基酮戊酸液的終濃度分別為0.03、0.06、0.12mmol/L。

步驟(7)中采用ELISA法檢測(cè)上清液中的TNF-α濃度和IL-6濃度的具體步驟為：

a、加樣：在反應(yīng)板中設(shè)置空白孔(無加任何液體)、標(biāo)準(zhǔn)孔以及待測(cè)樣品孔；在標(biāo)準(zhǔn)孔中從左到右加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品TNF-α和IL-6；待測(cè)樣品孔中加入50μL的步驟(6)所得的上清液，反應(yīng)板充分混勻，在36.5-37.5℃之間反應(yīng)30-50分鐘；

b、洗板：反應(yīng)板用洗滌液充分洗滌4-6次，用濾紙印干；

c、除空白孔外，每孔加入蒸餾水50ul和第一抗體工作液50ul，反應(yīng)板充分混勻后置于36.5-37.5℃下反應(yīng)15-25分鐘；

d、洗板：同步驟b；

e、除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100ul，反應(yīng)板充分混勻后置于36.5-37.5℃下反應(yīng)5-15分鐘；

f、洗板：同步驟b；

g、除空白孔外，每孔各加底物工作液100ul，置于36.5-37.5℃暗處，反應(yīng)10-20分鐘；

h、除空白孔外，每孔加終止液100ul，充分混勻，并在20-30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

實(shí)施例一：

一種體外痤瘡炎癥模型的建立方法，它的具體操作步驟如下：

(1)制備痤瘡丙酸桿菌滅活液：挑取單個(gè)痤瘡丙酸桿菌(廣東省微生物研究所，ATCC6919)的菌落，并接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)中，在37.0℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)2d，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ?jì)數(shù)，以生理鹽水調(diào)配痤瘡丙酸桿菌濃度至2.25×10⁷cells/ml，95℃水滅活15min。

(2)將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株(購自上海細(xì)胞生物研究所)，按濃度為2.25×10⁵個(gè)/mL接種于黑色6孔板中，每孔1mL，置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)后的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分為空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組這5個(gè)組；

(3)除空白組外，其他4組均給予終濃度為2.25×10⁷cells/ml的痤瘡丙酸桿菌滅活液刺激1h，其中痤瘡丙酸桿菌的接種量為感染復(fù)數(shù)MOI＝100：1。

(4)配制5-氨基酮戊酸液；在經(jīng)步驟(3)后的治療一組、治療二組以及治療三組中給予等量的終濃度分別為0.03、0.06、0.12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；而經(jīng)步驟(3)后的模型組以及空白組中加入PBS液，其中，PBS液的加入量與治療一組中的5-氨基酮戊酸液的加入量相同；之后空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組分別置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h；

其中所述5-氨基酮戊酸液的配制方法為：稱取15.7mg 5-氨基酮戊酸散(購自上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司)，用10ml PBS溶液溶解，得12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；

(5)給予經(jīng)步驟(4)后的空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組15J/cm²的紅光照射，之后吸出舊的培養(yǎng)基，加入0.5mL新的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10h后取出；所述培養(yǎng)基為厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基。

(6)收集經(jīng)步驟(5)后的空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組中的上清液；

(7)采用ELISA法檢測(cè)步驟(6)所得的上清液中的TNF-α濃度和IL-6濃度。

其中，步驟(7)中采用ELISA法檢測(cè)上清液中的TNF-α濃度和IL-6濃度的具體步驟為：

a、加樣：在反應(yīng)板中設(shè)置空白孔(無加任何液體)、標(biāo)準(zhǔn)孔以及待測(cè)樣品孔；在標(biāo)準(zhǔn)孔中從左到右加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品TNF-α和標(biāo)準(zhǔn)品IL-6；待測(cè)樣品孔中加入50μL的步驟(6)所得的上清液，反應(yīng)板充分混勻，在36.5℃下反應(yīng)30分鐘；

其中，所述的標(biāo)準(zhǔn)品TNF-α和標(biāo)準(zhǔn)品IL-6來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒；標(biāo)準(zhǔn)品TNF-α的濃度為：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL；標(biāo)準(zhǔn)品IL-6的濃度為：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL

b、洗板：反應(yīng)板用洗滌液充分洗滌4次，用濾紙印干；其中，所述的洗滌液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒。

c、除空白孔外，每孔加入蒸餾水50ul和第一抗體工作液50ul，反應(yīng)板充分混勻后置于36.5℃下反應(yīng)15分鐘；其中，所述第一抗體工作液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒。

d、洗板：同步驟b；

e、除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)抗體工作液(所述酶標(biāo)抗體工作液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒)100ul，反應(yīng)板充分混勻后置于36.5℃下反應(yīng)5分鐘；

f、洗板：同步驟b；

g、除空白孔外，每孔各加底物工作液(底物工作液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒)100ul，置于36.5℃暗處，反應(yīng)10分鐘；

h、除空白孔外，每孔加終止液(終止液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒)100ul，充分混勻，并在20分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

實(shí)施例一的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1、空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組的TNF-α的濃度分別為0.24±0.01、0.34±0.02、0.04±0.01、0.03±0.01、0.03±0.01pg/mL，F(xiàn)(方差值)＝1123.636，P(概率)＝0.001，說明這5個(gè)數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。進(jìn)一步用Tambane’S T2檢驗(yàn)，模型組和空白組比較，P＝0.006，有顯著性差異；治療一組和模型組比較，P＝0.001，有顯著性差異；治療二組和空白組比較，P＝0.001，有顯著性差異；治療三組和治療一組比較，P＝0.440，無顯著性差異。

2、空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組的IL-6的濃度分別為0.01±0.01、0.21±0.03、0.09±0.01、0.08±0.01、0.07±0.01pg/ml，F(xiàn)＝114.813，P＝0.001，說明這5個(gè)數(shù)據(jù)之間有顯著性差異。進(jìn)一步用Tambane’S T2檢驗(yàn)，模型組和空白組比較，P＝0.009，有顯著性差異；治療二組和模型組比較，P＝0.031，有顯著性差異；治療三組和治療一組比較，P＝0.003，有顯著性差異。

結(jié)論：用痤瘡丙酸桿菌滅活液感染RAW264.7細(xì)胞，在感染后的1h采用ELISA法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6和TNF-α的吸光度，同時(shí)以PBS刺激為陰性對(duì)照，TNF-α和IL-6較空白組高，說明造模成功。

實(shí)施例二：

一種體外痤瘡炎癥模型的建立方法，它的具體操作步驟如下：

(1)制備痤瘡丙酸桿菌滅活液：挑取單個(gè)痤瘡丙酸桿菌(廣東省微生物研究所，ATCC6919)的菌落，并接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)中，在37.5℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)4d，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ?jì)數(shù)，以生理鹽水調(diào)配痤瘡丙酸桿菌濃度至2.25×10⁷cells/ml，90℃水滅活20min。

(2)將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株(購自上海細(xì)胞生物研究所)，按濃度為2.25×10⁵個(gè)/mL接種于黑色6孔板中，每孔3mL，置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)后的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分為空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組這5個(gè)組；

(3)除空白組外，其他4組均給予終濃度為2.25×10⁷cells/ml的痤瘡丙酸桿菌滅活液刺激3h，其中痤瘡丙酸桿菌的接種量為感染復(fù)數(shù)MOI＝1000：1。

(4)配制5-氨基酮戊酸液；在經(jīng)步驟(3)后的治療一組、治療二組以及治療三組中給予等量的終濃度分別為0.03、0.06、0.12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；而經(jīng)步驟(3)后的模型組以及空白組中加入PBS液，其中，PBS液的加入量與治療一組中的5-氨基酮戊酸液加入量相同；之后空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組分別置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h；

其中所述5-氨基酮戊酸液的配制方法為：稱取15.7mg 5-氨基酮戊酸散(購自上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司)，用10ml PBS溶液溶解，得12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；

(5)給予經(jīng)步驟(4)后的空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組20J/cm²的紅光照射，之后吸出舊的培養(yǎng)基，加入1.5mL新的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30h后取出；所述培養(yǎng)基為厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基。

(6)收集經(jīng)步驟(5)后的空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組中的上清液；

(7)采用ELISA法檢測(cè)步驟(6)所得的上清液中的TNF-α濃度和IL-6濃度。

其中，步驟(7)中采用ELISA法檢測(cè)上清液中的TNF-α濃度和IL-6濃度的具體步驟為：

a、加樣：在反應(yīng)板中設(shè)置空白孔(無加任何液體)、標(biāo)準(zhǔn)孔以及待測(cè)樣品孔；在標(biāo)準(zhǔn)孔中從左到右加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品TNF-α和標(biāo)準(zhǔn)品IL-6；待測(cè)樣品孔中加入50μL的步驟(6)所得的上清液，反應(yīng)板充分混勻，在37.5℃下反應(yīng)50分鐘；

其中，所述的標(biāo)準(zhǔn)品TNF-α和標(biāo)準(zhǔn)品IL-6來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒；標(biāo)準(zhǔn)品TNF-α的濃度為：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL；標(biāo)準(zhǔn)品IL-6的濃度為：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL

b、洗板：反應(yīng)板用洗滌液充分洗滌6次，用濾紙印干；其中，所述的洗滌液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒。

c、除空白孔外，每孔加入蒸餾水50ul和第一抗體工作液50ul，反應(yīng)板充分混勻后置于37.5℃下反應(yīng)25分鐘；其中，所述第一抗體工作液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒。

d、洗板：同步驟b；

e、除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)抗體工作液(所述酶標(biāo)抗體工作液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒)100ul，反應(yīng)板充分混勻后置于37.5℃下反應(yīng)15分鐘；

f、洗板：同步驟b；

g、除空白孔外，每孔各加底物工作液(底物工作液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒)100ul，置于37.5℃暗處，反應(yīng)20分鐘；

h、除空白孔外，每孔加終止液(終止液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒)100ul，充分混勻，并在30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

實(shí)施例二的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1、空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組的TNF-α的濃度分別為0.22±0.01、0.32±0.02、0.05±0.01、0.04±0.01、0.03±0.01pg/mL，F(xiàn)(方差值)＝1023.821，P(概率)＝0.001，說明這5個(gè)數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。進(jìn)一步用Tambane’S T2檢驗(yàn)，模型組和空白組比較，P＝0.005，有顯著性差異；治療一組和模型組比較，P＝0.003，有顯著性差異；治療二組和空白組比較，P＝0.002，有顯著性差異；治療三組和治療一組比較，P＝0.432，無顯著性差異。

2、空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組的IL-6的濃度分別為0.01±0.01、0.30±0.03、0.10±0.01、0.08±0.01、0.06±0.01pg/ml，F(xiàn)＝105.721，P＝0.001，說明這5組數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。進(jìn)一步用Tambane’S T2檢驗(yàn)，模型組和空白組比較，P＝0.008，有顯著性差異；治療二組和模型組比較，P＝0.023，有顯著性差異；治療三組和治療一組比較，P＝0.002，有顯著性差異。

結(jié)論：用痤瘡丙酸桿菌滅活液感染RAW264.7細(xì)胞，在感染后的3h采用ELISA法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6和TNF-α的吸光度，同時(shí)以PBS刺激為陰性對(duì)照，TNF-α和IL-6較空白組高，說明造模成功。

實(shí)施例三：

一種體外痤瘡炎癥模型的建立方法，它的具體操作步驟如下：

(1)制備痤瘡丙酸桿菌滅活液：挑取單個(gè)痤瘡丙酸桿菌(廣東省微生物研究所，ATCC6919)的菌落，并接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)中，在37.2℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)3d，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ?jì)數(shù)，以生理鹽水調(diào)配痤瘡丙酸桿菌濃度至2.25×10⁷cells/ml，98℃水滅活10min。

(2)將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株(購自上海細(xì)胞生物研究所)，按濃度為2.25×10⁵個(gè)/mL接種于黑色6孔板中，每孔2mL，置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)后的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分為空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組這5個(gè)組；

(3)除空白組外，其他4組均給予終濃度為2.25×10⁷cells/ml的痤瘡丙酸桿菌滅活液刺激2h，其中痤瘡丙酸桿菌的接種量為感染復(fù)數(shù)MOI＝100：1。

(4)配制5-氨基酮戊酸液；在經(jīng)步驟(3)后的治療一組、治療二組以及治療三組中給予等量的終濃度分別為0.03、0.06、0.12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；而經(jīng)步驟(3)后的模型組以及空白組中加入PBS液，其中，PBS液的加入量與治療一組中的5-氨基酮戊酸液加入量相同；之后空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組分別置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h；

其中所述5-氨基酮戊酸液的配制方法為：稱取15.7mg 5-氨基酮戊酸散(購自上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司)，用10ml PBS溶液溶解，得12mmol/L的5-氨基酮戊酸液；

(5)給予經(jīng)步驟(4)后的空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組18J/cm²的紅光照射，之后吸出舊的培養(yǎng)基，加入1mL新的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后取出；所述培養(yǎng)基為厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基。

(6)收集經(jīng)步驟(5)后的空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組中的上清液；

(7)采用ELISA法檢測(cè)步驟(6)所得的上清液中的TNF-α濃度和IL-6濃度。

其中，步驟(7)中采用ELISA法檢測(cè)上清液中的TNF-α濃度和IL-6濃度的具體步驟為：

a、加樣：在反應(yīng)板中設(shè)置空白孔(無加任何液體)、標(biāo)準(zhǔn)孔以及待測(cè)樣品孔；在標(biāo)準(zhǔn)孔中從左到右加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品TNF-α和標(biāo)準(zhǔn)品IL-6；待測(cè)樣品孔中加入50μL的步驟(6)所得的上清液，反應(yīng)板充分混勻，在37℃下反應(yīng)40分鐘；

其中，所述的標(biāo)準(zhǔn)品TNF-α和標(biāo)準(zhǔn)品IL-6來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒；標(biāo)準(zhǔn)品TNF-α的濃度為：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL；標(biāo)準(zhǔn)品IL-6的濃度為：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，0.078ng/mL，0ng/mL

b、洗板：反應(yīng)板用洗滌液充分洗滌5次，用濾紙印干；其中，所述的洗滌液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒。

c、除空白孔外，每孔加入蒸餾水50ul和第一抗體工作液50ul，反應(yīng)板充分混勻后置于37℃下反應(yīng)20分鐘；其中，所述第一抗體工作液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒。

d、洗板：同步驟b；

e、除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)抗體工作液(所述酶標(biāo)抗體工作液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒)100ul，反應(yīng)板充分混勻后置于37℃下反應(yīng)10分鐘；

f、洗板：同步驟b；

g、除空白孔外，每孔各加底物工作液(底物工作液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒)100ul，置于37℃暗處，反應(yīng)15分鐘；

h、除空白孔外，每孔加終止液(終止液來自上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的小鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒)100ul，充分混勻，并在25分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

實(shí)施例三的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1、空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組的TNF-α的濃度分別為0.22±0.01、0.35±0.03、0.05±0.01、0.04±0.01、0.03±0.01pg/mL，F(xiàn)(方差值)＝1223.726，P(概率)＝0.001，說明這5組數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。進(jìn)一步用Tambane’S T2檢驗(yàn)，模型組和空白組比較，P＝0.007，有顯著性差異；治療一組和模型組比較，P＝0.002，有顯著性差異；治療二組和空白組比較，P＝0.002，有顯著性差異；治療三組和治療一組比較，P＝0.520，無顯著性差異。

2、空白組、模型組、治療一組、治療二組以及治療三組的IL-6的濃度分別為0.02±0.01、0.24±0.03、0.10±0.02、0.08±0.01、0.05±0.01pg/ml，F(xiàn)＝124.750，P＝0.001，說明這5組數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。進(jìn)一步用Tambane’S T2檢驗(yàn)，模型組和空白組比較，P＝0.008，有顯著性差異；治療二組和模型組比較，P＝0.026，有顯著性差異；治療三組和治療一組比較，P＝0.004，有顯著性差異。

結(jié)論：用痤瘡丙酸桿菌滅活液感染RAW264.7細(xì)胞，在感染后的2h采用ELISA法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6和TNF-α的吸光度，同時(shí)以PBS刺激為陰性對(duì)照，TNF-α和IL-6較空白組高，說明造模成功。