本發(fā)明屬于生物大分子分離分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料及其制備方法及和在細(xì)胞捕獲中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來對于腫瘤細(xì)胞分離的研究受到了極大地關(guān)注。研究表明，不同種類的腫瘤細(xì)胞可以被用作預(yù)測標(biāo)志物，而對它們的檢測可以反映出實(shí)體腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和進(jìn)展，有利于腫瘤的及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及早診斷和有效治療，因此發(fā)展出高效率、高靈敏度的方法分離腫瘤細(xì)胞就成為關(guān)鍵步驟，為其后續(xù)檢測提供了無限可能。

隨著人們對腫瘤細(xì)胞分離研究的不斷深入，涌現(xiàn)出了種類繁多的新技術(shù)和新方法用于捕獲和檢測腫瘤細(xì)胞。根據(jù)分離機(jī)理的不同，這些新技術(shù)新方法可以分為物理分離和生物親和分離：物理分離法富集腫瘤細(xì)胞主要利用的是腫瘤細(xì)胞的尺寸、密度和變形性不同于正常血細(xì)胞，這種方法簡單便捷，但是特異性和靈敏度均較差，限制了其實(shí)際應(yīng)用；生物親和分離法富集腫瘤細(xì)胞則是通過引入抗體、適配體等可與細(xì)胞膜表面特異性作用的生物分子來實(shí)現(xiàn)，此方法效率高、特異性強(qiáng)、對細(xì)胞損傷小，更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。免疫磁球具有易合成、易分離的優(yōu)勢，是細(xì)胞捕獲的優(yōu)良基底，通過對免疫磁球的修飾可改善其性能，有利于實(shí)現(xiàn)高選擇性和高靈敏度的細(xì)胞捕獲。

為達(dá)到高效快速分離腫瘤細(xì)胞并降低非特異性吸附對捕獲干擾的目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)并制備了一種抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料，大大提高了材料的親水性和抗體的修飾量，石墨烯薄膜的平面結(jié)構(gòu)大大降低了材料的非特異性吸附作用，保證了材料的高效捕獲和特異性識(shí)別，具有巨大的臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種高選擇性和高靈敏度的抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料及其制備方法和在細(xì)胞捕獲中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料，為均勻固定在雙面膠上的二維石墨烯薄膜，殼聚糖與樹枝狀大分子通過交聯(lián)反應(yīng)分步修飾于薄膜表面，最后通過碳二亞胺交聯(lián)法將anti-EpCAM抗體偶聯(lián)，即得到功能化的薄膜材料。其中，作為基底的石墨烯薄膜，結(jié)合了石墨烯的理化特性與平面基底相對于納米材料具有低吸附性的特點(diǎn)。本發(fā)明材料通過引入含128個(gè)伯氨基的樹枝狀分子，大大增強(qiáng)了抗體的修飾量，從而達(dá)到特異性識(shí)別和高效捕獲的目的，同時(shí)殼聚糖與樹枝大分子均為親水分子，使得材料具備超親水性；利用抗原-抗體的特異性結(jié)合，將目標(biāo)細(xì)胞成功分離。

本發(fā)明提出的抗體修飾的親水石墨烯薄膜的制備方法，首先，將石墨烯薄膜利用粘附性均勻固定于雙面膠基底；然后，通過偶聯(lián)反應(yīng)包覆一層殼聚糖，再將樹枝狀分子（PAMAM dendrimer 5.0）通過戊二醛交聯(lián)法與殼聚糖枝接；最后，將抗體通過碳二亞胺共價(jià)偶聯(lián)的方法修飾于石墨烯薄膜材料表面，形成具有免疫識(shí)別和捕獲功能的薄膜材料。

本發(fā)明提出的抗體修飾的親水石墨烯薄膜的制備方法，具體步驟如下：

（1）石墨烯薄膜基底合成：裁切1.2*1.2 cm²的雙面膠，平鋪粘貼于24孔板的一孔中，向每孔加入400-600 μL的0.5-2.0 mg/mL石墨烯乙醇溶液，置于搖床中，30-40℃，反應(yīng)16-24 h后用乙醇和水交替清洗材料，得到均勻分散的石墨烯薄膜基底材料；

（2）殼聚糖包覆的石墨烯薄膜材料的合成：向步驟（1）制備的石墨烯薄膜材料中加入含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS）的混合溶液300-500 μL，于30-37℃活化羧基0.3-1.0 h，EDC與NHS用量比為1:1-1:2，然后向活化后的材料加入50-150 μL殼聚糖的醋酸溶液，醋酸濃度為1%-3%，殼聚糖濃度為5-10 mg/mL，反應(yīng)12-16 h后，用PBS將材料洗凈，得到殼聚糖包覆的石墨烯薄膜材料；

（3）樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜的合成：采用戊二醛交聯(lián)法將樹枝狀分子修飾在殼聚糖包覆的石墨烯薄膜上，即：先用5%-25%戊二醛的PBS溶液，活化步驟（2）得到的殼聚糖包覆的石墨烯薄膜1-3 h，用PBS清洗后，加入0.5-4.0 μL的樹枝狀分子（PAMAM dendrimer5.0）溶液，30-37℃偶聯(lián)3-6 h，然后用含1%-2% 氰基硼氫化鈉的PBS溶液封端0.5-2 h，最后用PBS洗凈，即得到樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜；

（4）抗體的修飾：采用碳二亞胺共價(jià)偶聯(lián)的方法將上皮細(xì)胞粘附分子抗體（anti-EpCAM）修飾于表面為樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜上，即：首先配制得到濃度在5-20 μg/mL的抗體溶液，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS），再將上述混合溶液加入步驟（3）得到的樹枝狀分子修飾的親水薄膜材料中，25-37℃偶聯(lián)12-20 h，即可得到抗體修飾的樹枝狀分子親水石墨烯薄膜，其作為細(xì)胞捕獲的基底；其中：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS）的用量比為1:1-1:2。

本發(fā)明所述制備方法得到的抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料，可應(yīng)用于對前列腺癌細(xì)胞DU145、人宮頸癌細(xì)胞Hela的捕獲。由于材料有anti-EpCAM，因此材料對于細(xì)胞膜表面上皮細(xì)胞粘附分子過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞有高效捕獲效果，如前列腺癌細(xì)胞DU145；而對于上皮細(xì)胞粘附分子低表達(dá)的細(xì)胞捕獲效率極低，如人宮頸癌細(xì)胞Hela，表明材料具備特異性。

本發(fā)明中，抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料捕獲腫瘤細(xì)胞的操作步驟為：向含材料的24孔板的每孔中加入0.5 mL 腫瘤細(xì)胞如DU145的懸浮液，細(xì)胞密度為10⁵-10⁶，在培養(yǎng)箱孵育5-90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，計(jì)算細(xì)胞的捕獲效率。對捕獲后的細(xì)胞進(jìn)行戊二醛固定，并經(jīng)乙醇梯度脫水后，冷凍干燥，拍攝掃描電子顯微鏡（SEM）觀察。

本發(fā)明所述制備方法得到的抗體修飾的親水石墨烯薄膜材料在高效捕獲細(xì)胞膜含抗體所對應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于石墨烯薄膜材料具有二維平面結(jié)構(gòu)，有助于消除非特異性吸附對于捕獲的干擾，同時(shí)可通過技術(shù)方法的轉(zhuǎn)變使石墨烯薄膜吸附于多種平面基底上；采用共價(jià)偶聯(lián)的方法改變材料表面修飾的抗體，則可高效捕獲細(xì)胞膜含抗體所對應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞。

細(xì)胞捕獲的操作步驟為：向含材料的24孔板的每孔中加入0.5 mL 腫瘤細(xì)胞如DU145的懸浮液，細(xì)胞密度為10⁵-10⁶，在培養(yǎng)箱孵育5-90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，計(jì)算細(xì)胞的捕獲效率。對捕獲后的細(xì)胞進(jìn)行戊二醛固定，并經(jīng)乙醇梯度脫水后，冷凍干燥，拍攝掃描電子顯微鏡（SEM）觀察。為驗(yàn)證材料的低吸附性，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分別用未經(jīng)修飾的石墨烯薄膜、經(jīng)抗體修飾的親水石墨烯薄膜、未經(jīng)修飾的磁性石墨烯粉末、經(jīng)抗體修飾的親水磁性石墨烯粉末在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明經(jīng)抗體修飾后的石墨烯薄膜與磁性石墨烯捕獲效率差別不大，而較磁性石墨烯粉末而言，未經(jīng)修飾的石墨烯薄膜對腫瘤細(xì)胞的非特異性吸附作用極低，表面平面結(jié)構(gòu)材料相對于三維納米材料具有地吸附性能，可保證特異性捕獲到的細(xì)胞的純度。同時(shí)，還探究了孵育時(shí)間對細(xì)胞捕獲效率的影響，發(fā)現(xiàn)45min可實(shí)現(xiàn)DU145的高效捕獲。

通過上述步驟成功實(shí)現(xiàn)了抗體修飾的親水石墨烯薄膜的制備及應(yīng)用，材料的進(jìn)一步表征通過掃描電子顯微鏡（SEM）、紫外吸收光譜（UV）等說明。

實(shí)驗(yàn)表明，這種經(jīng)由抗體和樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜可特異性識(shí)別并捕獲腫瘤細(xì)胞，在45分鐘內(nèi)可達(dá)到85% ± 3%的捕獲效率，同時(shí)避免非特異吸附對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。本發(fā)明利用無模板，低成本，低毒性材料，將其應(yīng)用于細(xì)胞捕獲，新穎便捷，實(shí)用高效，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。

附圖說明

圖1石墨烯薄膜材料SEM表征圖。

圖2石墨烯薄膜材料在24孔板上的合成效果圖。

圖3孵育時(shí)間對捕獲效率的影響。

圖4未未經(jīng)修飾的石墨烯薄膜、經(jīng)抗體修飾的親水石墨烯薄膜、未經(jīng)修飾的磁性石墨烯粉末、經(jīng)抗體修飾的親水磁性石墨烯粉末捕獲效率對比圖。其中：（a）為四種材料的捕獲效率圖，（b）為未經(jīng)修飾的石墨烯薄膜捕獲細(xì)胞后的SEM圖，(c) 為抗體修飾的親水石墨烯薄膜捕獲細(xì)胞后的SEM圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：上皮細(xì)胞粘附分子抗體修飾的樹枝狀分子輔助親水石墨烯薄膜作為細(xì)胞捕獲基底的合成

裁切1.2*1.2 cm²的雙面膠，平鋪粘貼于24孔板的一孔，向每孔加入500 μL的1 mg/mL石墨烯乙醇溶液，置于搖床中，37 ℃，反應(yīng)24 h后用乙醇/水交替清洗材料，得到均勻分散的石墨烯薄膜基底材料；向上述制備的石墨烯薄膜材料中加入含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS）的混合溶液400μL，于37℃活化羧基0.5 h，EDC與NHS用量比為1:1.5，然后向活化后的材料加入100 μL殼聚糖的醋酸溶液，醋酸濃度為2%，殼聚糖濃度為10 mg/mL，反應(yīng)14 h后，用PBS將材料洗凈，得到殼聚糖包覆的石墨烯薄膜材料；采用戊二醛交聯(lián)法將樹枝狀分子修飾在殼聚糖包覆的石墨烯薄膜上，即：先用5%戊二醛的PBS溶液400μL，于37℃反應(yīng)2h，活化殼聚糖包覆的石墨烯薄膜，用PBS清洗后，加入2.0 μL的樹枝狀分子（PAMAM dendrimer 5.0）溶液，37℃偶聯(lián)4 h，然后用含1%氰基硼氫化鈉的PBS溶液封端1 h，最后用PBS洗凈，即得到樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜；采用碳二亞胺共價(jià)偶聯(lián)的方法將上皮細(xì)胞粘附分子抗體（anti-EpCAM）修飾于表面為樹枝狀分子修飾的親水石墨烯薄膜上，即：首先配制得到濃度10 μg/mL的抗體溶液并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS），用量比為1:1.5，再將上述混合溶液加入樹枝狀分子修飾的親水薄膜材料中，37℃偶聯(lián)16 h，即可得到抗體修飾的樹枝狀分子親水石墨烯薄膜作為細(xì)胞捕獲的基底。

實(shí)施例2：抗體修飾的石墨烯薄膜材料在高效捕獲前列腺癌細(xì)胞DU145中的應(yīng)用

向含材料的24孔板的每孔中加入0.5 mL DU145的懸浮液，細(xì)胞密度為10⁵，在培養(yǎng)箱孵育45 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，計(jì)算細(xì)胞的捕獲效率。對捕獲后的細(xì)胞用2.5%戊二醛溶液浸泡固定，并經(jīng)乙醇梯度（梯度分別設(shè)置為5%，15%，30%，45%，60%，75%，90%，100%）脫水后，冷凍干燥，拍攝掃描電子顯微鏡（SEM）觀察。

附圖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)采用文字的形式列于下方，補(bǔ)充：

圖1為石墨烯薄膜材料SEM表征圖，改材料具有花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)；

圖2為石墨烯薄膜材料在24孔板上的合成效果圖，圖中黑色的方塊即為雙面膠固定得到的石墨烯薄膜，其中石墨烯分散均勻，材料為薄層材料；

圖3為孵育時(shí)間對捕獲效率的影響，在0-45min內(nèi)隨時(shí)間的延長，捕獲效率也相應(yīng)提高，在45min時(shí)達(dá)到捕獲效率最大值，此后隨著時(shí)間的延長，捕獲效率變動(dòng)不大，因此可得出結(jié)論，材料在孵育45min后即可高效捕獲腫瘤細(xì)胞；

圖4為未未經(jīng)修飾的石墨烯薄膜、經(jīng)抗體修飾的親水石墨烯薄膜、未經(jīng)修飾的磁性石墨烯粉末、經(jīng)抗體修飾的親水磁性石墨烯粉末捕獲效率對比圖。其中：（a）為四種材料的捕獲效率圖，（b）為未經(jīng)修飾的石墨烯薄膜捕獲細(xì)胞后的SEM圖，基本上找不到吸附的腫瘤細(xì)胞，（c）為抗體修飾的親水石墨烯薄膜捕獲細(xì)胞后的SEM圖，有很多腫瘤細(xì)胞通過特異性作用結(jié)合到材料表面。通過對比實(shí)驗(yàn)，未經(jīng)修飾的石墨烯薄膜的非特異性吸附作用極低，不會(huì)對捕獲實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾，而三維結(jié)構(gòu)的磁性石墨烯材料非特異性吸附作用極高，不利于高效特異性捕獲細(xì)胞；兩種基底修飾抗體后都可高效捕獲腫瘤細(xì)胞；因此石墨烯薄膜材料的二維結(jié)構(gòu)利于降低吸附、提高特異性，與我們的設(shè)計(jì)理念吻合。