本發(fā)明涉及一種人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

視網(wǎng)膜退行性病變是引起不可逆致盲眼病的主要病因，其中主要包括年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、Stargardt病。其中年齡相關(guān)性黃斑變性患者，全球大約有3千萬(wàn)到5千萬(wàn)，而視網(wǎng)膜色素變性患者約1百萬(wàn)。目前我國(guó)的年齡相關(guān)性黃斑變性患者大約超過(guò)2000萬(wàn)人，并預(yù)計(jì)將在2050年增加一倍。

由于視網(wǎng)膜退行性病變主要表現(xiàn)為黃斑區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium, RPE)的損傷，因此再生醫(yī)學(xué)RPE細(xì)胞的替代移植治療成為治療研究的主要方向。迄今已報(bào)道了多種來(lái)源的RPE細(xì)胞移植，主要有患者自體RPE細(xì)胞移植、虹膜色素上皮細(xì)胞(Iris Pigment Epithelium, IPE)移植，胚胎和成人RPE細(xì)胞移植，以及胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)來(lái)源的RPE細(xì)胞移植。這些細(xì)胞移植在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均顯示出明確的治療作用，但是又均存在各自的缺陷?；颊咦泽wRPE移植手術(shù)復(fù)雜，存在PVR并發(fā)癥，AMD復(fù)發(fā)的問(wèn)題；IPE對(duì)某些視網(wǎng)膜變性模型具有治療作用，但是對(duì)IPE和RPE的表達(dá)譜研究表明IPE缺乏視紫紅質(zhì)循環(huán)中的某些關(guān)鍵酶，并不能完全替代RPE的生理功能，近年來(lái)的相關(guān)研究也日趨減少；胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用存在倫理爭(zhēng)議，因潛在致瘤性其安全性也始終令人詬??；iPSCs在構(gòu)建過(guò)程中被導(dǎo)入了潛在的原癌基因，逆轉(zhuǎn)錄病毒整合進(jìn)入宿主基因組也會(huì)增加致瘤的風(fēng)險(xiǎn)，最近的研究也證實(shí)了iPSCs比胚胎干細(xì)胞有更高的畸胎瘤形成傾向。雖然有研究報(bào)道減少或完全去除外源性轉(zhuǎn)錄因子，或者通過(guò)小分子化合物，或者通過(guò)導(dǎo)入后再去除的辦法來(lái)解決問(wèn)題。但是無(wú)論那一種方法對(duì)iPSCs進(jìn)入臨床前的安全性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

研究表明，人RPE細(xì)胞具有免疫原性小，不引起T細(xì)胞顯著的特異性免疫反應(yīng)，還可以抑制T細(xì)胞激活，避免了免疫抑制劑的使用；具有極大的體外增殖能力，一個(gè)人眼球可以用于治療數(shù)百名AMD患者，減輕了對(duì)人RPE細(xì)胞臨床應(yīng)用的取材限制、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和倫理爭(zhēng)論；人RPE細(xì)胞在體內(nèi)可以分泌營(yíng)養(yǎng)因子，與宿主視網(wǎng)膜形成突觸連接；在致腫瘤性風(fēng)險(xiǎn)上明顯優(yōu)于干細(xì)胞來(lái)源的RPE細(xì)胞；能夠表達(dá)多種RPE特有的功能性標(biāo)志物等優(yōu)點(diǎn)，是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植替代治療最有希望的細(xì)胞來(lái)源之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決上述問(wèn)題，提供了一種依據(jù)HLA配型進(jìn)行建庫(kù)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

（1）采集捐獻(xiàn)人眼球：對(duì)供者進(jìn)行ABO/Rh血型檢測(cè)、HLA分型檢測(cè)、微生物免疫檢測(cè)，眼球脫離活體到采集完成在12小時(shí)內(nèi)；

（2）分離和獲取人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞：將采集的眼球上的肌肉組織清除后用DPBS清洗眼球2-3次，每次5-8分鐘，切除角膜、虹膜，并將晶狀體和玻璃體去除，擠壓眼杯，將視網(wǎng)膜去除，分離視網(wǎng)膜色素上皮層和脈絡(luò)膜層，將分離的視網(wǎng)膜色素上皮層置于胰蛋白酶1-2ml在37℃下消化10-15min，加入10ml培養(yǎng)液終止消化，離心，棄上清，用培養(yǎng)液重懸獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)行接種；

（3）傳代培養(yǎng)：將獲得的細(xì)胞按3-6×10⁴/cm2接種于六孔板或培養(yǎng)瓶中加入5%血小板裂解液的無(wú)動(dòng)物原性、不含血清成分的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并獲得傳代培養(yǎng)后的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；

（4）檢測(cè)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞：吸取培養(yǎng)3天的培養(yǎng)基上清，用于細(xì)胞的分泌功能檢測(cè)，將傳代培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)行消化處理后分別進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)、病毒檢測(cè)、流式純度檢測(cè)、VEGF及PEDF分泌功能、MHC分子表達(dá)量檢測(cè)、HLA分型、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定、細(xì)胞增殖能力檢測(cè)、細(xì)胞凋亡周期檢測(cè)和成瘤性的檢測(cè)，檢測(cè)細(xì)胞是否符合建庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；

（5）凍存人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞：將經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，對(duì)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，吸取5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液離心棄上清，加入0.45ml血小板裂解液和0.05ml二甲基亞砜混合液后重懸細(xì)胞，并一同吸入凍存管中，將凍存管放入程序降溫盒中，迅速移入－80℃冰箱內(nèi)；24小時(shí)后，移入液氮中長(zhǎng)期保存；

（6）建庫(kù)：將獲得的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案，即構(gòu)建出人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞庫(kù)；

（7）使用時(shí)將凍存的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的復(fù)蘇即可用于臨床注射。

進(jìn)一步的，所述步驟（3）中的傳代培養(yǎng)包括如下步驟：

（a）在六孔板或培養(yǎng)瓶中，置于37℃、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3天更換新培養(yǎng)基一次；

（b）待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%融合或1-2周，在六孔板或培養(yǎng)瓶中加入胰蛋白酶1-2ml進(jìn)行消化；

（c）將六孔板或培養(yǎng)瓶放入37℃孵箱中5-8min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶使細(xì)胞及組織塊完全消化下來(lái)，用10ml的培養(yǎng)基或DPBS緩沖液進(jìn)行稀釋中止，將清洗下來(lái)的細(xì)胞懸液離心，吸棄上清;

（d）向離心管中加入4ml培養(yǎng)基后用血小板計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照計(jì)數(shù)結(jié)果按3-6×104/cm2接種于六孔板或培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基。

進(jìn)一步的，所述步驟（4）中人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞前處理的方法為：用2ml DPBS緩沖液洗滌傳代培養(yǎng)后的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞2-3次，吸棄洗液，胰蛋白酶1-2ml進(jìn)行消化，用10ml DPBS緩沖液進(jìn)行稀釋中止，反復(fù)吹打，將六孔板或培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞清洗干凈，將清洗下來(lái)的細(xì)胞懸液移入離心管中，在1000-2000轉(zhuǎn)／分鐘的轉(zhuǎn)速條件下離心5-8分鐘，離心結(jié)束后，吸棄上清，向離心管中加入4-5ml含有5%血小板裂解液的無(wú)動(dòng)物原性、不含血清成分的培養(yǎng)基后用血小板計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

進(jìn)一步的，所述步驟（7）中復(fù)蘇時(shí)將人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞從液氮中取出后立刻放在37℃水浴鍋中快速溶解，待凍存液融化后，將含細(xì)胞的1ml凍存液放入10ml不含肝素的玻璃體腔灌注液，1000-2000轉(zhuǎn)／分鐘離心5-8分鐘，離心后棄去上清。

進(jìn)一步的，所述步驟（7）中復(fù)蘇時(shí)將人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞從液氮中取出后立刻放在37℃水浴鍋中快速溶解，待凍存液融化后，將含細(xì)胞的1ml凍存液放入10ml含肝素4U／ml的玻璃體腔灌注液中，1000-2000轉(zhuǎn)／分鐘離心5-8分鐘，離心后棄去上清。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明步驟操作簡(jiǎn)單，獲取、培養(yǎng)、凍存的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞純度高、增殖能力強(qiáng)，復(fù)蘇效率高，細(xì)胞庫(kù)的建立依據(jù)HLA配型，通過(guò)質(zhì)量檢測(cè)和HLA配型的細(xì)胞復(fù)蘇后可以直接應(yīng)用于臨床注射，解決了細(xì)胞制劑的生產(chǎn)、保存、運(yùn)輸?shù)膯?wèn)題，當(dāng)患者需要采用人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植時(shí)，可直接提供臨床適用的HLA配型的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中所獲得的捐獻(xiàn)人眼球。

圖2為本發(fā)明中分離視網(wǎng)膜色素上皮層和脈絡(luò)膜層，其中：1—角膜；2—視網(wǎng)膜；3—脈絡(luò)膜；4—視網(wǎng)膜色素上皮。

圖3為本發(fā)明中胰蛋白酶消化后離心獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。

圖4為本發(fā)明的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞P1代照片。

圖5為本發(fā)明的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞純度流式檢測(cè)結(jié)果。

圖6為本發(fā)明的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞用四種不同復(fù)蘇液復(fù)蘇后活性流式檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

一種人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，方法如下：

對(duì)供者進(jìn)行ABO/Rh血型檢測(cè)、HLA分型檢測(cè)、微生物免疫檢測(cè)，體檢HIV、HBV、HCV、梅毒，對(duì)供者及其親屬的病史和家族史進(jìn)行排查確認(rèn)未接觸過(guò)致畸物、無(wú)遺傳病史。確認(rèn)供者簽署知情同意書等基本情況。

本例捐獻(xiàn)人眼球?yàn)樘g為95天的流產(chǎn)胎兒，人工流產(chǎn)，無(wú)傳染病、無(wú)視網(wǎng)膜色素變性和眼部腫瘤家族史。將流產(chǎn)胎兒用臨床級(jí)別的DPBS沖洗，洗去表面的血液和污物。用高壓滅菌的眼科手術(shù)剪，沿著眼球壁取出眼球，并在臨床級(jí)別的DPBS中剪去眼球壁周圍的肌肉組織（如圖1所示）。用臨床級(jí)別的DPBS清洗眼球2次，每次5分鐘。沿角膜緣1-2mm處，切除角膜、虹膜，并將晶狀體和玻璃體去除。擠壓眼杯，輕輕將視網(wǎng)膜排出。用眼科手術(shù)剪將眼杯剪成花瓣?duì)?，鋪平（附圖2所示1為角膜；2為視網(wǎng)膜；3為脈絡(luò)膜；4為視網(wǎng)膜色素上皮）。從黑色的視網(wǎng)膜色素上皮的邊緣開始，用眼科手術(shù)鑷子將視網(wǎng)膜色素上皮一點(diǎn)點(diǎn)與脈絡(luò)膜層分離。將撕下的視網(wǎng)膜色素上皮用移液槍吸取到15ml離心管中，并加入臨床級(jí)別的胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化10分鐘。反復(fù)吹打視網(wǎng)膜色素上皮組織，待其消化分離后加入4ml培養(yǎng)基，以1000轉(zhuǎn)／分鐘離心5分鐘（如圖3所示）。離心后棄去上清液，并加入4ml培養(yǎng)液重懸，接種在已用臨床級(jí)別基質(zhì)膠包備的6孔板中。

接種后第二天換液，并每?jī)商鞊Q液一次（如圖4所示）。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行傳代：在六孔板中每孔加入1ml臨床級(jí)別的胰酶消化，放入37℃培養(yǎng)箱中消化3分鐘。觀察到細(xì)胞變圓并懸浮后，立刻加入10ml培養(yǎng)基中止消化。反復(fù)吹打培養(yǎng)板，幫助細(xì)胞懸浮，并將細(xì)胞吸入15ml離心管中，1000轉(zhuǎn)／分鐘離心5分鐘。離心后棄去上清，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。以3×10⁵細(xì)胞／孔的濃度，將細(xì)胞接種在基質(zhì)膠包備好的6孔培養(yǎng)板上。

此后的培養(yǎng)方法和傳代方法同前。

接種后2周后，傳代培養(yǎng)的出現(xiàn)大量典型的六邊形視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（如圖4所示）。培養(yǎng)5周后，吸取培養(yǎng)3天的培養(yǎng)基上清，用于細(xì)胞的分泌功能檢測(cè)。消化3孔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞約吸取6×10⁶個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液分別于10個(gè)EP管中進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。質(zhì)量檢測(cè)在藥品非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，內(nèi)容包括：無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)、病毒檢測(cè)、流式純度檢測(cè)、VEGF及PEDF分泌功能、MHC分子表達(dá)量檢測(cè)、HLA分型、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定、細(xì)胞增殖能力檢測(cè)、細(xì)胞凋亡周期檢測(cè)、成瘤性檢測(cè)，以確定其達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。其中流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表面蛋白標(biāo)記Mertk和RPE65的表達(dá)（如圖5所示）得到細(xì)胞純度為96.9%（>95%,質(zhì)量合格)。

凍存與建庫(kù)：將培養(yǎng)4-5周獲得的P2代人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在六孔板中每孔加入1ml臨床級(jí)別的胰酶消化，放入37℃培養(yǎng)箱中消化5-10分鐘。觀察到細(xì)胞變圓并懸浮后，立刻加入10ml培養(yǎng)基稀釋中止消化。反復(fù)吹打培養(yǎng)板，幫助細(xì)胞懸浮，并將細(xì)胞吸入15ml離心管中，計(jì)數(shù)，1000轉(zhuǎn)／分鐘離心5分鐘。離心后棄去上清，以1×10⁶個(gè)／ml的濃度，將細(xì)胞在提前配置好的凍存液（90%血小板裂解液＋10%DMSO）中重懸。然后立刻放入程序降溫盒中放入-80℃冰箱凍存，24小時(shí)后取出放入液氮罐中長(zhǎng)期保存。將獲得的每一人份人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（5×10⁵／管），按供者姓名、身份證號(hào)、住院號(hào)、HLA分型、儲(chǔ)存日期分別保存，建立每一份細(xì)胞的詳細(xì)檔案的電腦數(shù)據(jù)庫(kù)，建立人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞庫(kù)。

復(fù)蘇：將凍存的P2代人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凍存管從液氮中取出后立刻放在37℃水浴鍋中快速溶解。待凍存液融化后，將含細(xì)胞的凍存液分別放入10ml不含肝素的玻璃體腔灌注液（BSS）、10ml含肝素（4U／ml）的玻璃體腔灌注液（BSS）中、10ml平衡鹽溶液（PBS）、10ml人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，1000轉(zhuǎn)／分鐘離心5分鐘。離心后棄去上清，用流式細(xì)胞儀對(duì)凍存復(fù)蘇后的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性檢測(cè)。結(jié)果如圖6顯示，用流式細(xì)胞儀對(duì)凍存復(fù)蘇后的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示，采用10ml不含肝素的玻璃體腔灌注液和10ml平衡鹽溶液（PBS）復(fù)蘇的細(xì)胞活性能達(dá)到或超過(guò)90%，兩種復(fù)蘇方法之間細(xì)胞活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0956,n=3）。采用10ml含肝素40U的玻璃體腔灌注液復(fù)蘇的細(xì)胞活性明顯降低，低于采用10ml不含肝素的玻璃體腔灌注液復(fù)蘇的細(xì)胞（P=0.0014,n=3）。采用10ml人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基復(fù)蘇的細(xì)胞活性也明顯降低，低于采用10ml不含肝素的玻璃體腔灌注液復(fù)蘇的細(xì)胞（P=0.001,n=3），但采用人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基復(fù)蘇的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞不能直接用于臨床注射，因此人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的復(fù)蘇方法采用10ml不含肝素的玻璃體腔灌注液（BSS）、10ml含肝素（4U／ml）的玻璃體腔灌注液（BSS）兩種方式。

總之，在本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物原性、無(wú)血清成分的體外分離、培養(yǎng)、凍存體系下，人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有典型的六邊形形態(tài)，純度能夠達(dá)到95%以上，解決了現(xiàn)有的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞來(lái)源的不足的現(xiàn)狀，并建立長(zhǎng)期存儲(chǔ)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞庫(kù)，操作簡(jiǎn)便、成本低廉、成分明確而穩(wěn)定，向臨床及科研應(yīng)用提供了大量細(xì)胞資源。經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)合格和HLA配型的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，復(fù)蘇后可用于臨床注射，解決了細(xì)胞制劑的生產(chǎn)、保存、運(yùn)輸?shù)膯?wèn)題。