本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子及其基因和應用。

背景技術(shù)：

田鼠巴貝斯蟲(Babesia microti)是一種新發(fā)的、經(jīng)蜱傳播的人獸共患原蟲病，寄生在人和嚙齒動物宿主紅細胞中，引起發(fā)熱、貧血、全身衰竭等癥狀，年老者、摘除脾臟或免疫力低下的患者的感染最為嚴重，可導致死亡。自1969年美國加利福尼亞州檢測到首例人感染田鼠巴貝斯蟲至今，已經(jīng)有數(shù)千例人感染報道，并且近年有升高的趨勢。田鼠巴貝斯蟲病主要流行于美國和歐洲部分國家，在世界其他地方都有報道，如日本、韓國、南非、巴西、印度等國和中國臺灣；在中國大陸，人感染田鼠巴貝斯蟲的病例也不斷有報道，1982年李金福等在云南首次報道了兩例疑似病例，1996年石珍寶等報道了一例來自內(nèi)蒙古錫林浩特的疑似感染病例，2012年，中國浙江省疾病預防控制中心通過血涂片觀察和核酸檢測兩種方法確診一名中年女患者感染了田鼠巴貝斯蟲。田鼠巴貝斯蟲經(jīng)媒介硬蜱叮咬傳播，也可以通過臨床輸血途徑傳播，隨著診斷技術(shù)的發(fā)展，更多的田鼠巴貝斯蟲感染的病例可能會被發(fā)現(xiàn)。治療是這種新發(fā)疾病面臨的直接問題，目前只有少數(shù)藥物用于臨床，效果不夠穩(wěn)定，需要聯(lián)合用藥，新藥研發(fā)十分迫切。

在哺乳動物體內(nèi)，巴貝斯蟲在紅細胞中繁殖，因此它需要抵御活性氧(ROS)或活性氮(RNS)的毒性作用，因為這兩類物質(zhì)主要會引起蟲體DNA的氧化損傷和脂質(zhì)過氧化。因此，為了抵御氧化壓力，寄生蟲利用硫氧還蛋白系統(tǒng)(Trx)來維持氧化還原平衡。這個系統(tǒng)包括NADPH、Trx和NADPH依賴的硫氧還蛋白還原酶(TrxR)。TrxR屬于二聚體黃素酶家族，能夠催化電子通過FAD結(jié)構(gòu)域從NADPH轉(zhuǎn)移給底物二硫化物。原蟲TrxR的C末端氧化還原中心由四個氨基酸分隔的兩個半胱氨酸殘基構(gòu)成，這一點區(qū)別于人的TrxR，因為后者是由硒代半胱氨酸代替的。一直以來，惡性瘧原蟲的Trx系統(tǒng)的研究較為廣泛，但是在田鼠巴貝斯蟲中的研究至今還沒有報道，因此，為了找到藥物靶標，需要研究田鼠巴貝斯蟲TrxR的特點，以便針對藥物靶標設(shè)計合理的抑制劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子及其基因，該田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子可用于制備治療巴貝斯蟲病的藥物。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):

在本發(fā)明的一個方面，提供了一種田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子，其氨基酸序列選自：

(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一個或多個氨基酸所得到的具有硫氧還蛋白還原酶活性，且與SEQ ID NO.1具有95％以上同源性的氨基酸序列。

優(yōu)選的，所述田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子基因，其包含：編碼SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

優(yōu)選的，所述田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種重組載體，包含上述田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子基因序列或其部分序列。

所述重組載體包括重組克隆載體或重組表達載體。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述重組載體的宿主細胞。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：

構(gòu)建含上述田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子基因的重組表達載體；

將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主細胞；

培養(yǎng)包含重組表達載體的大腸桿菌宿主細胞，并在合適條件下，誘導該重組表達載體表達田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子重組蛋白。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子的應用，用于篩選治療巴貝斯蟲病的藥物。

所述藥物為田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶的抑制劑。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子的應用，用于制備二硫化物還原酶制劑。

本發(fā)明田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子，經(jīng)重組表達獲得的重組蛋白BmiTrxR，由酶活動力學分析實驗表明具有很好的DTNB和胰島素還原活性，對于底物BmiTrx和直系同源蛋白E.coli(EcoTrx)也具有還原活性，適于篩選治療巴貝斯蟲病的BmiTrxR抑制劑藥物。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

圖1是本發(fā)明實施例1的BmiTrxR基因與其他物種TrxR的氨基酸序列比對圖；

圖2是本發(fā)明實施例2的重組蛋白BmiTrxR的表達與純化結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明實施例3的Western Blotting檢測結(jié)果圖；

圖4是本發(fā)明實施例5的不同pH條件下重組蛋白BmiTrxR的DTNB還原酶活性結(jié)果圖；

圖5是本發(fā)明實施例5的在DTNB還原酶活性試驗中，不同濃度下的重組蛋白BmiTrxR的酶活反應初速度圖；

圖6是本發(fā)明實施例5的重組蛋白BmiTrxR和大鼠TrxR(RatTrxR)的DTNB還原酶活性對比圖；

圖7是本發(fā)明實施例5的Trx還原試驗結(jié)果圖；

圖8是本發(fā)明實施例5的金諾芬作為重組酶BmiTrxR的二硫化物還原酶抑制劑試驗結(jié)果圖。

具體實施方式

下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.第3版，北京：科學出版社，2002)中所述的方法進行。

本發(fā)明首次從田鼠巴貝斯蟲蟲體裂殖子中獲得一個新的硫氧還蛋白還原酶分子，簡稱BmiTrxR，將其基因編碼區(qū)克隆到表達載體，在大腸桿菌中進行重組表達，由酶活動力學實驗分析BmiTrxR重組蛋白對DTNB和胰島素還原活性，以及對底物BmiTrx和直系同源蛋白E.coli(EcoTrx)的還原活性。

實施例1田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子(BmiTrxR)的基因克隆和序列分析

1.材料與方法

1.1.寄生蟲

田鼠巴貝斯蟲引自美國標準菌庫(ATCC)，編號ATCC^R PRA-99TM，在本實驗室經(jīng)過昆明系小鼠體內(nèi)接種傳代保存。

1.2.細菌與質(zhì)粒

質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達用到的是大腸桿菌Top 10細胞(Invitrogen)和大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)。克隆測序載體用到的是pGEM-T Easy(Promega)，表達載體用的是pET28a vector(Novagen)。

1.3.田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶(B.microti TrxR)的分子克隆

用TRIzol reagent(Invitrogen)提取蟲體裂殖子的RNA，然后RNA經(jīng)過DNase Ⅰ(TOYOBO)的消化，去除其中的基因組DNA。通過反轉(zhuǎn)錄從蟲體的總RNA中獲得cDNA， 整個步驟按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,Dalian,China)說明書進行操作。BmiTrxR開放閱讀框的擴增引物是F:5’-ATGATTCTTCGGGCTGGATT-3’(SEQ ID NO.3)和R:5’-TCAACCACACTTGCCCCCAC-3’(SEQ ID NO.4)，全長序列通過SMARTer RACE cDNA擴增試劑盒(Clintech,San Jose,CA,USA)獲得。根據(jù)已獲得的部分序列，設(shè)計特異性引物(5′端快速擴增GSP1:5’-GCCTCCTCCAATCACAGCGAAGT-3’(SEQ ID NO.5)和GSP2:5’-GCTTAGTTTCGGTGAGTGATGCG-3(SEQ ID NO.6)；3′端快速擴增GSP3:5’-TAGCACATAGGATGAAGACAAGGCA-3’(SEQ ID NO.7)和GSP4:5’-CAGGGAATGGCATTAGCTATGAAAC-3’(SEQ ID NO.8))。純化后的PCR擴增產(chǎn)物連接到克隆載體pGEM-T Easy(Promega)中進行測序。

2.結(jié)果

從B.microti裂殖子的mRNA，獲得了基因BmiTrxR的全長1766bp的cDNA片段(SEQ ID NO.2)，編碼一個完整的開放閱讀框1662bp，編碼553個氨基酸(SEQ ID NO.1)。預測的蛋白分子量為58.4kDa，等電點為6.95，與高分子量TrxR相似。預測其信號肽序列為前18個氨基酸。將預測蛋白進行BLAST非冗余數(shù)據(jù)庫分析，結(jié)果顯示預測蛋白與其他物種的TrxR具有顯著的相似度。BmiTrxR的氨基酸序列與牛巴貝斯蟲Babesia bovis TrxR(XP_001608869.1)同源性為58％，與惡性瘧原蟲Plasmodium falciparum TrxR(XP_002808951.1)的同源性為53％，與人隱孢子蟲Cryptosporidium hominis TrxR(XP_666572.1)的同源性為54％，與環(huán)形泰勒焦蟲Theileria annulata strain Ankara(XP_954814.1)的同源性為55％，與Human TrxR(3QFB_B)的同源性為44％，如圖1所示。發(fā)現(xiàn)預測蛋白的N端具有巰基二硫化物氧化還原活性中心(-CVNVGC-)，C端包含一段保守性序列GCGGGKCG，這段序列正是TrxR具有催化活性的結(jié)構(gòu)域。

實施例2田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白還原酶分子(BmiTrxR)的重組表達與純化

BmiTrxR全長基因通過NcoⅠand XhoⅠ兩個酶切位點進行雙酶切后，亞克隆到表達載體pET-28a(Novagen)中，進行測序確保序列的準確性。全長基因通過構(gòu)建His標簽蛋白在E.coli BL21(DE3)中進行表達。表達菌經(jīng)過1mM IPTG誘導，16℃孵育約12小時后收集菌體，保存在-80℃。重組蛋白通過Ni²⁺親和樹脂(Novagen)進行純化，誘導后的菌體用結(jié)合緩沖液(NI-NTA Buffer Kit,Novagen)重懸，然后超聲破碎，12,000×g，4℃離心10min，可溶的上清蛋白載入純化樹脂，然后用清洗緩沖液洗兩次，最后用洗脫緩沖液(NI-NTA Buffer Kit,Novagen)將目的蛋白洗脫下來，最后進行SDS-PAGE凝膠電泳分析定量。

結(jié)果：BmiTrxR重組蛋白成功表達，分子量約為58.4kDa，與預測的大小一致(見圖2)，蛋白以可溶形式表達。圖2中，泳道1：未誘導的細胞裂解液；泳道2：誘導的細胞裂解液； 泳道3：純化的重組蛋白BmiTrxR。

實施例3重組蛋白BmiTrxR抗血清的制備及Western Blotting檢測

純化后的重組蛋白與完全佐劑混合后，通過腹腔注射免疫小鼠(每只約200g重組蛋白)，然后，對這些小鼠每隔兩周加強免疫一次，共兩次，且重組蛋白需要用不完全佐劑預混。通過眼眶采血收集小鼠血液樣品，用ELISA檢測抗體滴度。

田鼠巴貝斯蟲感染的小鼠紅細胞與未感染的小鼠紅細胞分別與等量的2×SDS gel-loading buffer混合，然后煮10分鐘將蛋白變性。在12％的SDS-PAGE進行凝膠電泳之后轉(zhuǎn)印到NC膜上，用5％的脫脂牛奶4℃封閉過夜。封閉后的NC膜與重組蛋白的抗血清(1:200稀釋)室溫孵育1小時，然后用PBST每10分鐘洗一次，共5次。用HRP標記的羊抗鼠IgG(1:2000稀釋)室溫孵育1小時后，同一抗一樣洗膜。最后用底物DAB顯色。

結(jié)果：純化后的重組蛋白BmiTrxR免疫小鼠，獲得多克隆抗體。用抗血清鑒定B.microti裂解液中的天然蛋白BmiTrxR。結(jié)果如圖3所示，在感染B.microti的小鼠紅細胞裂解液中檢測到特異性蛋白條帶，分子量約為58.4kDa，而在未感染B.microti的細胞中未檢測到，表明重組蛋白具有免疫效應，并且抗血清與天然蛋白BmiTrxR發(fā)生了特異性的免疫反應。圖3中，泳道1：B.microti感染的小鼠紅細胞裂解液；泳道2：未感染的小鼠紅細胞裂解液。泳道1和2均用重組蛋白抗血清孵育。

實施例4重組蛋白BmiTrxR酶活動力學分析

1.重組蛋白BmiTrxR的DTNB還原酶活性

酶活試驗在多功能酶標儀(SpectraMax M5,Molecular Devices)上25℃條件下進行。重組蛋白BmTrxR的TrxR活性通過檢測該重組酶對DTNB和胰島素的還原能力。在DTNB還原試驗中，為找到最佳反應參數(shù)，檢測重組蛋白BmiTrxR在不同pH下對DTNB的還原活性，以及檢測不同濃度下的重組蛋白BmiTrxR對DTNB的還原活性，200μl反應體系包括100mM磷酸鉀緩沖液，0.1mM NADPH，2mM DTNB和50nM BmiTrxR。通過檢測該反應前三分鐘在412nm處吸光值的增加來檢測BmTrxR的活性，由于1mol的NADPH產(chǎn)生2mol的TNB，所以用產(chǎn)物TNB的消光系數(shù)13.6mM^-1cm^-1進行計算。

結(jié)果：如圖4所示，純化后的重組蛋白BmiTrxR在25℃條件下，pH 6.5，100mM磷酸鹽緩沖液中的活性最大。圖5表明，重組酶濃度為100nM時，酶活反應初速最大。

用DTNB作為底物，并且用同濃度的大鼠TrxR(RatTrxR)做陽性對照，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明重組酶BmiTrxR具有顯著的NADPH依賴的二硫化物還原酶活性(圖6)

2.重組蛋白BmiTrxR的胰島素還原活性

反應溫度為25℃，Trx還原試驗的體系包括0.16mM牛胰島素(Sigma)，10μM重組蛋白BmiTrx或大腸桿菌Trx(EcoTrx)，100nM BmiTrxR或RatTrxR，100μM NADPH，緩沖液為50mM Tris-HCI(pH 6.5)，包含2mM EDTA，陰性對照為用同濃度的His多肽替代酶TrxR。通過檢測NADPH的消耗量，在340nm處吸光值的下降來檢測重組酶的活性。NADPH的消光系數(shù)為6.22mM^-1cm^-1。對于所有的酶活試驗，空白對照組體系除去重組酶或底物，每個反應最少三個重復。

結(jié)果：重組酶BmiTrxR對于底物BmiTrx和直系同源蛋白E.coli(EcoTrx)也具有還原活性(圖7)。

在TrxR活性試驗中，NADPH濃度范圍為5-100μM，DTNB的濃度變化范圍為100-1000μM，Trx為5-30μM，重組酶的濃度固定為50nM。對于每個反應，當一種底物的濃度變化時，體系其他成分濃度固定不變。將實驗數(shù)據(jù)進行非線性方程擬合以及米氏方程，從而計算出酶活參數(shù)。酶活參數(shù)的計算至少需要三套獨立的數(shù)據(jù)。表1為重組蛋白BmiTrxR對于不同底物的酶活性參數(shù)。

表1重組蛋白BmiTrxR對于不同底物的酶活性參數(shù)

3.金諾芬作為重組酶BmiTrxR的二硫化物還原酶抑制劑試驗

金諾芬作為一種酶抑制劑，通過在DTNB還原試驗中監(jiān)測412nm處吸光值的增加來評估抑制劑的效果。該試驗體系包括100μM NADPH,2mM DTNB,50nM重組酶BmTrxR，抑制劑的濃度分別為0,3.125,6.25,12.5,25,50and 100μM。抑制劑與重組酶需要預混15分鐘后，再加入NADPH和DTNB，最后來監(jiān)測剩余酶活性。

結(jié)果：當金諾芬的濃度為12.5μM時，酶活性幾乎完全被抑制(圖8)。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。