本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組轉(zhuǎn)氨酶及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是由人體自身代謝紊亂引發(fā)的一種全身慢性進(jìn)行性疾病，系由胰島素分泌不足或胰島素作用障礙所致。糖尿病通常伴隨冠心病、腦血管疾病、腎病、下肢壞死等并發(fā)癥，是一種復(fù)雜的多發(fā)病。目前全球成人糖尿病患病人數(shù)達(dá)4.22億，預(yù)計(jì)至2025年，全球?qū)⒂?億多人患糖尿病。
糖尿病主要分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種，其中Ⅱ型糖尿病是非胰島素依賴(lài)型糖尿病，系由胰島素抵抗或胰島β細(xì)胞功能受損導(dǎo)致，其患者占糖尿病患者的90％以上。目前治療Ⅱ型糖尿病的藥物有多種，如磺酰脲類(lèi)、雙胍類(lèi)、噻唑烷二酮類(lèi)、α-葡萄糖苷酶抑制劑、苯甲酸衍生物類(lèi)等，雖然降糖作用較為理想，但因存在副作用而影響患者堅(jiān)持用藥，達(dá)不到較好的血糖控制目的。
二肽基肽酶-IV(DPP-IV)可以裂解包括胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和抑胃肽(GIP)在內(nèi)的多種肽類(lèi)激素，而這兩者與Ⅱ型糖尿病有著密切聯(lián)系。DPP-IV抑制劑可通過(guò)抑制DPP-IV減少GLP-1的降解，增加GLP-1的血漿濃度，從而改善餐后血糖。此外，DPP-IV抑制劑還可抑制GIP、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽和胃泌素釋放肽等參與調(diào)節(jié)血糖的其他肽類(lèi)的降解。
2006年10月，美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)磷酸西他列汀單水合物(Sitagliptin，商品名Januvia)用于治療Ⅱ型糖尿病。西他列汀是第一個(gè)用于治療Ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶(DPP-IV)抑制劑類(lèi)藥物，可抑制胰高血糖素的分泌和胰島β細(xì)胞增殖及提高葡萄糖耐受水平，其降糖作用較為適中，不引起患者水腫及體重增加，導(dǎo)致低血糖的風(fēng)險(xiǎn)較小，并且無(wú)增加體重、惡心、嘔吐等副作用。西他列汀單獨(dú)使用或與其他降糖藥合用，均可達(dá)到降糖的目的。
Sitagliptin中文名稱(chēng)為7-[(3R)-3-氨基-1-氧代-4-(2,4,5-三氟苯基)丁基]-5,6,7,8-四氫-3-(三氟甲基)-1,2,4-三唑[4,3-α]吡唑磷酸(1:1)單水合物，分子式為C16H15F6N5O，相對(duì)分子質(zhì)量為407.31，CAS號(hào)為654671-77-9。
目前西他列汀的合成方法有多種，其中收率較高的是美國(guó)默克公司的合成方法(WO2004085378，WO2005020920)：用手性銠催化劑對(duì)未保護(hù)的烯胺進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)加氫，其反應(yīng)總收率較高，為74.5％，且生產(chǎn)成本較低。但該路線所得的產(chǎn)物光學(xué)純度較低(ee 97％)，需結(jié)晶濃縮才能得到光學(xué)純的西他列汀，且反應(yīng)需要高壓加氫(250psi)，對(duì)反應(yīng)設(shè)備要求較高。
化學(xué)合成西他列汀及其中間體存在反應(yīng)路線長(zhǎng)、需要使用有毒原料、產(chǎn)物收率和光學(xué)純度低、反應(yīng)條件苛刻等缺點(diǎn)；而酶催化合成西他列汀中間體具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)專(zhuān)一性強(qiáng)、副反應(yīng)少、產(chǎn)物的收率和光學(xué)純度高、容易分離純化等優(yōu)點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種催化活性高、對(duì)映選擇性好、底物耐受性好的重組轉(zhuǎn)氨酶，可用于催化合成手性胺化合物，特別是催化合成西他列汀中間體(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)目前西他列汀及其中間體合成路線長(zhǎng)、需要使用有毒原料、產(chǎn)物收率和手性純度低、反應(yīng)條件苛刻等缺點(diǎn)，提供一種催化活性高、對(duì)映選擇性好、底物耐受性好的重組轉(zhuǎn)氨酶，該轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因，含有該基因的重組表達(dá)載體、重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體及其制備方法，以及該重組轉(zhuǎn)氨酶突變體在催化制備手性胺化合物中的應(yīng)用。特別的，將該重組轉(zhuǎn)氨酶用于西他列汀中間體(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的制備。
本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種高活性的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體，以SEQ ID NO.3所示的基因編碼的土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624野生型轉(zhuǎn)氨酶為出發(fā)酶，將該酶活性中心以及導(dǎo)向活性中心的疏水通道中的一些位點(diǎn)的氨基酸殘基突變?yōu)槠渌陌被釟埢玫降拇呋钚愿叩闹亟M轉(zhuǎn)氨酶突變體；所述的活性中心定義為底物結(jié)合位點(diǎn)附近大約的球形空間；所述的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體氨基酸序列優(yōu)選SEQ ID NO.2 2中的任一種。
本發(fā)明中SEQ ID NO.3所示的核酸來(lái)源于土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624。本發(fā)明所述SEQ ID NO.3所示的核酸可以從土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624的基因組中分離獲得，也可以從含有SEQ ID NO.3所示核酸的重組表達(dá)載體或者重組轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以人工合成獲得。
一種編碼本發(fā)明所述的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體的基因，其核苷酸序列選自SEQ ID NO.1。
一種包含本發(fā)明所述的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體編碼基因的重組表達(dá)載體。其可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)氨酶基因的核酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成。所述的載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如市售的質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體等等，優(yōu)選質(zhì)粒pET21a。
一種包含本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體編碼基因或其重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，本發(fā)明優(yōu)選大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。將前述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，即可得到本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌。
一種制備所述的重組轉(zhuǎn)氨酶的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)該基因工程菌，以及收集和制備重組轉(zhuǎn)氨酶。
所述方法包括在一定生產(chǎn)罐發(fā)酵條件下，進(jìn)行工業(yè)化制備所述重組轉(zhuǎn)氨酶的步驟；所述的生產(chǎn)罐發(fā)酵條件優(yōu)選：DO 35％以上，空氣流量1:1.5vvm。
本發(fā)明所述的重組轉(zhuǎn)氨酶應(yīng)用于不對(duì)稱(chēng)合成手性胺類(lèi)化合物，特別是用于合成西他列汀中間體(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。
本發(fā)明重組轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)如下：
優(yōu)選：在pH 6.5～7.5的反應(yīng)液中，在5-磷酸吡哆醛存在下，在本發(fā)明所述的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體作用下，以化合物A為底物不對(duì)稱(chēng)酶催化還原制備光學(xué)手性胺化合物
其中，R為烷基或取代雜芳基，優(yōu)選CnH2n+1和芐基，其中n選自1～8的整數(shù)。
一種西他列汀的合成方法，反應(yīng)路線如下：
有益效果：
本發(fā)明通過(guò)化學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)及高通量篩選方法，開(kāi)發(fā)到一種具有較高特異性(對(duì)映體過(guò)量值>99.5％)及較好催化活性的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體，用于催化合成手性胺化合物。本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)氨酶的輔因子為5-磷酸吡哆醛PLP。
本發(fā)明所涉及的酶具有優(yōu)良的立體選擇性、區(qū)域選擇性和催化活力，且其催化的反應(yīng)溫和，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的產(chǎn)量高，具有較好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1基因工程菌的建立
根據(jù)Genbank收錄的土曲霉(Aspergillus terreus NIH2624)轉(zhuǎn)氨酶的基因序列(NCBI登錄號(hào)：XM_001209325.1)，人工合成該基因片段，通過(guò)PCR擴(kuò)增擴(kuò)展該片段(片段兩側(cè)加NdeⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶基因片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。并利用NdeⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)將基因插入pET21a質(zhì)粒中，將連接后的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中建立轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌。其中PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)氨酶基因的引物為：正向引物F1：GGGGCCATATGGCCTCCATGGACAAAGTCTTT(SEQ ID NO.4)，反向引物R1：GGGCCGGATCCCGTTATAATCAATCTCGAAGC(SEQ ID NO.5)。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)氨酶突變體基因的獲得
本研究利用易錯(cuò)PCR方法，對(duì)轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程改造。易錯(cuò)PCR是在采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時(shí)，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運(yùn)用低保真度DNA聚合酶等，來(lái)改變擴(kuò)增過(guò)程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體。本研究采用保真度較低的聚合酶在特定措施下很容易向擴(kuò)增產(chǎn)物中摻入隨機(jī)突變的原理，同時(shí)利用Mn2+替代天然輔助因子Mg2+增加易錯(cuò)概率。
50μl PCR反應(yīng)體系為：10×擴(kuò)增緩沖液5μl，4種dNTP混合物(2.5mmol/L)各4μl，引物各50pmol，模板DNA 1.5μg，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mg2+2mmol/L，加雙蒸水至50μl。
PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃變性30s，72℃變性120s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；于72℃下繼續(xù)延伸10min，冷卻至4℃。擴(kuò)增的基因片段經(jīng)檢測(cè)后用1％瓊脂糖凝膠電泳回收，并純化擴(kuò)增產(chǎn)物，去除多余的引物。
實(shí)驗(yàn)流程
按照實(shí)施例1的方法PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)氨酶基因并利用NdeⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)將基因插入至pET21a質(zhì)粒中，作為基因突變模板；
易錯(cuò)PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)氨酶的基因，擴(kuò)增后基因片段鏈接至pET21a載體，將連接后的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中建立轉(zhuǎn)氨酶基因突變體庫(kù)；利用大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，pET21a質(zhì)粒為載體，表達(dá)擴(kuò)展轉(zhuǎn)氨酶，高通量篩選高活性突變株；突變后對(duì)高活性轉(zhuǎn)氨酶基因進(jìn)行鑒定。篩選出的高活性轉(zhuǎn)氨酶突變體基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
轉(zhuǎn)氨酶基因引物為：正向引物F1：GGGGCCATATGGCCTCCATGGACAAAGTCTTT(SEQ ID NO.4)，反向引物R1：GGGCCGGATCCCGTTATAATCAATCTCGAAGC(SEQ ID NO.5)。
按實(shí)施例1所述方法構(gòu)建表達(dá)該轉(zhuǎn)氨酶突變體的基因工程菌。
在獲得突變體序列后,也可以通過(guò)化學(xué)合成方式合成該基因序列后利用NdeⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)將基因插入至pET21a質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建基因工程菌。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)氨酶的搖瓶制備
將實(shí)施例1、實(shí)施例2構(gòu)建所得的重組大腸桿菌分別接種至50mL含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.2)中，于37℃，200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)16小時(shí)以上。轉(zhuǎn)接2mL菌體培養(yǎng)液于50mL含氯霉素(或氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基中，置于同樣條件下振蕩培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)量菌液在600nm下的吸光值以監(jiān)測(cè)菌體生長(zhǎng)密度。當(dāng)菌液的OD 600值在0.6-0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.2mmol/L，30℃誘導(dǎo)表達(dá)12小時(shí)以上。表達(dá)后通過(guò)離心(5000rpm，15min，4℃)收集菌體，并用磷酸緩沖液(pH7.2，50mM)清洗兩次，分散于同樣預(yù)冷的緩沖液中，于冰水浴中進(jìn)行超聲破碎。離心(8000rpm，30min，4℃)收集上清液，濃縮、冷凍干燥得到重組轉(zhuǎn)氨酶或重組轉(zhuǎn)氨酶突變體的粗品粉末。
實(shí)施例4重組轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定
以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯為底物，HPLC檢測(cè)實(shí)施例3制備的重組轉(zhuǎn)氨酶活性，從而篩選出能夠表達(dá)具有最高轉(zhuǎn)氨酶酶活的基因工程菌。使用島津LC-20AT高效液相色譜儀，配備C18柱(150mm*4.6mm,5um)，流動(dòng)相0.1％三氟乙酸水溶液-甲醇(40:60)，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫30℃，流速1.0mL·min-1。
檢測(cè)條件為：反應(yīng)體系總體積2mL，其中包含0.5-50μmol/L底物，200μL 1mol/L異丙胺鹽酸鹽，100μmol 5-磷酸吡哆醛，5％-25％(v/v)DMSO，500μL酶液，45℃反應(yīng)30min，測(cè)定底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的消耗量和產(chǎn)物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的生成量。
酶活力單位(U)的定義為：在上述反應(yīng)條件下，毎分鐘催化生成1μmol(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯所需的酶量或每分鐘消耗1μmol底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯所需的酶量。
測(cè)得重組轉(zhuǎn)氨酶突變體的酶活為926.2U/L，比原始酶活(NCBI登錄號(hào)：XM_001209325.1)提高了1.1倍。
實(shí)施例5重組轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵制備
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：硫酸銨0.76g/L，檸檬酸鐵0.06mg/L，NaCl 10.5g/L，磷酸氫二鉀12.2g/L，磷酸二氫鉀6.1g/L，酵母提取物11.5g/L，蛋白胨7.1g/L，甘油17.3g/L，鉬酸銨四水合物0.01g/L。發(fā)酵液通過(guò)加入氨水維持pH 7.0，罐溫37℃，攪拌轉(zhuǎn)速300-1300rpm，發(fā)酵過(guò)程中控制DO 35％以上，空氣流量1:1.5vvm。接入E.Coli BL21(DE3)ST 1205種子液的OD600為0.68，接入量為發(fā)酵液體積的10％，發(fā)酵液OD600達(dá)0.8時(shí)加入IPTG至終濃度1mmol/L以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)，此后繼續(xù)發(fā)酵15小時(shí)，罐溫25℃。發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)加入含甘油460g/L、酵母提取物150g/L，氯化銨11.5g/L、鉬酸銨四水合物0.04mg/L、檸檬酸鐵0.06mg/L的溶液維持培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。發(fā)酵結(jié)束后將培養(yǎng)物冷卻至4℃保存。
將發(fā)酵液經(jīng)離心(8000rpm，10min)、細(xì)胞破碎、冷凍干燥等常規(guī)處理，制備得到轉(zhuǎn)氨酶多肽凍干粉并于-80℃保存。
實(shí)施例6重組轉(zhuǎn)氨酶催化合成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(XT-4)
向2000L反應(yīng)釜中加入32.6kg底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，132kg異丙胺鹽酸鹽，0.55kg 5-磷酸吡哆醛(PLP)，550L DMSO，隨后向釜內(nèi)投加按照實(shí)施例5方法制備的重組轉(zhuǎn)氨酶凍干粉29.5kg，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，升溫至45℃，并加入4mol/L異丙胺水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH為8.5。反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)加入4mol/L異丙胺水溶液控制反應(yīng)液的pH為8.5-9.0，攪拌反應(yīng)22小時(shí)左右，至底物含量降至3％以下時(shí)終止反應(yīng)。
反應(yīng)終止后經(jīng)離心、萃取、脫色等操作，得到產(chǎn)物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯：1H NMR(CDCl3)d7.08(m,1H),6.94(m,1H),3.85(s,2H),3.77(s,3H),3.55(s,2H)；13C NMR(CDCl3)d 197.9,167.1,156.9,154.5,150.4,147.9,145.5,119.4,117.0,105.5,52.4,48.3,41.9。經(jīng)HPLC分析，確定底物轉(zhuǎn)化率97.6％，產(chǎn)物ee 99.5％。
產(chǎn)物ee值的具體分析條件為：Chiralpak AD-H色譜柱(150mm×4.6mm,5um)，流動(dòng)相正己烷-異丙醇(80:20，v/v)；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流速1mL/min，柱溫30℃。
實(shí)施例7(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(XT-4)
在反應(yīng)器內(nèi)加入90ml二甲基亞砜，15g的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，攪拌溶解，加入pH＝9.00的異丙胺鹽酸水溶液90ml，加入粗酶液120g以及0.08g磷酸吡哆醛，35℃攪拌反應(yīng)24h，期間用異丙胺水溶液維持pH8.00-8.60之間，加酸終止反應(yīng)，再35℃保溫?cái)嚢?h，過(guò)濾除去蛋白，水相用氫氧化鈉水溶液調(diào)pH至10-11，用二氯甲烷萃取三次，合并二氯甲烷加入無(wú)水硫酸鈉干燥2h，回收二氯甲烷后得產(chǎn)品14g，純度99％以上。
實(shí)施例8(R)-3-叔丁氧羰基氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(XT-5)
稱(chēng)取14.8g(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(0.06mol)，溶解于50ml二氯甲烷中，再加入1ml三乙胺，5℃以下加入14.4g二碳酸二叔丁酯(0.066mol)，升溫至室溫反應(yīng)15小時(shí)，加入30ml水淬滅，收集有機(jī)相，水相再用二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，旋蒸回收溶劑，得18.7g白色固體，收率90％。
實(shí)施例9(R)-3-叔丁氧羰基氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸(XT-6)
將17.4g(R)-3-叔丁氧羰基氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(0.05mol)，溶解于120ml甲醇和60ml水的混合溶劑中，再加入6g氫氧化鈉(0.15mol)，在40-45℃下攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)，旋蒸除去部分溶劑，在冰浴下加入1N鹽酸調(diào)pH為2-3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，用食鹽水洗滌1次，有機(jī)相加入無(wú)水硫酸鈉干燥2h，過(guò)濾，旋蒸回收溶劑得白色固體15.7g，收率94％。
實(shí)施例10 7-[(3R)-3-叔丁氧羰基氨基-1-氧代-4-(2,4,5-三氟苯基)丁基]-5,6,7,8-四氫-3-三氟甲基-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪(XT-7)
在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將8.6g(R)-3-叔丁氧羰基氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸(0.045mol)、10.28g三氟甲基三氮唑并哌嗪鹽酸鹽(0.045mol)溶解于50ml二氯甲烷中，冰浴下加入7.27g 1-羥基苯并三氮唑(0.054mol)和10.3g 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳酰亞胺鹽酸鹽(0.054mol)，滴加13.5g三乙胺，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)24小時(shí)，反應(yīng)液用50ml水洗滌3次，有機(jī)相加入無(wú)水硫酸鈉干燥2小時(shí)，回收溶劑得20.9g，收率91％。
實(shí)施例11西他列汀磷酸鹽
稱(chēng)取10.14g XT-7(0.02mol)溶解于100ml濃鹽酸：乙醇(1:5)的混合溶劑中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，旋蒸除去乙醇，用碳酸氫鈉中和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉干燥2小時(shí)，過(guò)濾，回收溶劑后，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入80ml異丙醇和10ml水，85℃攪拌，加入3g 85％磷酸，85℃攪拌反應(yīng)2小時(shí)，降溫至室溫再攪拌10小時(shí)，過(guò)濾烘干得白色西他列汀磷酸鹽9.09g，收率90％。
實(shí)施例12西他列汀磷酸鹽中試制備
稱(chēng)取5.1kg XT-7(1mol)溶解于50L濃鹽酸：乙醇(1:5)的混合溶劑中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，旋蒸除去乙醇，用碳酸氫鈉中和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉干燥2小時(shí)，過(guò)濾，回收溶劑后，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入45L異丙醇：水(8:1)的混合溶劑，85℃攪拌，加入1.5kg 85％磷酸，繼續(xù)85℃攪拌反應(yīng)2小時(shí)，降溫至室溫再攪拌10小時(shí)，過(guò)濾烘干得白色西他列汀磷酸鹽4.71kg，收率93％。
<110> 江蘇阿爾法藥業(yè)有限公司
<120> 一種重組轉(zhuǎn)氨酶及其制備方法和應(yīng)用
<160> 5
<210> 1
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組轉(zhuǎn)氨酶突變體的編碼基因
<400> 1
atggcctcca tggacaaagt ctttgccggc tacgccgccc gccaagcgat cctcgaatca 60
accgagacca ccaacccctt tgcgaagggt atcgcctggg tagaaggcga gctggtgccc 120
ctggcagagg cacgcattcc actgctcgac cagggcttca tgaaaagcga tctcacctac 180
gacgtgccct ccgtctggga cggccgcttc ttccggctag acgaccacat cacgcggctc 240
gaagccagct gcaccaagct ccggctgcga ctgccactcc cgcgcgacaa agtcaagcag 300
attctcgtcg agatggtgcg caagagcggc atccgcgacg cctttgtcga gctgatcgtg 360
acgcgcgggc tgaagggcgt gcgggggaca cgccccgagg acatcgtcaa caatctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggtgatg gagccggata tgcagcgtgt cggcggcagc 480
gcggtcgtcg cccgcaccgt gcgccgggtg cccccgggtg ccatcgaccc aaccgtcaag 540
aacctgcaat ggggcgatct cgtgcgcggc atgttcgagg ctgcggatcg cggtgcaact 600
tatccgttct tgacggacgg agatgcccat ctcaccgaag gctctgggtt caatattgtg 660
ctcgtcaagg acggcgtgct gtacacacca gaccgtggtg tgctgcaggg cgtgacacga 720
aagagtgtta tcaatgcggc ggaagccttc gggattgaag tccgcgttga gtttgtgccg 780
gttgagctgg cgtaccgttg tgatgagatc tttatgtgta ccaccgctgg cggcatcatg 840
cctatcacta cgctggatgg gatgcccgtg aatggaggac agatcggtcc tattacgaag 900
aagatttggg atggatattg ggctatgcat tatgatgcgg cttacagctt cgagattgat 960
tataacgaga ggaactga 978
<210> 2
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組轉(zhuǎn)氨酶突變體
<400> 2
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met Lys Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp
85 90 95
Lys Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Arg Lys Ser Gly Ile Arg
100 105 110
Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg
115 120 125
Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln
130 135 140
Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp
165 170 175
Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe
180 185 190
Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp
195 200 205
Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp
210 215 220
Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val
245 250 255
Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met
260 265 270
Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met
275 280 285
Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Arg Asn
325
<210> 3
<211> 978
<212> DNA
<213>土曲霉（Aspergillus terreus）NIH2624
<220>
<223> 轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因
<400> 3
atggcctcca tggacaaagt ctttgccggc tacgccgccc gccaagcgat cctcgaatca 60
accgagacca ccaacccctt tgcgaagggt atcgcctggg tagaaggcga gctggtgccc 120
ctggcagagg cacgcattcc actgctcgac cagggcttca tgcacagcga tctcacctac 180
gacgtgccct ccgtctggga cggccgcttc ttccggctag acgaccacat cacgcggctc 240
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acgcgcgggc tgaagggcgt gcgggggaca cgccccgagg acatcgtcaa caatctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggtgatg gagccggata tgcagcgtgt cggcggcagc 480
gcggtcgtcg cccgcaccgt gcgccgggtg cccccgggtg ccatcgaccc aaccgtcaag 540
aacctgcaat ggggcgatct cgtgcgcggc atgttcgagg ctgcggatcg cggtgcaact 600
tatccgttct tgacggacgg agatgcccat ctcaccgaag gctctgggtt caatattgtg 660
ctcgtcaagg acggcgtgct gtacacacca gaccgtggtg tgctgcaggg cgtgacacga 720
aagagtgtta tcaatgcggc ggaagccttc gggattgaag tccgcgttga gtttgtgccg 780
gttgagctgg cgtaccgttg tgatgagatc tttatgtgta ccaccgctgg cggcatcatg 840
cctatcacta cgctggatgg gatgcccgtg aatggaggac agatcggtcc tattacgaag 900
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tataacgaga ggaactga 978
<210> 4
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物F1
<400> 4
ggggccatat ggcctccatg gacaaagtct tt 32
<210> 5
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物R1
<400> 5
gggccggatc ccgttataat caatctcgaa gc 32