本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與基因組學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

DNA測(cè)序(DNA sequencing)作為一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。早在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)后不久就有人報(bào)道過DNA測(cè)序技術(shù)，但是當(dāng)時(shí)的操作流程復(fù)雜，無法形成規(guī)模。隨后在1977年Sanger發(fā)明了具有里程碑意義的雙脫氧末端終止測(cè)序法(Sanger,F.；Nicklen,S.；Coulson,A.R.(1977),"DNA sequencing with chain-terminating inhibitors",Proceedings of the National Academy of Sciences USA,74(12):5463–5467)，因其簡(jiǎn)單、快速，經(jīng)過后續(xù)的不斷改良，成為了相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)DNA測(cè)序的主流技術(shù)。

然而隨著科學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要，對(duì)模式生物進(jìn)行基因組重測(cè)序以及對(duì)一些非模式生物的基因組測(cè)序，都需要費(fèi)用更低、通量更高、速度更快的測(cè)序技術(shù)，第二代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing)應(yīng)運(yùn)而生。與傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序方法相比，二代測(cè)序技術(shù)使得科學(xué)家們可以更加快速、廉價(jià)地對(duì)DNA與RNA進(jìn)行測(cè)序，徹底變革了分子生物學(xué)與基因組學(xué)的研究(Quail,M.A.,I.Kozarewa,F.Smith,A.Scally,P.J.Stephens,R.Durbin,H.Swerdlow,and D.J.Turner.A large genome center’s improvements to the Illumina sequencing system.Nat.Methods 2008,5:1005-1010)。

標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)二代測(cè)序文庫構(gòu)建包括如下步驟：(i)片段化，(ii)末端修復(fù)，(iii)5’末端磷酸化，(iv)3’末端加dA，從而可與測(cè)序接頭連接，(v)連接接頭，(vi)通過PCR富集兩端均成功連接接頭的產(chǎn)物(如圖1)(Steven R.Head,H.Kiyomi Komori,Sarah A.LaMere,Thomas Whisenant,Filip Van Nieuwerburgh,Daniel R.Salomon,and Phillip Ordoukhanian,Library construction for next-generation sequencing:Overviews and challenges.BioTechniques,2014,56:61–77)。該方法步驟較多，操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，因而有學(xué)者對(duì)其作出改進(jìn)，將步驟(ii)～(v)整合在同一反應(yīng)體系中(M Neiman,S Sundling,H P Hall,K Czene,et al.Library preparation and multiplex capture for massive parallel sequencing applications made efficient and easy.Plos One 2012,7(7):e48616-e48616)。但無論整合與否，建庫過程中的3’末端加dA步驟，因?yàn)樾枰肨aq或exo Klenow DNA聚合酶為DNA3’端添加dA突出端，而此步驟的加3’末端dA效率較低，因此直接決定了產(chǎn)物兩端均成功連接接頭的效率較低，在很大程度上制約了建庫效果。

已有學(xué)者對(duì)以上建庫方法作出改進(jìn)(中國(guó)發(fā)明專利：201610537963.4；發(fā)明名稱：一種高效的DNA接頭連接方法)，使用具有不同末端結(jié)構(gòu)的接頭混合物與加A產(chǎn)物進(jìn)行連接，接頭混合物中的平末端、3’dT突出端、3’dG突出端，分別對(duì)應(yīng)加A反應(yīng)后，DNA分子末端可能具有的平末端、3’dA突出端、3’dG突出端三種結(jié)構(gòu)，并分別與其連接。因此，無論DNA分子的加A效率如何，具有何種末端結(jié)構(gòu)，均有與之相匹配的接頭相連接，確保了分子兩端添加接頭效率的顯著提升，有效改善了建庫效率。但該方法仍然具有步驟較多、操作繁瑣等缺點(diǎn)。

A Bhasin等發(fā)現(xiàn)Tn5Transposon可將任何雙鏈DNA插入到其他DNA片段中(A Bhasin，IY Goryshin，WS Reznikoff.Hairpin formation in Tn5transposition.Journal of Biological Chemistry,1999,274(52):37021-9)，唯一和必須的條件是此雙鏈DNA的兩端含19bp的特定順序(MEDS)。Epicentre用此原理開發(fā)了將Tn5Transposon用于第一代測(cè)序的試劑盒(EZ-Tn5<KAN-2>Insertion Kit)。

在此之后Epicentre發(fā)現(xiàn)，Transposon可用于同時(shí)插入兩條不同的DNA，只要這兩條DNA鏈的一端有MEDS順序，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)了第二代DNA測(cè)序試劑盒系列產(chǎn)品(TRANSPOSON END COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING NUCLEIC ACIDS.United States Patent Application Pub.No.US 20110287435A1.)。該方法較之上文介紹的文庫構(gòu)建方案，步驟更加簡(jiǎn)單，易于操作，大幅縮短了建庫操作時(shí)間。

但該方法亦存在缺點(diǎn)：該方法理論上可在斷裂形成的DNA片段兩端加上不同標(biāo)簽，但實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)座子插入序列的方向是隨機(jī)的，具有正反兩種可能，因此DNA片段兩端可能帶有相同的標(biāo)簽，無法進(jìn)行下游的PCR放大。實(shí)際上，可有效利用的DNA片段僅有50％。

因此，需要開發(fā)簡(jiǎn)單、高效、易于操作、成本較低的轉(zhuǎn)座子復(fù)合物及DNA文庫構(gòu)建技術(shù)，對(duì)于生命科研與精準(zhǔn)醫(yī)療事業(yè)來說至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物，該轉(zhuǎn)座子復(fù)合物可用于測(cè)序技術(shù)的基因組DNA文庫構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫構(gòu)建。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種包含上述環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種DNA文庫的構(gòu)建方法，通過“先插入、再切斷”，一步完成“片段化——加標(biāo)簽”的全過程，提高建庫效率，操作更簡(jiǎn)便。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物，所述環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物包含Tn5轉(zhuǎn)座酶和插入DNA。

本發(fā)明所述插入DNA包含轉(zhuǎn)座子末端序列、2個(gè)標(biāo)簽序列和含酶切位點(diǎn)的DNA序列；所述插入DNA兩端為轉(zhuǎn)座子末端序列，在轉(zhuǎn)座子末端序列內(nèi)側(cè)則是2個(gè)標(biāo)簽序列；所述2個(gè)標(biāo)簽序列之間為含酶切位點(diǎn)的DNA序列；所述含酶切位點(diǎn)的DNA序列包括但不限于含U的單鏈或雙鏈DNA序列、含限制性酶切位點(diǎn)的DNA序列、含有不互補(bǔ)堿基對(duì)的雙鏈DNA序列。

本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，所述環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物有且僅有一個(gè)插入DNA。

本發(fā)明所述的插入DNA可以通過化學(xué)合成或其它分子生物學(xué)方法獲得，其結(jié)構(gòu)形如“轉(zhuǎn)座子末端序列——第一標(biāo)簽序列——酶解序列——第二標(biāo)簽序列——轉(zhuǎn)座子末端序列”，其序列中第一標(biāo)簽序列和第二標(biāo)簽序列可以相同也可以不同，組成順序固定，且每個(gè)轉(zhuǎn)座子中保證有且僅有一個(gè)插入DNA分子，因此當(dāng)兩個(gè)標(biāo)簽序列不同時(shí)，這種結(jié)構(gòu)的每個(gè)轉(zhuǎn)座子所能提供的，是完全精確的兩個(gè)不同的標(biāo)簽序列，確保了斷裂片段兩端的接頭種類不同，使得靶DNA的利用率得到最大化。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物在構(gòu)建DNA文庫中的應(yīng)用。

本發(fā)明所使用的術(shù)語“標(biāo)簽序列”是指向它所接合的核酸片段提供尋址手段的非靶核酸組分的DNA序列。在本發(fā)明中，靶DNA經(jīng)體外轉(zhuǎn)座、酶解處理后得到了大量DNA片段，其兩端引入了標(biāo)簽序列。本發(fā)明標(biāo)簽序列可以依實(shí)驗(yàn)要求的不同，標(biāo)簽序列的設(shè)計(jì)可以靈活多樣，使得本發(fā)明環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物的應(yīng)用范圍得到極大擴(kuò)展，例如所述標(biāo)簽序列可以為PCR引物識(shí)別序列、二代測(cè)序接頭序列(包括測(cè)序儀錨定序列和測(cè)序引物識(shí)別序列)等，可用于二代測(cè)序技術(shù)的基因組DNA文庫構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫構(gòu)建、宏基因組測(cè)序文庫的構(gòu)建、PCR片段文庫構(gòu)建、大規(guī)模平行DNA測(cè)序文庫構(gòu)建，等等。因此，將本發(fā)明的環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物用于二代測(cè)序技術(shù)的基因組DNA文庫的構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建、宏基因組測(cè)序文庫的構(gòu)建、PCR片段文庫構(gòu)建、大規(guī)模平行DNA測(cè)序文庫的構(gòu)建等均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種高效的DNA文庫構(gòu)建方法，包括以下步驟：獲取靶DNA；獲取環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物：所述環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物包含Tn5轉(zhuǎn)座酶和插入DNA；將靶DNA與環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物孵育，酶解反應(yīng)；即得DNA文庫。

本發(fā)明所述插入DNA包含轉(zhuǎn)座子末端序列、2個(gè)標(biāo)簽序列和含酶切位點(diǎn)的DNA序列；所述插入DNA兩端為轉(zhuǎn)座子末端序列，在轉(zhuǎn)座子末端序列內(nèi)側(cè)則是2個(gè)標(biāo)簽序列；所述2個(gè)標(biāo)簽序列之間為含酶切位點(diǎn)的DNA序列。所述含酶切位點(diǎn)的DNA序列包括但不限于含U的單鏈或雙鏈DNA序列、含限制性酶切位點(diǎn)的DNA序列或含有不互補(bǔ)堿基對(duì)的雙鏈DNA序列。

本發(fā)明根據(jù)所述2個(gè)標(biāo)簽序列之間的帶有酶切位點(diǎn)的DNA序列不同，用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶解反應(yīng)：

當(dāng)所述2個(gè)標(biāo)簽序列之間為含限制性酶切位點(diǎn)的DNA序列，加入限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶解反應(yīng)；

當(dāng)所述2個(gè)標(biāo)簽序列之間的DNA序列為含U的單鏈或雙鏈DNA序列，加入U(xiǎn)DG酶進(jìn)行酶解反應(yīng)；

當(dāng)所述2個(gè)標(biāo)簽序列之間的DNA序列為含有不互補(bǔ)堿基對(duì)的雙鏈DNA序列，加入諸如T7endonuclease I、T4endonuclease VII或E.coli endonuclease V等核酸外切酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。

本發(fā)明使用Tn5轉(zhuǎn)座酶與兩端均帶有轉(zhuǎn)座子末端序列(MEDS)且中間帶酶切位點(diǎn)的插入DNA組成環(huán)狀的轉(zhuǎn)座子復(fù)合物，并將其與靶DNA(基因組DNA)孵育，將插入DNA隨機(jī)插入靶DNA中，此時(shí)靶DNA并未斷裂，然后用相應(yīng)的酶處理靶DNA，使其發(fā)生廣泛斷裂。因此，當(dāng)插入DNA攜帶的是兩個(gè)不同的標(biāo)簽序列時(shí)，斷裂后的靶DNA片段，5’、3’兩端的標(biāo)簽序列來自插入DNA，因而成為兩端帶不同標(biāo)簽序列的DNA片段。在插入的DNA中設(shè)計(jì)好標(biāo)簽序列，即可在Tn5轉(zhuǎn)座酶與能斷裂酶切位點(diǎn)的酶的共同作用下，收獲兩端帶有不同標(biāo)簽序列的大量DNA片段。然后以這些片段為模板，附以諸如PCR等擴(kuò)增步驟，即可完成以靶DNA為測(cè)序目標(biāo)的文庫構(gòu)建工作。

本發(fā)明是一種利用環(huán)狀轉(zhuǎn)座子與酶解反應(yīng)相結(jié)合，斷裂靶DNA的同時(shí)在斷裂形成的DNA片段末端引入標(biāo)簽序列的技術(shù)。通過調(diào)整反應(yīng)體系中環(huán)狀轉(zhuǎn)座子與靶DNA的濃度、體外轉(zhuǎn)座反應(yīng)的具體條件，可簡(jiǎn)單地控制斷裂產(chǎn)生的帶標(biāo)簽DNA片段的大小分布。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，在形成環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物后，可對(duì)其進(jìn)行純化工作，去除未參與反應(yīng)的Tn5轉(zhuǎn)座酶與插入DNA，獲得純的環(huán)狀轉(zhuǎn)座子提高轉(zhuǎn)座效率更高，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，用UDG酶斷裂體外轉(zhuǎn)座產(chǎn)物，UDG酶反應(yīng)條件十分寬泛，因此既可以首先單獨(dú)用UDG酶處理轉(zhuǎn)座產(chǎn)物，也可以與DNA聚合酶(如PCR酶)在同一反應(yīng)體系中共同作用，一步完成“片段化—加標(biāo)簽—擴(kuò)增”的全過程。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物應(yīng)有且僅有一個(gè)插入DNA。

本發(fā)明的有益效果如下：

傳統(tǒng)測(cè)序文庫構(gòu)建方法，步驟較多，操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，且文庫構(gòu)建效率低下，完成建庫需要最少4小時(shí)，且所需DNA量較大，通常需要1～5μg DNA作為建庫模板。Neiman等對(duì)該方法進(jìn)行步驟整合，加以改進(jìn)后，在一定程度上簡(jiǎn)化了操作，但仍然需要3小時(shí)左右才能完成文庫構(gòu)建，所需的DNA為5～1000ng，用量依舊較高。另外，通過在Neiman方法的基礎(chǔ)上對(duì)以上建庫方法作出改進(jìn)，使用具有不同末端結(jié)構(gòu)的接頭混合物與加A產(chǎn)物進(jìn)行連接，通過提升接頭連接效率以提升建庫效率，但對(duì)于建庫操作流程的簡(jiǎn)化有限。

本發(fā)明利用環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物的文庫構(gòu)建方法操作簡(jiǎn)便，建庫效率高，僅需80分鐘即可完成文庫構(gòu)建全程，所需的DNA量也大幅下降，1～50ng的靶DNA即足以用于建庫，且該方法成本顯著低于Illumina等公司的商品化試劑盒，推動(dòng)測(cè)序技術(shù)在生命科研與精準(zhǔn)醫(yī)療產(chǎn)業(yè)的廣泛應(yīng)用，具有重大而深遠(yuǎn)的意義。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1示出傳統(tǒng)二代測(cè)序文庫構(gòu)建原理示意圖；

圖2示出本發(fā)明的原理示意圖；

圖3示出利用本發(fā)明斷裂片段，PCR構(gòu)建文庫示意圖；

圖4示出實(shí)施例1轉(zhuǎn)座子與靶DNA反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)安捷倫高靈敏DNA芯片電泳圖；

圖5示出實(shí)施例1成功構(gòu)建二代測(cè)序文庫中DNA片段的結(jié)構(gòu)；

圖6示出實(shí)施例1PCR反應(yīng)模板及產(chǎn)物經(jīng)安捷倫高靈敏DNA芯片電泳圖。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例中所用的材料及來源：

UDG反應(yīng)混合物、MagicPure^TM Size Selection DNA Beads、TransNGS^TM Library Amplification SuperMix(2×)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，

安捷倫2100高靈敏DNA芯片(安捷倫公司)，

高靈敏DNA測(cè)試試劑(Thermo Fisher Scientific公司)，

DNA合成(Life technologies公司)，

二代測(cè)序(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)。

實(shí)施例1驗(yàn)證環(huán)狀轉(zhuǎn)座子可實(shí)現(xiàn)靶DNA的打斷，并同時(shí)插入標(biāo)簽序列

1.制備插入DNA

合成兩條長(zhǎng)度為72nt的兩端帶有的轉(zhuǎn)座子末端序列(5’磷酸化的序列如SEQ ID No.1所示，3’的序列如SEQ ID No.2所示；)、在轉(zhuǎn)座子末端序列內(nèi)側(cè)則是2個(gè)不同標(biāo)簽序列(下劃線為標(biāo)簽序列)、之間含2個(gè)U單鏈DNA，序列如下：

Insert DNA F:

5’-CTGTCTCTTATACACATCTTCCGAGCCCACGAGACUUAATCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(如序列表SEQ ID No.3所示)

Insert DNA R:

5’-CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGAUUAAGTCTCGTGGGCTCGGAAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(如序列表SEQ ID No.4所示)

將合成的兩條單鏈DNA粉末分別用1×雜交緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.0，50mM NaCl)溶解，濃度為200μM，等體積混合后進(jìn)行退火反應(yīng)。退火產(chǎn)物條件為：95℃5分鐘，緩慢冷卻至室溫。取1μl于2.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

退火產(chǎn)物即插入DNA，為1條72bp的雙鏈DNA，濃度100μM。其結(jié)構(gòu)符合“轉(zhuǎn)座子末端序列——第一標(biāo)簽序列——酶解序列——第二標(biāo)簽序列——轉(zhuǎn)座子末端序列”。

2.制備環(huán)狀轉(zhuǎn)座子

轉(zhuǎn)座酶Tn5經(jīng)BCA法定量，計(jì)算摩爾濃度。

配制Tn5儲(chǔ)存液：50mM HEPES-KOH pH 7.2，0.1M NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1％Triton X-100，10％glycerol。

配制反應(yīng)體系如下：

Tn5 (終濃度2μM)xμl

插入DNA(100μM) (終濃度2μM)2μl

Tn5儲(chǔ)存液 加至100μl

反應(yīng)條件為：30℃，1小時(shí)。-20℃保存。

3.轉(zhuǎn)座子與靶DNA反應(yīng)及UDG酶解反應(yīng)(如圖2所示)

以50ng大腸桿菌O157:H7基因組DNA為靶DNA，轉(zhuǎn)座子使用0.5μl/1μl/2μl，配制轉(zhuǎn)座反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件為：55℃，5分鐘。之后加入30μl UDG反應(yīng)混合物，55℃，5分鐘。

使用1.0×MagicPure^TM Size Selection DNA Beads純化以上60μl反應(yīng)混合物，使用0.5μl轉(zhuǎn)座子的產(chǎn)物記名為“片段化DNA-0.5”，使用1μl轉(zhuǎn)座子的產(chǎn)物記名為“片段化DNA-1”，使用2μl轉(zhuǎn)座子的產(chǎn)物記名為“片段化DNA-2”，片段化DNA使用安捷倫2100高靈敏DNA芯片檢測(cè)片段大小(如圖4)。

4.反應(yīng)產(chǎn)物驗(yàn)證(反應(yīng)的原理如圖3所示)

測(cè)序文庫中成功反應(yīng)產(chǎn)物DNA序列的結(jié)構(gòu)如圖5所示：

根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物兩端不同的標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)特異引物，以片段化DNA-2為模板，通過PCR方法驗(yàn)證反應(yīng)是否成功進(jìn)行。引物序列如下：

Tn5Primer F：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCTCGTCGGCAGCGTC-3’(如SEQ ID No.5所示)

Tn5Primer R：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGA-3’(如SEQ ID No.6所示)

PCR反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)條件為：

PCR產(chǎn)物使用1.0×MagicPure^TM Size Selection DNA Beads純化，產(chǎn)物使用安捷倫2100高靈敏DNA芯片檢測(cè)片段大小(如圖6)。經(jīng)高靈敏DNA測(cè)試試劑測(cè)定濃度，計(jì)算PCR模板量和產(chǎn)量分別為：片段化DNA-2模板量共28ng，經(jīng)5個(gè)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)量為370ng，經(jīng)7個(gè)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)量為1200ng。由于所用引物為針對(duì)標(biāo)簽序列a和b設(shè)計(jì)的特異引物，由此可知轉(zhuǎn)座子成功實(shí)現(xiàn)了靶DNA的打斷，并同時(shí)插入標(biāo)簽序列。

另外，通過本實(shí)驗(yàn)可以看出：靶DNA的片段化程度可簡(jiǎn)單地通過調(diào)整轉(zhuǎn)座子與靶DNA的反應(yīng)比例控制。轉(zhuǎn)座子與靶DNA反應(yīng)以及酶解反應(yīng)共需10分鐘，取代傳統(tǒng)二代測(cè)序文庫構(gòu)建片段化、末端修復(fù)、5’末端磷酸化、3’末端加dA和接頭連接過程，明顯簡(jiǎn)化二代建庫流程。

實(shí)施例2驗(yàn)證本發(fā)明方法可作為一種高效的二代測(cè)序文庫構(gòu)建方法。

1.制備插入DNA

同實(shí)施例1中步驟1。

2.制備環(huán)狀轉(zhuǎn)座子

同實(shí)施例1中步驟2。

3.轉(zhuǎn)座子與靶DNA反應(yīng)及UDG酶解反應(yīng)

以50ng人類血液基因組DNA為靶DNA，轉(zhuǎn)座子使用2μl。步驟同實(shí)施例1中步驟3。

4.PCR擴(kuò)增

同實(shí)施例1中步驟4，PCR循環(huán)數(shù)為7。

5.磁珠法分選產(chǎn)物片段大小

根據(jù)測(cè)序公司對(duì)二代測(cè)序文庫片段大小的要求，使用MagicPure^TM Size Selection DNA Beads分選片段大小，第一輪磁珠比例為0.6×，第二輪磁珠比例為0.15×，所得產(chǎn)物即為二代測(cè)序文庫，文庫記名為“Tn5_Human”。

6.使用二代測(cè)序儀驗(yàn)證文庫質(zhì)量

文庫經(jīng)Illumina Hiseq X^TM系統(tǒng)測(cè)序，測(cè)序策略為PE150。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制如表1，測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對(duì)結(jié)果如表2：

表1測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

表2測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對(duì)結(jié)果

從表2中可以看出：對(duì)于基因組較大的人類基因組DNA，僅僅50ng的起始樣品量，在測(cè)序深度約10×的情況下即可達(dá)到98.99％的覆蓋率，二代測(cè)序文庫構(gòu)建效果可與傳統(tǒng)文庫構(gòu)建方法媲美，且文庫構(gòu)建過程快速、操作簡(jiǎn)便，所需樣品量少。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京全式金生物技術(shù)有限公司

<120> 一種環(huán)狀轉(zhuǎn)座子復(fù)合物及其應(yīng)用

<130> JLC16I0775E

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成的轉(zhuǎn)座子末端序列

<400> 1

ctgtctctta tacacatct 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成的轉(zhuǎn)座子末端序列

<400> 2

agatgtgtat aagagacag 19

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成的Insert DNA F

<400> 3

ctgtctctta tacacatctt ccgagcccac gagacuuaat cgtcggcagc gtcagatgtg 60

tataagagac ag 72

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成的Insert DNA R

<400> 4

ctgtctctta tacacatctg acgctgccga cgauuaagtc tcgtgggctc ggaagatgtg 60

tataagagac ag 72

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成的Tn5 Primer F

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgctcg tcggcagcgt c 51

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成的Tn5 Primer R

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcgga 48