本發(fā)明涉及診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒的檢測試劑及試劑盒。
背景技術(shù)：
：手足口病是由腸道病毒引起的傳染病，引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種(型)，其中以EV71型腸道病毒(EV71)和A16型柯薩奇病毒(CoxA16，CA16)最為常見。但隨著流行趨勢的變化，有數(shù)據(jù)表明在2014年到2015年廣東省爆發(fā)的手足口病中，A10型的柯薩奇病毒(CoxA10，CA10)已經(jīng)取代了A16型的柯薩奇病毒(CoxA16，CA16)，成為了柯薩奇病毒常見的病原體。近年來我國北京市、上海市、廣東省、福建省、臺灣省等地均有規(guī)模爆發(fā)EV71型腸道病毒和A10型的柯薩奇病毒引起的手足口病，所以這兩種腸道病毒的早期檢測十分重要。然而，目前暫未報道有同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒的檢測試劑及試劑盒。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒的檢測試劑及試劑盒。一種同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒的檢測試劑，包括：用于擴(kuò)增EV71型腸道病毒的上游引物EV71F1，所述上游引物EV71F1的序列為SEQIDNo.1所示的序列；用于擴(kuò)增EV71型腸道病毒的下游引物EV71R1，所述下游引物EV71R1的序列為SEQIDNo.2所示的序列；用于檢測EV71型腸道病毒的探針EV71P1，所述探針EV71P1的兩端分別結(jié)合有第一熒光報告基團(tuán)和第一熒光淬滅基團(tuán)；用于擴(kuò)增A10型柯薩奇病毒的上游引物CA10F2，所述上游引物CA10F2的序列為SEQIDNo.3所示的序列；用于擴(kuò)增A10型柯薩奇病毒的下游引物CA10R2，所述下游引物CA10R2的序列為SEQIDNo.4所示的序列；以及用于檢測A10型柯薩奇病毒的探針CA10P2，所述探針CA10P2的兩端分別結(jié)合有第二熒光報告基團(tuán)和第二熒光淬滅基團(tuán)，所述第一熒光報告基團(tuán)與所述第二熒光報告基團(tuán)不同。在一個實施方式中，所述探針EV71P1的序列為SEQIDNo.5所示的序列。在一個實施方式中，所述探針CA10P2的序列為SEQIDNo.6所示的序列。在一個實施方式中，所述第一熒光報告基團(tuán)和所述第二熒光報告基團(tuán)均選自FAM熒光基團(tuán)、ROX熒光基團(tuán)、VIC熒光基團(tuán)、JOE熒光基團(tuán)、TET熒光基團(tuán)、CY3熒光基團(tuán)、CY5熒光基團(tuán)、TexasRed熒光基團(tuán)和LCRED640熒光基團(tuán)中的一種；所述第一熒光淬滅基團(tuán)和所述第二熒光淬滅基團(tuán)均選自BHQ1淬滅基團(tuán)、BHQ2淬滅基團(tuán)、BHQ3淬滅基團(tuán)、Dabcy1淬滅基團(tuán)和Tamra淬滅基團(tuán)中的一種。在一個實施方式中，所述探針EV71P1的5’端結(jié)合有第一熒光報告基團(tuán)，所述探針EV71P1的3’端結(jié)合有第一熒光淬滅基團(tuán)，所述第一熒光報告基團(tuán)為FAM熒光基團(tuán)，所述第一熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1淬滅基團(tuán)。在一個實施方式中，所述探針CA10P2的5’端結(jié)合有第二熒光報告基團(tuán)，所述探針CA10P2的3’端結(jié)合有第二熒光淬滅基團(tuán)，所述第二熒光報告基團(tuán)為VIC熒光基團(tuán)，所述第二熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1淬滅基團(tuán)。在一個實施方式中，所述上游引物EV71F1、所述下游引物EV71R1、所述探針EV71P1的摩爾比為1:1:1，所述上游引物CA10F2、所述下游引物CA10R2、所述探針CA10P2的摩爾比為1:1:1，所述探針EV71P1與所述探針CA10P2的摩爾比為1:1。一種同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒的試劑盒，包括上述的檢測試劑。在一個實施方式中，還包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陽性對照品以及陰性對照品。在一個實施方式中，所述PCR反應(yīng)液包括終濃度為20mmol/L～30mmol/L的MgCl2和終濃度為5mmol/L～15mmol/L的dNTPs；所述酶混合液包括熱啟動Taq酶和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶；所述陽性對照品為滅活的EV71型腸道病毒及A10型柯薩奇病毒的病毒培養(yǎng)液；所述陰性對照品為去RNA酶的無菌水。用上述檢測試劑對樣本進(jìn)行處理后，上游引物EV71F1、下游引物EV71R1、探針EV71P1、上游引物CA10F2、下游引物CA10R2以及探針CA10P2相互配合，能夠?qū)崿F(xiàn)同時對樣本中EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒擴(kuò)增。然后通過熒光PCR分別檢測第一熒光報告基團(tuán)的信號以及第二熒光報告基團(tuán)的信號的強(qiáng)度，判定樣本中是否含有EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒，實現(xiàn)同一個樣本同時檢測是否感染EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒。該檢測試劑能夠?qū)σ还軜?biāo)本同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒兩個項目，節(jié)省一半的時間，而且只需操作一次，減少了污染產(chǎn)生的機(jī)會。用上述檢測試劑檢測的靈敏度高、特異性好、可重復(fù)性強(qiáng)、檢測結(jié)果快速客觀，在臨床診斷、疾病預(yù)防檢測領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為實施例2中雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)的原理圖；圖2為實施例2中樣本1的PCR擴(kuò)增曲線圖。具體實施方式下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說明。一實施方式的同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒的檢測試劑，包括用于擴(kuò)增EV71型腸道病毒的上游引物EV71F1、用于擴(kuò)增EV71型腸道病毒的下游引物EV71R1、用于檢測EV71型腸道病毒的探針EV71P1、用于擴(kuò)增A10型柯薩奇病毒的上游引物CA10F2、用于擴(kuò)增A10型柯薩奇病毒的下游引物CA10R2以及用于檢測A10型柯薩奇病毒的探針CA10P2。其中，用于擴(kuò)增EV71型腸道病毒的上游引物EV71F1的序列為SEQIDNo.1所示的序列，下游引物EV71R1的序列為SEQIDNo.2所示的序列。檢測EV71型腸道病毒的探針EV71P1的兩端分別結(jié)合有第一熒光報告基團(tuán)和第一熒光淬滅基團(tuán)。用于擴(kuò)增A10型柯薩奇病毒的上游引物CA10F2的序列為SEQIDNo.3所示的序列，下游引物CA10R2的序列為SEQIDNo.4所示的序列。檢測A10型柯薩奇病毒的探針CA10P2的兩端分別結(jié)合有第二熒光報告基團(tuán)和第二熒光淬滅基團(tuán)，第一熒光報告基團(tuán)與所述第二熒光報告基團(tuán)不同。在其中一個實施例中，探針EV71P1的序列為SEQIDNo.5所示的序列?？梢岳斫?，在其他實施例中，探針EV71P1的序列不僅限于SEQIDNo.5所示的序列，只要能夠檢測EV71型腸道病毒即可。在其中一個實施例中，探針CA10P2的序列為SEQIDNo.6所示的序列。可以理解，在其他實施例中，探針CA10P2的序列不僅限于SEQIDNo.6所示的序列，只要能夠檢測A10型柯薩奇病毒即可。具體地，上游引物EV71F1、下游引物EV71R1、探針EV71P1、上游引物CA10F2、下游引物CA10R2以及探針CA10P2可以采用primer5.0專用軟件設(shè)計，將設(shè)計的引物和探針預(yù)先在NCBI的GeneBank進(jìn)行比對，檢測引物和探針的特異性。引物和探針在專業(yè)合成公司合成，采用紫外分光光度計測定光密度值(A260nm/A280nm在1.8～2.0之間為合格)。用檢測試劑對樣本進(jìn)行處理后，可通過雙重?zé)晒舛縋CR技術(shù)，由于檢測試劑中含有針對EV71病毒和柯薩奇A10型病毒的特異性引物和探針，因此能夠?qū)崿F(xiàn)了在同一反應(yīng)體系中同時檢測EV71病毒和柯薩奇A10型病毒的目的。其中，第一熒光報告基團(tuán)和第二熒光報告基團(tuán)均可選自FAM熒光基團(tuán)、ROX熒光基團(tuán)、VIC熒光基團(tuán)、JOE熒光基團(tuán)、TET熒光基團(tuán)、CY3熒光基團(tuán)、CY5熒光基團(tuán)、TexasRed熒光基團(tuán)和LCRED640熒光基團(tuán)中的任意一種。第一熒光淬滅基團(tuán)和第二熒光淬滅基團(tuán)均可選自BHQ1淬滅基團(tuán)、BHQ2淬滅基團(tuán)、BHQ3淬滅基團(tuán)、Dabcy1淬滅基團(tuán)和Tamra淬滅基團(tuán)中的任意一種。第一熒光報告基團(tuán)與所述第二熒光報告基團(tuán)不同，便于在熒光PCR中通過不同的熒光信號通道分別檢測判定樣本中是否含有EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒。如果能夠檢測到第一熒光報告基團(tuán)的信號，而沒有第二熒光報告基團(tuán)的信號，則說明樣本中含有EV71型腸道病毒并且不含有A10型柯薩奇病毒。如果能夠檢測到第二熒光報告基團(tuán)的信號，而沒有第一熒光報告基團(tuán)的信號，則說明樣本中含有A10型柯薩奇病毒并且不含有EV71型腸道病毒。如果能夠檢測到第一熒光報告基團(tuán)和第二熒光報告基團(tuán)的信號，則說明樣本中同時含有有EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒；如果能夠同時沒有檢測到第一熒光報告基團(tuán)和第二熒光報告基團(tuán)的信號，則說明樣本中不含有EV71型腸道病毒并且不含有A10型柯薩奇病毒。第一熒光淬滅基團(tuán)和第二熒光淬滅基團(tuán)可以相同，也可以不同，本實施例中，二者相同。本實施例中，探針EV71P1的5’端結(jié)合有第一熒光報告基團(tuán)，探針EV71P1的3’端結(jié)合有第一熒光淬滅基團(tuán)，第一熒光報告基團(tuán)為FAM熒光基團(tuán)，第一熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1淬滅基團(tuán)。探針CA10P2的5’端結(jié)合有第二熒光報告基團(tuán)，探針CA10P2的3’端結(jié)合有第二熒光淬滅基團(tuán)，第二熒光報告基團(tuán)為VIC熒光基團(tuán)，第二熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1淬滅基團(tuán)。在其中一個實施例中，檢測試劑為混合均勻的混合物，上游引物EV71F1、下游引物EV71R1、探針EV71P1的摩爾比為1:1:1。上游引物CA10F2、下游引物CA10R2、探針CA10P2的摩爾比為1:1:1，探針EV71P1與探針CA10P2的摩爾比為1:1。該混合配比的檢測試劑靈敏度高，特異性好。采用檢測試劑對樣本進(jìn)行處理后，若檢測樣本中含有EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒，能夠?qū)崿F(xiàn)對EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒迅速擴(kuò)增，實現(xiàn)在同一個樣本同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒。上述檢測試劑，上游引物EV71F1、下游引物EV71R1、探針EV71P1、上游引物CA10F2、下游引物CA10R2以及探針CA10P2相互配合，能夠?qū)崿F(xiàn)同時對樣本中EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒擴(kuò)增。然后通過熒光PCR分別檢測第一熒光報告基團(tuán)的信號以及第二熒光報告基團(tuán)的信號的強(qiáng)度，判定樣本中是否含有EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒，實現(xiàn)同一個樣本同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒。靈敏度高、特異性好、可重復(fù)性強(qiáng)、檢測結(jié)果快速客觀。此外，本發(fā)明還提供一實施方式的同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒的試劑盒，該試劑盒中含有上述的檢測試劑。在其中一個實施例中，試劑盒中還包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陽性對照品以及陰性對照品。在其中一個實施例中，PCR反應(yīng)液為RT-PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液中包括終濃度為20mmol/L～30mmol/L的MgCl2和終濃度為5mmol/L～15mmol/L的dNTPs。當(dāng)然，PCR反應(yīng)液還可以含有反應(yīng)緩沖液，例如為Tris-HCl緩沖液等。PCR反應(yīng)液為樣本的擴(kuò)增提供需要的原料以及擴(kuò)增條件。酶混合液可以包括熱啟動Taq酶和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，提高擴(kuò)增的效率。陽性對照品為滅活的EV71型腸道病毒及A10型柯薩奇病毒的病毒培養(yǎng)液，陰性對照品為去RNA酶的無菌水。使用時，提取樣本中的RNA，將PCR反應(yīng)液、酶混合液、檢測試劑以及按一定比例與提取的RNA混合，通過實時熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)熒光曲線判斷是否感染EV71型腸道病毒或者A10型柯薩奇病毒。實現(xiàn)同一個樣本同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒。一管標(biāo)本同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒兩個項目，節(jié)省一半的時間，而且只需操作一次，減少了污染產(chǎn)生的機(jī)會。上述試劑盒檢測的靈敏度高、特異性好、可重復(fù)性強(qiáng)、檢測結(jié)果快速客觀，在臨床診斷、疾病預(yù)防檢測領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。下面為具體實施例部分。以下實施例中，如無特別說明，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如參見薩姆布魯克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟楓等譯)所著的的分子克隆實驗指南[M](北京：科學(xué)出版社，1992)中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實現(xiàn)。實施例中所使用的試劑均為市售。實施例1提供一種同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒的試劑盒，所述試劑盒包括RT-PCR反應(yīng)液、檢測試劑、酶混合液、陽性對照和陰性對照。其中，RT-PCR反應(yīng)液包括10×緩沖液、終濃度為25mmol/L的MgCl2和終濃度為10mmol/L的dNTPs。檢測試劑包括用于擴(kuò)增EV71型腸道病毒的上游引物EV71F1、用于擴(kuò)增EV71型腸道病毒的下游引物EV71R1、用于檢測EV71型腸道病毒的探針EV71P1、用于擴(kuò)增A10型柯薩奇病毒的上游引物CA10F2、用于擴(kuò)增A10型柯薩奇病毒的下游引物CA10R2以及用于檢測A10型柯薩奇病毒的探針CA10P2。上游引物EV71F1的序列為SEQIDNo.1所示的序列，下游引物EV71R1的序列為SEQIDNo.2所示的序列。上游引物CA10F2的序列為SEQIDNo.3所示的序列，下游引物CA10R2的序列為SEQIDNo.4所示的序列。探針EV71P1的5’端結(jié)合有第一熒光報告基團(tuán)，探針EV71P1的3’端結(jié)合有第一熒光淬滅基團(tuán)，第一熒光報告基團(tuán)為FAM熒光基團(tuán)，第一熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1淬滅基團(tuán)。探針CA10P2的5’端結(jié)合有第二熒光報告基團(tuán)，探針CA10P2的3’端結(jié)合有第二熒光淬滅基團(tuán)，第二熒光報告基團(tuán)為VIC熒光基團(tuán)，第二熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1淬滅基團(tuán)。上游引物EV71F1的濃度為為400nmol/L，下游引物EV71R1的濃度為400nmol/L，探針EV71P1的濃度為為400nmol/L。上游引物CA10F2的濃度為400nmol/L，下游引物CA10R2的濃度為400nmol/L，探針CA10P2的濃度為400nmol/L。酶混合液包括Taq酶和逆轉(zhuǎn)入酶，其中，Taq酶為熱啟動Taq酶，逆轉(zhuǎn)入酶為MMLV逆轉(zhuǎn)入酶。陽性對照品為滅活的EV71型腸道病毒及A10型柯薩奇病毒的病毒培養(yǎng)液，陰性對照品為去RNA酶的無菌水。實施例2采用實施例1的試劑盒檢測樣本中的EV71型腸道病毒及A10型柯薩奇病毒1、提取樣本RNA，例如可采用商品化核酸RNA提取試劑盒OMEGAE.Z.N.A.TotalRNAKitI(OMEGA，R6834-01)從病毒分離培養(yǎng)物中提取病毒RNA。具體步驟如下：1.1取200ul臨床樣品，加入400ulBindingbuffersupplementedwithpoly(A)，充分混勻后轉(zhuǎn)入高純化過濾管，8000rmp離心15s，棄去過濾管中的廢液。1.2加入500ulInhibitorRemovalBuffer至過濾管，8000rmp離心1min，棄去過濾管中的廢液。1.3加入450ulWashingbuffer至過濾管，8000rmp離心1min，棄去過濾管中的廢液；1.4重復(fù)步驟1.3，然后高速離心10s，此步驟務(wù)必將廢液去除干凈；1.5加入50ulElutionbuffer至過濾管中，室溫靜置2min，8000rmp離心1min，離心所得溶液即為純化的RNA。2、在每個PCR反應(yīng)管放入組分如表1中所示的EV71/A10型柯薩奇病毒檢測試劑(實施例1制備)和RNA樣本。表1：反應(yīng)液組分反應(yīng)液組分加樣(ul)/人份RT-PCR反應(yīng)液7酶混合液4.5檢測試劑5去RNA酶的無菌水(陰性參考品)3.5RNA樣本5總體積253、在熒光定量PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增，按照下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增:4、擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)熒光曲線判斷是否感染EV71型腸道病毒及A10型柯薩奇病毒如圖1所示，由于針對EV71型腸道病毒的探針EV71P1上標(biāo)記FAM，針對A10型柯薩奇病毒的探針CA10P2上標(biāo)記VIC。PCR反應(yīng)過程中，若待檢樣本包含EV71型腸道病毒，則標(biāo)記FAM的探針產(chǎn)生熒光信號。若待檢樣本包含A10型柯薩奇病毒，則標(biāo)記VIC的探針產(chǎn)生熒光信號。這樣，同一管反應(yīng)則可確定兩個靶基因。結(jié)果判定：在FAM通道內(nèi)熒光曲線呈“S”型且CT≤35.0，判斷為EV71型腸道病毒陽性；無典型“S”型擴(kuò)增或CT＞35.0，判斷為EV71型腸道病毒陰性；在VIC通道內(nèi)熒光曲線呈“S”型曲線且CT≤35.0，判斷為A10型柯薩奇病毒陽性，無典型“S”型擴(kuò)增或CT＞35.0，判斷為A10型柯薩奇病毒陰性。5個臨床樣本具體檢測結(jié)果見表2。其中樣本1的擴(kuò)增曲線如圖2所示。表2：檢測結(jié)果從表2中的結(jié)果表明，樣本1感染EV71型腸道病毒，但未感染A10型柯薩奇病毒。樣本2感染EV71型腸道病毒，但未感染A10型柯薩奇病毒。樣本3同時感染了EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒。樣本4未感染EV71型腸道病毒，但感染A10型柯薩奇病毒。樣本5未感染EV71型腸道病毒，也未感染A10型柯薩奇病毒。以上結(jié)果表明實施例1提供的該試劑盒能夠在一管標(biāo)本同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒兩個項目，節(jié)省一半的時間，而且只需操作一次，減少了污染產(chǎn)生的機(jī)會。檢測的靈敏度高、特異性好、可重復(fù)性強(qiáng)、檢測結(jié)果快速客觀，在臨床診斷、疾病預(yù)防檢測領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的一種或幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。SEQUENCELISTING<110>深圳市艾偉迪生物科技有限公司<120>同時檢測EV71型腸道病毒和A10型柯薩奇病毒的檢測試劑及試劑盒<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>上游引物EV71F1<400>1gcgggattagttggagagata21<210>2<211>21<212>DNA<213>下游引物EV71R1<400>2ttgcgcgtaacctgttatatc21<210>3<211>20<212>DNA<213>上游引物CA10F2<400>3tcaatctttgttaaactcac20<210>4<211>21<212>DNA<213>下游引物CA10R2<400>4ttagggcataatccgtatgct21<210>5<211>25<212>DNA<213>探針EV71P1<400>5accatttgggttagttgtgccttca25<210>6<211>25<212>DNA<213>探針CA10P2<400>6agtccctttcatgtccccggccagt25當(dāng)前第1頁1 2 3