本發(fā)明涉及熒光定量PCR反應(yīng)的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種監(jiān)控?zé)晒舛縋CR反應(yīng)污染的方法，本發(fā)明也涉及一種陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒在監(jiān)控?zé)晒舛縋CR反應(yīng)污染中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光定量PCR作為一種常用的技術(shù)手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到各種檢測(cè)領(lǐng)域。但是在進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)時(shí)，常常出現(xiàn)PCR污染，尤其是PCR氣溶膠污染，并且往往難以判斷污染源，給科研工作帶來(lái)了相當(dāng)大的困擾。

特別地，基于熒光定量PCR的基因分型是現(xiàn)代個(gè)體化用藥常用的技術(shù)手段，與傳染病病原體檢測(cè)不同的是，病原體檢測(cè)往往關(guān)注的是待檢標(biāo)本里面是否存在某種病原體以及存在數(shù)量的差異，而個(gè)體基因分型不同，待檢標(biāo)本里面已經(jīng)非常明確基因組DNA的存在，檢測(cè)結(jié)果不是這個(gè)基因型就是那個(gè)基因型的問(wèn)題，即非“左”即“右”的問(wèn)題，這種情況下，一旦出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染往往很難鑒別，導(dǎo)致在檢測(cè)結(jié)果上出現(xiàn)誤判。而目前作為一種成熟的檢測(cè)方法，往往需要設(shè)立比較好的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照來(lái)確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果的可靠性，基因分型方法目前常用的陽(yáng)性對(duì)照包括基因組DNA和質(zhì)粒，其中基因組DNA來(lái)源以及規(guī)?；a(chǎn)比較困難，而質(zhì)粒因?yàn)橹苽浜?jiǎn)單而廣泛使用，但帶來(lái)的問(wèn)題是不可避免的出現(xiàn)氣溶膠污染的問(wèn)題。

綜上所述，如何監(jiān)控PCR氣溶膠污染，特別地在基因分型方法中如何監(jiān)控PCR氣溶膠污染，是一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種監(jiān)控?zé)晒舛縋CR反應(yīng)污染的方法，以及提供一種陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒在監(jiān)控?zé)晒舛縋CR反應(yīng)污染中的應(yīng)用，以準(zhǔn)確地確定污染的來(lái)源。

為此，本發(fā)明提供了一種監(jiān)控?zé)晒舛縋CR反應(yīng)污染的方法，其包括下列步驟：

a.制備陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒，該陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒上包含待檢目的基因和外參基因，該待檢目的基因和外參基因不同源或同源性低至兩者的相應(yīng)引物不會(huì)錯(cuò)配；

b.制備PCR反應(yīng)混合物，其包含：目的基因的引物和熒光探針；內(nèi)參基因的引物和熒光探針；外參基因的引物和熒光探針；所述各個(gè)熒光探針具有不同的熒光基團(tuán)；

c.在待檢樣品管的PCR反應(yīng)混合物中加入待檢樣品DNA模板，在陽(yáng)性對(duì)照管的PCR反應(yīng)混合物中加入陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

d.所有檢測(cè)管中擴(kuò)增的目的基因應(yīng)全部為陽(yáng)性，否則確定擴(kuò)增失??；

e.待檢樣品管中擴(kuò)增的內(nèi)參基因應(yīng)全部為陽(yáng)性，否則確定擴(kuò)增失??；

f.待檢樣品管中擴(kuò)增的外參基因應(yīng)全部為陰性，否則確定待檢樣品被陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒氣溶膠污染；

g.陽(yáng)性對(duì)照管中擴(kuò)增的內(nèi)參基因應(yīng)全部為陰性，否則確定被PCR產(chǎn)物氣溶膠污染；

h.陽(yáng)性對(duì)照管中擴(kuò)增的外參基因應(yīng)全部為陽(yáng)性，否則確定擴(kuò)增失敗。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的監(jiān)控?zé)晒舛縋CR反應(yīng)污染的方法，還包括步驟i.在陰性對(duì)照管中加入PCR反應(yīng)混合物和無(wú)菌純凈水，陰性對(duì)照管中擴(kuò)增的全部基因應(yīng)全部為陰性,如果陰性對(duì)照管中出現(xiàn)外參基因陽(yáng)性信號(hào)，確定為陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒氣溶膠污染；在外參基因是陰性條件下其它通道出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，則確定為PCR產(chǎn)物氣溶膠污染。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒在監(jiān)控?zé)晒舛縋CR反應(yīng)污染中的應(yīng)用，該陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒包含待檢目的基因和外參基因，該待檢目的基因和外參基因不同源或同源性低至兩者的相應(yīng)引物不會(huì)錯(cuò)配。

優(yōu)選地，本發(fā)明中待檢目的基因是人源的，該外參基因是植物來(lái)源的，例如，玉米16S RNA基因。該待檢目的基因是同一SNP位點(diǎn)的不同基因型，例如，人線粒體乙醛脫氫酶ALDH2基因。

本發(fā)明中所述的熒光探針可以是本領(lǐng)域可以商購(gòu)合成的任何熒光探針，例如MGB探針、BHQ2、TaqMan、AllGlo和LNA熒光探針，并且不限于此。

本發(fā)明采用雙參照質(zhì)控體系，內(nèi)參基因用于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系可能存在的抑制因素，包括PCR產(chǎn)物氣溶膠污染，外參基因用于監(jiān)控陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的氣溶膠污染。

通過(guò)本發(fā)明的上述技術(shù)方案，可以得知每一個(gè)待檢樣品是否被陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒污染，同時(shí)因?yàn)殛?yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的對(duì)照孔沒(méi)有內(nèi)參品序列，因此通過(guò)對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒樣品的檢測(cè)，可以判定是否被PCR產(chǎn)物氣溶膠污染。

此方案與傳統(tǒng)方案的優(yōu)勢(shì)在于，以往傳統(tǒng)方案通過(guò)設(shè)立陰性對(duì)照孔監(jiān)控污染，只能通過(guò)陰性對(duì)照孔是否出現(xiàn)信號(hào)判斷是否出現(xiàn)污染，至于這種污染的來(lái)源是PCR產(chǎn)物氣溶膠還是陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒則無(wú)法判明，而本方案不僅可以區(qū)分是PCR產(chǎn)物氣溶膠污染還是陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒污染，而且如果是陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒出現(xiàn)污染，還能判定具體是哪個(gè)樣品出現(xiàn)污染，這種優(yōu)勢(shì)是通過(guò)傳統(tǒng)的陰性對(duì)照方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，如無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法和步驟均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法和步驟，所涉及的試劑均為可以商購(gòu)得到。

附圖說(shuō)明

圖1是一個(gè)待檢樣品的ALDH2 1510GG型樣本擴(kuò)增結(jié)果圖。

圖2是另一個(gè)待檢樣品的ALDH2 1510GA型樣本擴(kuò)增結(jié)果圖。

圖3是另一個(gè)待檢樣品的ALDH2 1510AA型樣本擴(kuò)增結(jié)果圖。

圖4是圖1至圖3待檢樣品的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果圖。

圖5是另一個(gè)待檢樣品的ALDH2 1510GG型樣本擴(kuò)增結(jié)果圖，表明被陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒氣溶膠污染。

具體實(shí)施方式

硝酸甘油是心絞痛發(fā)作的首選治療藥物，但其臨床有效性因人而異。大量的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)證明，人線粒體乙醛脫氫酶的活性高低與硝酸甘油在體內(nèi)的療效密切相關(guān)。人線粒體乙醛脫氫酶ALDH2基因具有遺傳多態(tài)性，其中與亞洲人群最為密切的是ALDH2基因的c.1510位核苷酸存在G/A多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)為A時(shí)(被稱為ALDH2*2型)，其編碼的多肽鏈第504位氨基酸Glu被Lys取代，引起酶失活。ALDH2*2型基因攜帶者硝酸甘油代謝速率大大降低，從而無(wú)法產(chǎn)生一氧化氮，難以發(fā)揮藥效。通過(guò)檢測(cè)人ALDH2基因多態(tài)性可指導(dǎo)硝酸甘油合理用藥。研究發(fā)現(xiàn)，突變型基因ALDH2*2的存在能導(dǎo)致ALDH2活力的嚴(yán)重缺失，并與過(guò)度飲酒導(dǎo)致的酒精依賴、酒精性中毒、酒精性肝病、消化道癌癥等疾病之間存在密切聯(lián)系。

實(shí)施例1：構(gòu)建陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒和提取質(zhì)粒：

通過(guò)PCR引物和定點(diǎn)突變方法，將ALDH2基因1510G>A位點(diǎn)附近上下游232bp和玉米16S RNA基因上的核苷酸片段插入到pMD18T載體中，這些片段在載體上的排列順序如下：

含ALDH2基因型AA序列(長(zhǎng)度232bp)----玉米16S RNA基因(長(zhǎng)度173bp)----含ALDH2基因型GG序列(長(zhǎng)度232bp)。

按照分子克隆的常規(guī)技術(shù)，將該陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α的大腸桿菌，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，用商購(gòu)試劑盒進(jìn)行該質(zhì)粒的提取，作為陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的DNA模板。

實(shí)施例2：合成引物：

陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒上的ALDH2基因如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒上的玉米16S RNA基因如SEQ ID NO.3所示。

用于ALDH2SNP位點(diǎn)基因分型的引物和探針ALDH2-F(SEQ ID NO.4)、ALDH2-R(SEQ ID NO.5)、ALDH2-P1(SEQ ID NO.6，熒光基團(tuán)FAM-MGB)、ALDH2-P2(SEQ ID NO.7，熒光基團(tuán)HEX-MGB)。

用于內(nèi)參基因RNase P基因的引物和探針RnaseP-F(SEQ ID NO.8)、RnaseP-R(SEQ ID NO.9)、RnaseP-P(SEQ ID NO.10，熒光基團(tuán)ROX-BHQ2)。

用于外參基因16S RNA基因的引物和探針16S-F(SEQ ID NO.11)、16S-R(SEQ ID NO.12)、16S-P(SEQ ID NO.13，熒光基團(tuán)：TAMRA-BHQ2)。

上述質(zhì)粒構(gòu)建及引物合成均委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。DNA提取試劑盒也購(gòu)自該公司。

實(shí)施例3：反應(yīng)體系的建立：

本發(fā)明采用雙參照質(zhì)控體系，內(nèi)參基因用于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系可能存在的抑制因素，包括PCR產(chǎn)物氣溶膠污染，外參基因用于監(jiān)控陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒造成的PCR氣溶膠污染。外參基因與目的基因無(wú)同源性，雙參照探針選擇的是與目的基因探針沒(méi)有沖突的另兩個(gè)檢測(cè)通道。

另外，本實(shí)施例也設(shè)了陰性對(duì)照，也可以不設(shè)陰性對(duì)照，此為可選步驟。

待測(cè)樣本核酸提取采用本公司基于離心柱方法的核酸提取試劑，從全血標(biāo)本中進(jìn)行DNA提取，具體操作步驟如下。

1、取200μl全血標(biāo)本，加入到一1.5ml離心管中。

2、加入20μl Proteinase K溶液，混勻。

3、加入200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，56℃放置10min，期間顛倒混勻數(shù)次，溶液應(yīng)變清亮。(如溶液未徹底清亮，請(qǐng)延長(zhǎng)裂解時(shí)間至溶液清亮為止)。

注意：加入緩沖液GB時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般56℃放置時(shí)會(huì)消失，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果溶液未變清亮，說(shuō)明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取出的DNA不純。當(dāng)血液體積小于200μl且沒(méi)有采取紅細(xì)胞裂解處理，或是樣本儲(chǔ)存條件不佳，水浴后顏色可能變?yōu)樯詈稚?，注意溶液中不?yīng)該有團(tuán)塊沉淀。

4、加200μl無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。

5、將上步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12000rpm(13400×g)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

6、向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm(13400×g)離心30秒，倒掉收集管中廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

7、向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm(13400×g)離心30秒，倒掉收集管中廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

8、向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm(13400×g)離心30秒，倒掉收集管中廢液。

9、向吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

10、將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中向吸附膜中間位置懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TB，室溫放置2—5min，12000rpm(13400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中。

所述PCR反應(yīng)液，包括UDG酶防污染體系，所述UDG酶防污染體系，包括：UDG酶及dUTP，用于消除PCR產(chǎn)物造成的污染。

本擴(kuò)增體系如下：

其中2×PCR反應(yīng)液采用商業(yè)化DNA Mix，包含UNG防污染體系。

陰性對(duì)照管，也加入上述PCR反應(yīng)混合物，但是以無(wú)菌水替代模板DNA。

體系配置完成后在ABI 7500上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件設(shè)置為：37℃，5min；95℃，5min；然后，95℃，1,5s，60℃，35s(熒光收集)，40個(gè)循環(huán)；25℃，1min。

反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熒光曲線進(jìn)行手動(dòng)或自動(dòng)調(diào)整基線和閾值，手動(dòng)調(diào)整基線(Non-adaptive baseline)的起始點(diǎn)(Start)一般設(shè)定為5～8，終止點(diǎn)(Stop)一般設(shè)定為12～15，閾值線通常剛好高過(guò)陰性擴(kuò)增曲線。設(shè)定之后，可以得到各待檢樣品的Ct值。

檢測(cè)結(jié)果的判斷

依據(jù)下列判斷檢測(cè)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1至圖5所示。其中圖1至圖4表示3個(gè)待檢樣品無(wú)氣溶膠污染的擴(kuò)增結(jié)果。而圖5則表示1個(gè)待檢樣品受到了陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒氣溶膠污染。

上述僅僅是示例性的說(shuō)明，本發(fā)明不限于基因分型的PCR污染監(jiān)控，可以用于任何多重PCR檢測(cè)的污染監(jiān)控。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京海斯凱生物科技有限公司

<120> 一種監(jiān)控?zé)晒舛縋CR反應(yīng)污染的方法

<130> CNC1F170037443

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒上待檢目的基因

<400> 1

atctcgtttc aaattacagg gtcaactgct atgatgtgtt tggagcccag tcaccctttg 60

gtggctacaa gatgtcgggg agtggccggg agttgggcga gtacgggctg caggcataca 120

ctaaagtgaa aactgtgagt gtgggacctg ctgggggctc agggcctgtt ggggcttgag 180

ggtctgctgg tggctcggag cctgctgggg gattggggtc tgttgggggc tc 232

<210> 2

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒上待檢目的基因

<400> 2

atctcgtttc aaattacagg gtcaactgct atgatgtgtt tggagcccag tcaccctttg 60

gtggctacaa gatgtcgggg agtggccggg agttgggcga gtacgggctg caggcataca 120

ctgaagtgaa aactgtgagt gtgggacctg ctgggggctc agggcctgtt ggggcttgag 180

ggtctgctgg tggctcggag cctgctgggg gattggggtc tgttgggggc tc 232

<210> 3

<211> 173

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒上外參基因

<400> 3

ttggcggcgg aggaagactc ggcatgaagg ccagccgccc ggtggtgtgg tacgtagtgg 60

taatagtacg cgccccgctc cgaaacaaag aaaaaggtgc gtgccgcact cacgagggac 120

tgccagtgag atactggagg aaggtgggga tgacgtcaag tccgcatggc cct 173

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 目的基因正向引物

<400> 4

ggagtggccg ggagttg 17

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 目的基因反向引物

<400> 5

gcaggtccca cactcacagt t 21

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 目的基因探針

<400> 6

aggcatacac tgaagt 16

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 目的基因探針

<400> 7

aggcatacac taaagtg 17

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 內(nèi)參基因正向引物

<400> 8

gaggcaggag aatggtgtga a 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 內(nèi)參基因反向引物

<400> 9

gctctgtcat ccaggttgca 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 內(nèi)參基因探針

<400> 10

cttgcagtga gccaagattg cacca 25

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 外參基因正向引物

<400> 11

ccggtggtgt ggtacgtagt g 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 外參基因反向引物

<400> 12

ggcacgcacc tttttctttg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 外參基因探針

<400> 13

tagtacgcgc cccgctccga 20