本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種與獼猴桃可溶性固形物性狀QTL位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

獼猴桃富含維生素C、膳食纖維和多種礦物質(zhì)營養(yǎng)，是一種深受消費(fèi)者青睞的健康水果。中國是獼猴桃屬植物的原始起源中心，獼猴桃資源極為豐富，遺傳多樣性高，中國擁有全世界獼猴桃物種資源總數(shù)的96％左右。憑借豐富的自然資源，選育聚合優(yōu)良性狀的新品種，對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展起到關(guān)鍵作用?？扇苄怨绦挝锸撬腥芙庥谒幕衔锏目偡Q，包括糖、酸、維生素、礦物質(zhì)等，是影響果實(shí)品質(zhì)風(fēng)味的重要因素之一。因此，增加可溶性固形物含量對(duì)改善獼猴桃果實(shí)品質(zhì)至關(guān)重要，是獼猴桃育種的重要目標(biāo)之一。

傳統(tǒng)獼猴桃育種中，童期長、種植占地面積大等是影響育種效率的主要困難。隨著分子生物學(xué)和測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，對(duì)性狀的選擇正在逐漸由表型選擇向基因型選擇過渡。分子標(biāo)記輔助育種能利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記對(duì)個(gè)體進(jìn)行篩選，以達(dá)到提高目標(biāo)性狀選擇效率、縮短育種年限的目的。近年來，在蘋果、梨、葡萄等果樹中，已成功開發(fā)了重要農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇也日趨成熟。然而，獼猴桃重要農(nóng)藝性狀定位及相關(guān)分子標(biāo)記開發(fā)工作比較匱乏。2013年，獼猴桃基因組草圖的公布為基因組學(xué)研究和獼猴桃分子輔助育種提供了重要基礎(chǔ)。隨后，基于構(gòu)建獼猴桃高密度遺傳圖譜，開發(fā)了3個(gè)性別鑒定標(biāo)記，在育種早期進(jìn)行性別鑒定，避免了人力和物力的浪費(fèi)。農(nóng)藝性狀QTL定位就是在遺傳分離群體的基礎(chǔ)上，借助分子標(biāo)記和遺傳圖譜，利用QTL作圖軟件對(duì)分離群體的數(shù)量性狀表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而確定數(shù)量性狀基因在染色體上的位置和效應(yīng)。利用遺傳連鎖圖譜，結(jié)合表型數(shù)據(jù)開展數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative Trait Loci，QTL)掃描，已成為解析復(fù)雜數(shù)量遺傳學(xué)規(guī)律、有效定位關(guān)鍵農(nóng)藝性狀、開發(fā)關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記以及對(duì)優(yōu)良性狀進(jìn)行早期選擇的有效手段。

目前，對(duì)獼猴桃重要品質(zhì)性狀可溶性固形物的QTL定位以及發(fā)掘與可溶性固形物相關(guān)的分子標(biāo)記研究尚未開展。開展獼猴桃可溶性固形物的QTL研究，基于QTL位點(diǎn)信息進(jìn)行分子標(biāo)記篩選，有助于提高對(duì)獼猴桃可溶性固形物性狀選擇的育種效率，節(jié)約育種成本，提升獼猴桃產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種獼猴桃第23號(hào)染色體第16301870個(gè)堿基在獼猴桃可溶性固形物含量篩選育種中的應(yīng)用，包括針對(duì)獼猴桃第23號(hào)染色體第16301870個(gè)堿基設(shè)計(jì)的引物在獼猴桃可溶性固形物含量篩選育種中的應(yīng)用，包括包含有獼猴桃第23號(hào)染色體第16301870個(gè)堿基的獼猴桃序列在獼猴桃可溶性固形物含量篩選育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的在于提供了一種與獼猴桃可溶性固形物性狀QTL位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物，引物為SSC-F：5’-TTGTCTTGATAGGCCCCTCG-3’和SSC-R：5’-CAACAAGACATGGTTCCTCACA-3’。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種與獼猴桃可溶性固形物性狀QTL位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲得：

①使用可溶性固形物含量小的山梨獼猴桃‘MT570001’獼猴桃和可溶性固形物含量大的中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’雜交構(gòu)建F₁分離群體。在該群體結(jié)果第6年，選擇125株F₁群體的后代單株為研究對(duì)象。

②采集群體125份單株葉片，利用CTAB法提取總DNA。根據(jù)RADseq方法構(gòu)建中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’、山梨獼猴桃‘MT570001’以及125株子代的文庫并測(cè)序。

③將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除低質(zhì)量堿基含量大于50％的序列，剔除有測(cè)序接頭污染和大量重復(fù)的序列。使用軟件SOAP2將符合過濾標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行位點(diǎn)變異檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性位點(diǎn)在群體中的遺傳類型。

④利用Joinmap4.0分析軟件構(gòu)建基于SNP標(biāo)記的獼猴桃遺傳圖譜。將符合遺傳分離規(guī)律的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，按Joinmap4.0軟件格式導(dǎo)入，剔除數(shù)據(jù)缺失率在10％的位點(diǎn)，排除顯著偏分離位點(diǎn)，采用Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜。

⑤在果實(shí)成熟期，對(duì)中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’、山梨獼猴桃‘MT570001’以及125株群體單株果實(shí)的可溶性固形物含量進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)樣本隨機(jī)采集20個(gè)果實(shí)，使用ATAGO Palette PR-32α數(shù)字式折射儀，測(cè)量可溶性固形物含量。

⑥將樣本可溶性固形物含量數(shù)據(jù)和標(biāo)記的基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入MapQTL5.0軟件，選擇多區(qū)間作圖法，設(shè)置LOD閾值為3.0，對(duì)獼猴桃可溶性固形物進(jìn)行QTL定位分析。最終檢測(cè)到與可溶性固形物相關(guān)的主效QTL位點(diǎn)，對(duì)該性狀的貢獻(xiàn)率為19.61％，該位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的SNP標(biāo)記在連鎖群上的遺傳距離為108.6cM。

⑦提取獼猴桃第23號(hào)染色體第16301870個(gè)堿基上下游各100bp的序列，按照設(shè)計(jì)引物原則，開發(fā)設(shè)計(jì)SNP標(biāo)記引物。正向引物SSC-F為5’-TTGTCTTGATAGGCCCCTCG-3’，反向引物SSC-R為5’-CAACAAGACATGGTTCCTCACA-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為157bp。

本發(fā)明的保護(hù)范圍包括：獼猴桃第23號(hào)染色體第16301870個(gè)堿基在獼猴桃可溶性固形物篩選育種中的應(yīng)用，或者基于獼猴桃第23號(hào)染色體第16301870個(gè)堿基設(shè)計(jì)的引物在獼猴桃可溶性固形物篩選育種中的應(yīng)用，或是SEQ ID NO.3所示序列在獼猴桃可溶性固形物篩選育種中的應(yīng)用。

以上所述的應(yīng)用，可利用現(xiàn)有技術(shù)，對(duì)待檢獼猴桃的第23號(hào)染色體的第16301870個(gè)堿基進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)獼猴桃可溶性固形物進(jìn)行早期篩選的育種目的。

本發(fā)明的積極效果：

本發(fā)明首次定位了獼猴桃中控制可溶性固形物的主效QTL位點(diǎn)，可解釋19.61％的表型方差。在常規(guī)育種方法中，獼猴桃果實(shí)中可溶性固形物含量要等到成熟期測(cè)定，浪費(fèi)大量時(shí)間和精力，且選擇效率低下，而通過檢測(cè)與可溶性固形物主效位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，可以在苗期進(jìn)行選擇，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率。本發(fā)明中獼猴桃可溶性固形物的主效基因位點(diǎn)位置明確，分子標(biāo)記位點(diǎn)的檢測(cè)方法方便快捷，不受環(huán)境影響。通過檢測(cè)與可溶性固形物性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，即可預(yù)測(cè)獼猴桃可溶性固形物，進(jìn)而準(zhǔn)確快速篩選可溶性固形物含量高的優(yōu)良單株。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，為常規(guī)技術(shù)；所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1：

與獼猴桃可溶性固形物主效QTL及開發(fā)連鎖的分子標(biāo)記的獲得：

①本實(shí)施例中使用可溶性固形物小的山梨獼猴桃‘MT570001’獼猴桃和可溶性固形物大的中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’雜交構(gòu)建F₁分離群體。在該群體結(jié)果第6年，選擇125株F₁群體的后代單株為研究對(duì)象。

②采集群體125份單株葉片，利用CTAB法提取總DNA。根據(jù)RADseq方法構(gòu)建中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’、山梨獼猴桃‘MT570001’以及125株子代的文庫并測(cè)序。

③將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除低質(zhì)量堿基含量大于50％的序列，剔除有測(cè)序接頭污染和大量重復(fù)的序列。使用軟件SOAP2將符合過濾標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行位點(diǎn)變異檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性位點(diǎn)在群體中的遺傳類型。

④利用Joinmap4.0分析軟件構(gòu)建基于SNP標(biāo)記的獼猴桃遺傳圖譜。將符合遺傳分離規(guī)律的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，按Joinmap4.0軟件格式導(dǎo)入，剔除數(shù)據(jù)缺失率在10％的位點(diǎn)，排除顯著偏分離位點(diǎn)，采用Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜。

⑤在果實(shí)成熟期，對(duì)中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’、山梨獼猴桃‘MT570001’以及125株群體單株可溶性固形物含量進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)樣本隨機(jī)采集20個(gè)果實(shí)，使用ATAGO Palette PR-32α數(shù)字式折射儀測(cè)量可溶性固形物含量。

⑥將樣本平均可溶性固形物的表型數(shù)據(jù)和標(biāo)記的基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入MapQTL5.0軟件，選擇多區(qū)間作圖法，設(shè)置LOD閾值為3.0，對(duì)獼猴桃可溶性固形物進(jìn)行QTL定位分析。最終檢測(cè)到與可溶性固形物相關(guān)的主效QTL位點(diǎn)，對(duì)該性狀的貢獻(xiàn)率為19.61％，該位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的SNP標(biāo)記在連鎖群上的遺傳距離為108.6cM。

⑦提取獼猴桃第23號(hào)染色體第16301870個(gè)堿基上下游各100bp的序列，按照設(shè)計(jì)引物原則，開發(fā)設(shè)計(jì)SNP標(biāo)記引物。正向引物SSC-F為5’-TTGTCTTGATAGGCCCCTCG-3’，反向引物SSC-R為5’-CAACAAGACATGGTTCCTCACA-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為157bp。

在中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’中擴(kuò)增的序列為SEQ ID NO.3所示；

在山梨獼猴桃‘MT570001’中擴(kuò)增的序列為SEQ ID NO.4所示。

⑧利用高分辨率溶解曲線(HRM)技術(shù)對(duì)可溶性固形物進(jìn)行分型。按照Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus),ROX plus試劑盒說明，設(shè)計(jì)20uL反應(yīng)體系：5ng·uL^-1獼猴桃基因組DNA模板2ul，2×SYBR Premix 10ul，50×ROX Dye II 0.4ul，10uM SSC-F和SSC-R各0.8ul，雙蒸水補(bǔ)足余量。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5s，60℃退火1min；95℃變性5s，60℃退火30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。溶解程序?yàn)椋?5℃15s；60℃1min，再從60-95℃連續(xù)升溫，每升高0.3℃收集1次熒光，95℃15s，最后降溫至40℃。在Gene Scan ning軟件中自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線。

⑨對(duì)該分子標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線進(jìn)行分析，125個(gè)雜交后代分為兩類基因型。線型分組1(與親本中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’的溶解曲線相同)中，66個(gè)后代單株平均可溶性固形物含量為14.7％；線型分組2(與親本山梨獼猴桃‘MT570001’的溶解曲線相同)中，59個(gè)后代單株平均可溶性固形物為11.2％。對(duì)125個(gè)雜交子代的平均可溶性固形物進(jìn)行顯著性檢測(cè)，分析顯示兩類基因型個(gè)體的平均可溶性固形物差值為3.5％，差異極其顯著(P<0.005)。因此，通過對(duì)可溶性固形物的測(cè)定和HRM分析結(jié)果分析，證明該特異分子標(biāo)記可以檢測(cè)獼猴桃可溶性固形物的差異。

實(shí)施例2：

一種與獼猴桃可溶性固形物性狀QTL位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記在獼猴桃育種中的應(yīng)用，其步驟是：

(1)以具有抗寒性高、抗病性好但可溶性固形物含量低的山梨獼猴桃做為母本，果實(shí)風(fēng)味佳且可溶性固形物含量高的中華獼猴桃為父本雜交得到F₁代，選取F₁代群體中60個(gè)單株為研究對(duì)象。

(2)在果實(shí)成熟期，采集F₁代群體60個(gè)單株的果實(shí)，每個(gè)樣本隨機(jī)采集20個(gè)果實(shí)，使用ATAGO Palette PR-32α數(shù)字式折射儀測(cè)量可溶性固形物含量。

(3)提取F₁代60個(gè)單株的總DNA，按照 Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)，ROX plus試劑盒說明，設(shè)計(jì)20uL反應(yīng)體系：5ng·uL^-1獼猴桃基因組DNA模板2ul，2×S YBR Premix 10ul，50×ROX Dye II 0.4ul，10uM SSC-F和SSC-R各0.8ul，雙蒸水補(bǔ)足余量。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5s，60℃退火1min；95℃變性5s，60℃退火30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。溶解程序?yàn)椋?5℃15s；60℃1min，再從60-95℃連續(xù)升溫，每升高0.3℃收集1次熒光，95℃15s，最后降溫至40℃。在Gene Scanning軟件中自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線。

對(duì)該分子標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線進(jìn)行分析，60個(gè)雜交后代分為兩類基因型。線型分組1(與親本中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’的溶解曲線相同)中，27個(gè)后代單株平均可溶性固形物含量為14.2％；線型分組2(與親本山梨獼猴桃‘MT570001’的溶解曲線相同)中，33個(gè)后代單株平均可溶性固形物含量為11.8％。對(duì)60個(gè)雜交子代的平均可溶性固形物進(jìn)行顯著性檢測(cè)，分析顯示兩類基因型個(gè)體的平均可溶性固形物差值為2.4％，差異極其顯著(P<0.005)。因此，通過對(duì)可溶性固形物的測(cè)定和HRM分析結(jié)果分析，說明通過分子標(biāo)記輔助選擇可溶性固形物位點(diǎn)，可以明顯提高選擇效率。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學(xué)院武漢植物園

<120> 一種與獼猴桃可溶性固形物性狀QTL位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用

<130> 一種與獼猴桃可溶性固形物性狀QTL位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgtcttgat aggcccctcg 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caacaagaca tggttcctca ca 22

<210> 3

<211> 157

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgtcttgat aggcccctcg ccagttctgt gttcatggta gggtgtgatg ttaaatttag 60

cacaaagaaa atgtatttca tattttcagg taccacataa gcaacactgt acagttaaaa 120

ttagtgaagt atatatgtga ggaaccatgt cttgttg 157

<210> 4

<211> 157

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgtcttgat aggcccctcg ccagttctgt gttcatggta gggtgtgatg ttaaatttag 60

cacaaacaaa atgtatttca tattttcagg taccacataa gcaacactgt acagttaaaa 120

ttagtgaagt atatatgtga ggaaccatgt cttgttg 157