本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，涉及淀粉酶應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在工業(yè)界，淀粉的水解主要是從α淀粉酶來開始的，這些來源于微生物的α淀粉酶和其他酶種的協(xié)同應(yīng)用，比如說普魯蘭酶，糖化酶及葡萄糖異構(gòu)酶，可有效分解淀粉大分子，這些產(chǎn)生的小分子多糖或單糖在食品制造、谷物處理、啤酒加工、酒精生產(chǎn)等行業(yè)有很多應(yīng)用，至關(guān)重要。α淀粉酶隸屬于糖化水解酶的一種，它的主要結(jié)構(gòu)特征是(α/β)8折疊，其中含有特殊的淀粉底物結(jié)合位點，長度一般為不超過10個糖單體，但是很多淀粉酶的結(jié)合位點在一起作用，就可以實行多點位結(jié)合，從而成功剪切淀粉大分子。α淀粉酶可以有效剪切淀粉底物中的α-1，4糖苷鍵，從而快速降低淀粉底物的分子量和粘度，產(chǎn)物主要是不同長度的糊精。α淀粉酶有不同的種類，這些種類在工業(yè)上的應(yīng)用條件根據(jù)所需產(chǎn)品的性征有很大的不同。α淀粉酶(α-1,4-glucan-4-glucanohydrolases,e.c.3.2.1.1)能有效水解淀粉和其他的多糖中的α-1，4糖苷鍵。鑒于在淀粉在水解過程中對酶效率的提高和降低生產(chǎn)成本的需求，尋求在不同應(yīng)用領(lǐng)域能支持有效淀粉液化的α淀粉酶已成為學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的一個重要研發(fā)方向。目前利用酶工程的技術(shù)改良該酶種的焦點主要在耐熱性，酸堿耐受性能的改善和液化效果的提升。已經(jīng)從植物和微生物中發(fā)現(xiàn)和定義了很多α淀粉酶具有商業(yè)價值，主要包括b.licheniformisα淀粉酶，b.amyloliquefaciensα淀粉酶和g.stearothermophilusα淀粉酶，其中以b.licheniformisα-amylase(l型)為模板有衍生的變體數(shù)量為最多，應(yīng)用也最廣泛。在本發(fā)明中，為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，我們利用b.licheniformisα-amylase(l型)為模板構(gòu)建了一系列新的α淀粉酶變體，提高了該酶種的應(yīng)用效率，特別是在低ph以及減少添加量的情況下液化效率同市場主流產(chǎn)品可相匹配。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一系列b.licheniformisα-amylase(l型)變體，該系列變體可以提高液化效率，并能適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需求。特別是在100℃以上的溫度和ph為5.0-5.8的條件下，本發(fā)明的α淀粉酶變體的酶活及其他性質(zhì)可同市場主流產(chǎn)品相匹配。本發(fā)明的目的是提供編碼該α淀粉酶變體的基因。本發(fā)明的又一目的是提供該α淀粉酶變體的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種α淀粉酶變體，其特征在于所述的α淀粉酶變體通過在b.licheniformis的α淀粉酶n端增加兩個氨基酸a和n，并且在c端增加三個氨基酸ktt得到，且所述的α淀粉酶變體仍保持了親代α淀粉酶水解α-1,4糖苷鍵的能力。所述的親代α淀粉酶優(yōu)選天然α淀粉酶，即細菌α淀粉酶，進一步優(yōu)選bacillussubtilis,b.licheniformis，b.amyloliquefaciens，g.stearothermophilus或bacilluscereus中的任意一種的α淀粉酶，更進一步優(yōu)選b.licheniformis或g.stearothermophilus的α淀粉酶，最優(yōu)選b.licheniformis的α淀粉酶。所述的b.licheniformis的α淀粉酶的全長編碼基因序列見seqidno.1；對應(yīng)的氨基酸序列見seqidno.2。所述的α淀粉酶變體的氨基酸序列如序列表中seqidno.4所示。編碼本發(fā)明所述的α淀粉酶變體的基因。所述的基因優(yōu)優(yōu)選如seqidno.3所示。用于表達本發(fā)明所述的α淀粉酶變體的表達載體，其中含有本發(fā)明所述的編碼α淀粉酶變體的基因。所述的表達載體包括主要由一個天然或者合成的啟動子序列，一個天然或合成的核糖體結(jié)合位點，一個天然或合成的終止子序列，以及本發(fā)明所述的編碼α淀粉酶變體的基因序列一同組成了一個表達組件。一種用于表達本發(fā)明所述的α淀粉酶變體的重組細胞，其中包含一個或多個本發(fā)明所述的編碼α淀粉酶變體的基因。重組細胞的宿主細胞優(yōu)選自bacillus菌株,進一步優(yōu)選b.licheniformis或經(jīng)過基因工程改造失活了一些內(nèi)源性蛋白的bacillus菌株；最優(yōu)選經(jīng)過基因工程改造失活了apre和/或blase的b.licheniformis。一種本發(fā)明所述的α淀粉酶變體的生產(chǎn)方法，包括在適宜α淀粉酶變體表達的條件下對含有編碼α淀粉酶變體基因序列的重組細胞進行培養(yǎng)，并從重組細胞或者其培養(yǎng)上清液中獲得α淀粉酶變體。本發(fā)明所述的α淀粉酶變體在水解多糖的α-1,4糖苷鍵中的應(yīng)用；優(yōu)選在高溫和/或低ph條件下水解多糖的α-1,4糖苷鍵中的應(yīng)用；所述的高溫優(yōu)選80℃～110℃，進一步優(yōu)選100℃～110℃；所述的低ph優(yōu)選ph值為5.0～5.8。有益效果本發(fā)明提供的一系列α淀粉酶變體，在ph5.0-5.8酸性條件下和100℃以上高溫條件下有較高的催化活度。這些α淀粉酶變體的耐酸和熱穩(wěn)定性，適用于淀粉液化。附圖說明圖1為pyf-tsde載體，包括一個溫度敏感原件(30℃時有復(fù)制活性)，一個紅霉素決定基因(ermc)--在e.coli中可以耐受300μg/ml的紅霉素而在b.licheniformis中可以耐受5μg/ml的紅霉素。用紅霉素篩選出含有編碼α淀粉酶變體核苷酸序列的重組宿主細胞。圖2為puc57-ks-erm載體的示意圖，從該載體中可以獲得本發(fā)明中的pyf-tsde載體。圖3為pyf-tsint-amy載體的示意圖。圖4為不同噴射溫度條件下，淀粉酶液化應(yīng)用比較圖5為不同淀粉漿濃度下，淀粉酶液化應(yīng)用比較圖6為在ph5.0下，淀粉酶不同加酶量液化應(yīng)用比較圖7為不同底物濃度條件下，淀粉酶液化應(yīng)用比較圖8為在不同ph條件下，淀粉酶液化應(yīng)用比較圖9為不同底物濃度條件下，淀粉酶液化應(yīng)用比較圖10為在不同ph條件下，淀粉酶液化應(yīng)用比較圖11為淀粉酶在玉米酒精液化上的應(yīng)用比較本發(fā)明的詳細描述除非另有規(guī)定，所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語在本發(fā)明中的具有相同的含義，通常理解為一般的專業(yè)技術(shù)。在此應(yīng)用中，某些術(shù)語意義同規(guī)范所述。必須指出的是，本文所用的和所附的權(quán)利要求，單數(shù)形式“一個”“這個”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文中另有明確規(guī)定。本發(fā)明中，α淀粉酶指的是能夠水解多糖的α-1,4糖苷鍵的酶。例如，α淀粉酶能將淀粉水解成糊精。本發(fā)明中，親代α淀粉酶是指天然的α淀粉酶。天然的α淀粉酶是細菌α淀粉酶，來源包括但不局限于bacillussubtilis,b.licheniformis，b.amyloliquefaciens，g.stearothermophilus和bacilluscereus。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，天然α淀粉酶是來源于芽孢桿菌菌株----尤其是b.licheniformis和g.stearothermophilus。b.licheniformis的全長編碼序列見seqidno.1；對應(yīng)的氨基酸序列見seqidno.2。本發(fā)明中，術(shù)語“α淀粉酶變體”是指非天然存在的，在親代的α淀粉酶氨基酸序列的有效點位進行一個或數(shù)個氨基酸殘基的增加、刪除和/或替代，同時仍然保持了親代水解α-1,4糖苷鍵的能力的α淀粉酶。本發(fā)明中“液化”一般是指將碳水化合物分解為小分子的多糖的過程。當(dāng)加入α淀粉酶或者α淀粉酶變體時，“液化”特指水解碳水化合物的α-1,4糖苷鍵。本發(fā)明中，“α-1,4糖苷鍵”指將前一個葡萄糖的c1與后一個葡萄糖的c4連接起來的鍵，即為α-1,4糖苷鍵。本發(fā)明涉及將親代α淀粉酶做序列改造獲得的“α淀粉酶變體”。親代α淀粉酶是天然的α淀粉酶，特別來源于細菌的天然α淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明的實施例，α淀粉酶變體是將親代的α淀粉酶的氨基酸序列的有效點位進行一個或數(shù)個氨基酸殘基的突變、增加或刪除。本發(fā)明包括一系列的α淀粉酶變體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，這一系列的α淀粉酶變體的氨基酸序列的同源性至少達到95％，分別達到95％，96％，97％，98％，99％或者100％。作為說明性和非限制性的本發(fā)明示例，α淀粉酶變體是由b.licheniformis的親代α淀粉酶n-末端增加兩個氨基酸殘基an，并在此基礎(chǔ)上親代α淀粉酶c-末端增加3個氨基酸殘基ktt而獲得的，見seqidno.4。本發(fā)明中的α淀粉酶變體保持了水解α-1,4糖苷鍵的能力。另外，這些α淀粉酶的性能使用上符合工業(yè)生產(chǎn)要求，比如，液化效率的提高，酸性ph或高溫條件下催化活性穩(wěn)定。根據(jù)本發(fā)明的實施例，一個α淀粉酶變體在ph5.0的酸性條件或者溫度高于100℃的條件(尤其是溫度在100℃-108℃之間)下，催化活性穩(wěn)定。α淀粉酶變體這些提高的性能更適應(yīng)淀粉工業(yè)的液化反應(yīng)。因為在淀粉工業(yè)上液化工藝常常在低ph和高溫條件下進行。本發(fā)明的所有α淀粉酶變體都可以用于液化反應(yīng)。在優(yōu)選的實施例中，α淀粉酶變體來源于親代α淀粉酶，尤其是來源于b.licheniformis親代的α淀粉酶。在特定的優(yōu)選實施例中，α淀粉酶變體氨基酸序列如序列表中seqidno.4所示。根據(jù)本發(fā)明，任何含有α-1,4糖苷鍵的碳水化合物都可以用于液化反應(yīng)。含有一個或多個α-1,4糖苷鍵的碳水化合物包括但不僅限于淀粉，支鏈淀粉，直鏈淀粉和葡萄聚糖。很多碳水化合物含有α-1,6-糖苷鍵和α-1,4-糖苷鍵，比如，支鏈淀粉?！唉?1,4-糖苷鍵”是指前一個葡萄糖的c1與后一個葡萄糖的c4連接起來的鍵，即為α-1,4糖苷鍵。因此，本發(fā)明的α淀粉酶變體可以與能夠水解α-1,6糖苷鍵的普魯蘭酶在糖化過程中配合使用。能夠水解α-1,4糖苷鍵的酶包括但不僅限于α淀粉酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，催化水解α-1,4糖苷鍵的酶為α淀粉酶。因此，根據(jù)本發(fā)明的實施例，進一步催化糖化反應(yīng)提高效率的方法是配合使用普魯蘭酶。本發(fā)明中，“普魯蘭酶”是指能夠水解α-1,6糖苷鍵的水解酶。本發(fā)明中的α淀粉酶與普魯蘭酶配合在淀粉的糖化過程中使用能夠提高葡萄糖和麥芽糖的純度。此外，在糖化反應(yīng)使用上述復(fù)合酶能有效減少底物濃度，提高轉(zhuǎn)化效率，在酸性ph或更高的溫度下也能有更高的催化活性，更能適應(yīng)工業(yè)上水解淀粉的條件。本發(fā)明提供了一種α淀粉酶變體能夠在任何適合工業(yè)化生產(chǎn)的溫度和ph條件下水解α-1，4糖苷鍵進行糖化反應(yīng)的方法。根據(jù)本發(fā)明，液化反應(yīng)可以在80℃至110℃的高溫下反應(yīng)，比如80℃，90℃，100℃，105℃和110℃。糖化反應(yīng)也能在ph5.0至ph5.8的酸性ph條件下進行，比如ph5.0，5.2,5.4,5.6,和5.8。根據(jù)本發(fā)明的實施例，α淀粉酶變體催化的液化反應(yīng)在酸性ph和100℃以上溫度條件下催化活性穩(wěn)定。另一方面，本發(fā)明中的表達載體包含一個合成的編碼α淀粉酶變體的核苷酸序列，而重組宿主細胞包含了上述表達載體。表達載體含有一個合成的編碼不同α淀粉酶變體的核苷酸序列。表達載體能夠整合至宿主細胞的基因組上。例如，表達載體含有合成的核苷酸序列seqidno.3。本發(fā)明中的表達載體優(yōu)選包括一個天然或者合成的啟動子序列，一個天然或合成的核糖體結(jié)合位點，一個天然或合成的終止子序列。這些遺傳原件與合成的α淀粉酶變體編碼序列一同組成了一個表達組件，表達組件與載體骨架構(gòu)成了表達載體。例如，表達載體包括一個表達組件，而表達組件包括以下的元件：一個啟動子序列，一個合成的核糖體結(jié)合位點，一個合成的編碼本發(fā)明中α淀粉酶變體的核苷酸序列和一個終止子序列。信號序列能夠指導(dǎo)α淀粉酶變體的分泌，將信號序列引入表達載體或者表達組件，尤其是將信號序列引入起始密碼子的上游更有利于α淀粉酶變體的分泌。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例，表達載體適宜在細菌中表達，尤其是bacillus菌株,更適宜在b.licheniformis中表達。在特別優(yōu)選實施例中，表達載體能夠整合到bacillus的基因組上，尤其是b.licheniformis的基因組上?？捎糜谡系饺旧w中的多核苷酸序列的宿主細胞的表達載體，以及這種表達載體的構(gòu)建方法，是當(dāng)代生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的一個普通技能。根據(jù)本發(fā)明實施例，重組宿主細胞可以基因工程改造包含一個或多個α淀粉酶變體基因表達的核酸序列。任何技術(shù)均可用于基因工程改造宿主細胞包含一個或多個本發(fā)明中的α淀粉酶變體編碼合成的核酸序列，例如，染色體整合。含有溫度敏感起源和抗性篩選標(biāo)記的載體可以用于整合步驟。這些載體通過坎貝爾機制與基因組的特定區(qū)域整合，通過抗性篩選得到重組菌，重組菌在隨后的培養(yǎng)過程中通過同源重組去掉抗性篩選標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明實施例，重組宿主細胞經(jīng)過基因工程改造失活了一些內(nèi)源性蛋白。能被失活的內(nèi)源性包括但不限于胞外的蛋白酶。重組的宿主細胞轉(zhuǎn)化含有α淀粉酶變體表達基因的核酸序列之前或者之后要失活一些內(nèi)源性蛋白。更適宜的方法是，在轉(zhuǎn)入α淀粉酶變體表達基因的載體之前進行宿主菌外源分泌蛋白酶的失活。首先，b.licheniformis經(jīng)過改造已經(jīng)失活了一些外源性蛋白酶基因。特別是b.licheniformis菌株可以失活一些胞外蛋白酶，例如subtilisin(apre)，glutamicacid-specificprotease(blase)。這些基因工程改造使得b.licheniformis菌株更適宜α淀粉酶變體的表達和分泌。本發(fā)明提供了一種α淀粉酶變體的生產(chǎn)方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括在適宜α淀粉酶變體表達的條件下對含有編碼α淀粉酶變體核苷酸序列的重組宿主細胞進行培養(yǎng)，并從重組宿主細胞或者其上清液中獲得α淀粉酶變體。本發(fā)明的所有重組宿主細胞都能夠生產(chǎn)α淀粉酶變體。重組宿主細胞包含了至少一個拷貝的編碼α淀粉酶變體的核苷酸序列。這些編碼α淀粉酶變體的核苷酸序列能夠在適宜的條件下表達α淀粉酶變體。從重組宿主細胞中分泌的α淀粉酶變體能夠從重組細胞或上清液中收集到。收集的方法包括但不僅限于過濾，離心等。根據(jù)本發(fā)明的實施例，通過發(fā)酵經(jīng)過基因工程改造b.licheniformis能夠高產(chǎn)α淀粉酶變體。b.licheniformis通過基因工程改造導(dǎo)入了編碼α淀粉酶變體的核苷酸序列。更好的是，本發(fā)明中的b.licheniformis已經(jīng)去掉了抗性篩選基因，對環(huán)境無害并且生產(chǎn)的α淀粉酶變體更適合用于食品工業(yè)。本發(fā)明中下列的例子進一步闡述了本發(fā)明的本質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，下面的例子不限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍是由所附的權(quán)利要求確定。具體實施方式實施例1:pyf-tsde質(zhì)粒的構(gòu)建pyf-tsde(圖1)是一個溫敏型的e.coli/b.licheniformis穿梭質(zhì)粒。該質(zhì)粒由一個溫度敏感型的復(fù)制起點(在30℃有活性)和一個紅霉素抗性基因(ermc)組成，該抗性基因在e.coli中的抗性是300ug/ml，在b.licheniformis中的抗性是5ug/ml。在37℃時，質(zhì)粒上的復(fù)制起點失活，質(zhì)粒被整合到宿主菌基因組的指定位點，用ermc進行篩選。pyf-tsde質(zhì)粒的構(gòu)建過程為：將質(zhì)粒puc57-ks-erm(委托g(shù)enscript合成,序列見cn104073458a，圖2)用bglii雙酶切，回收純化3.8kbp的片段，用t4連接酶(newenglandbiolabs)自連，克隆好的質(zhì)粒就是pyf-tsde。轉(zhuǎn)化子在e.colitop10中進行繁殖，并且作為以下所有基因操作的骨架。實施例2:蛋白酶缺陷型b.licheniformis菌株的構(gòu)建作為重組酶產(chǎn)品宿主細胞的遺傳工程菌株已經(jīng)有文獻報道(widneretal.,journalofindustrialmicrobiology&biotechnology,25,204-212,2000)。這些重組的宿主細胞一般包含一個或多個編碼目標(biāo)序列的核酸結(jié)構(gòu)用以酶的表達。在本發(fā)明中，b.licheniformis被用作基因操作的受體菌。bacillus的轉(zhuǎn)化目前可以通過非常成熟的手段來達到，如感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(youngetal.,jbacteriology,81,823-829,1961；shigekawaetal.,biotechniques,6,742-751,1988；changetal.,moleculargeneralgenetics,168,111-115,1979)。在本發(fā)明中，一個單獨的α淀粉酶變體表達框，包含自然的或合成的啟動子序列，一個從桿菌中篩選到的信號肽序列，一個合成的核糖體結(jié)合位點，一個來自于b.licheniformis的α淀粉酶變體編碼基因，和一個轉(zhuǎn)錄終止子。這樣的設(shè)計將大大增強宿主菌株中基因的表達水平和α淀粉酶變體的分泌量。將α淀粉酶變體編碼基因替換掉b.licheniformis細胞基因組上的特定位點是通過質(zhì)粒介導(dǎo)的單交叉同源重組來實現(xiàn)的。在b.licheniformis中，胞外蛋白酶的活性對異種酶的分泌是不利的?，F(xiàn)已證實有2種主要的胞外蛋白酶：subtilisin(apre)，glutamicacid-specificprotease(blase)，在b.licheniformis中大步伐的胞外蛋白酶活性都是源自于這兩種蛋白酶。在本發(fā)明中，為了獲得α淀粉酶變體基因表達的結(jié)構(gòu)整體性，上述兩個基因被滅活，采用的是連續(xù)性方式單交叉坎貝爾型機制。具體操作如下：2.1pyf-tsde經(jīng)由bglii酶切后用cip處理來抑制自連；2.2基因敲除(1)為了能夠獲得每個基因缺失片段，以地衣桿菌基因組dna為模板用pcr的方法從要缺失的基因兩側(cè)各擴增大約500bp的同源序列?？莶菅挎邨U菌的單克隆經(jīng)過98℃,5分鐘預(yù)變性后可以作為基因組dna模板直接在pcr反應(yīng)中使用。用于pcr反應(yīng)的引物是由genscript公司合成的。引物序列如下：擴增apr基因上游序列的引物為：lichapr_f1ttattgagcggcagcttcgacattgatcagaccttlichapr_r1ccttacggcattcctctcaacagcggatcttcag擴增apr基因下游序列的引物為：lichapr_f2cctgaagatccgctgttgagaggaatgccgtaagglichapr_r2atgatgaggaaaaagagtttttggcttgggatgctgac擴增blase基因上游序列的引物為：blalich_f1ttattgtgcgctgtttttccagttggtcaaattgtcgblalich_cr1cggacaagggtcaccaacgggacaactgttaccatc擴增blase基因下游序列的引物為：blalich_cf2gatggtaacagttgtcccgttggtgacccttgtccblalich_r2cggcgttggttagtaaaaagagtgttaaacgaggtttgatpcr擴增體系為50ul，反應(yīng)程序如下：(1)枯草芽孢桿菌b.licheniformis14580單克隆預(yù)變性98℃，8分鐘；(2)96℃，15秒；(3)58℃，15秒；(4)72℃，30秒；重復(fù)2-4步驟25-30次；(5)終延伸72℃，2分鐘。pcr產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖膠電泳檢測后用愛思進試劑盒純化。2.3重疊pcr方法擴增內(nèi)部大約400-500bp序列缺失的目的基因基因內(nèi)部缺失片段是用重疊pcr方法(overlapextensionpcr，soe)獲得的，具體操作如下：(1)分別回收2.2中各基因上游、下游pcr片段并純化；(2)以各目的基因的上、下游同源序列片段1:1摩爾比混合后作為模板，用引物xx-cz-f1和xx-cz-r2(“xx”代表apr或blase)pcr擴增獲得內(nèi)部缺失片段的apre基因或blase基因。上述片段隨后用clone-ez克隆試劑盒(genscript公司提供)重組進經(jīng)過bglii線性化的pyf-tsde載體中，獲得的重組質(zhì)粒分別命名為：pyf-tsde-apr和pyf-tsde-blase。這些重組質(zhì)粒為溫敏型質(zhì)粒，其中包含的apr基因或blase基因相對于完整基因來說缺失了內(nèi)部大約400-500bp的序列。不同等位基因的替換可通過同源重組來實現(xiàn)。方法參見cn102124112a，也可使用本領(lǐng)域的其他公知的同源重組的方法。2.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化本實驗采用將敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到地衣桿菌感受態(tài)細胞中方法及篩選過程如下：(1)將溫敏型質(zhì)粒pyf-tsde-apr或pyf-tsde-blase轉(zhuǎn)化地衣桿菌(cicc22794，中國微生物菌種庫購得)感受態(tài)細胞；(2)在30℃的條件下，在lb(每升含蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g)培養(yǎng)基上用紅霉素(5ug/ml)抗性來篩選陽性克隆菌株；(2)再將陽性克隆菌株轉(zhuǎn)移到37℃的條件下培養(yǎng)，使該溫敏質(zhì)粒能夠融合到宿主基因組上。為了使基因在設(shè)定的位點發(fā)生替換，挑選幾個克隆同時接種于2×yt培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)24小時后重新繼代一次，整個過程繼代4-5次(一般需要5-7天)。(3)篩選紅霉素敏感的枯草桿菌細胞進行pcr鑒定.可同時用1％的脫脂牛奶lb平板觀察透明水解圈，敲除后的菌種應(yīng)顯示顯著縮小的水解圈。鑒定所用pcr引物：apre：apr-seqf1/apr-seqr3blase：blase-seqf1/blase-seqr3apr-seqf1：gccaggttgaagcggtctattcatapr-seqr3：tacggccatccgaccataatggaacblase-seqf1：gaagagccggtcacaattgcblase-seqr3：ggccgttagatgtgacagcc實施例3:α淀粉酶變體菌株的整合構(gòu)建3.1淀粉酶表達框架構(gòu)建整合質(zhì)粒的構(gòu)建采用上述pyf-tsde質(zhì)粒同樣的方法。為了將表達框整合到設(shè)計的基因組上的amye位點，在基因組上的amye位點的上下游設(shè)計800bp左右的同源區(qū)域，連接在一個α淀粉酶變體表達框兩側(cè)。同時組裝了一些從頭至尾自然選擇的細菌染色體dna片段和功能的合成序列，這些都是控制表達α淀粉酶變體基因所必須的。一個典型的淀粉酶表達框有以下幾個部分構(gòu)成：一個典型的α淀粉酶變體表達框由以下元件組成：一個天然的或合成的啟動子序列(seqidno.5)，一個合成的核糖體結(jié)合位點aaaggagg，一個源自于b.licheniformis的α淀粉酶變體編碼基因(分別為seqidno.3)和一個合成的終止序列(seqidno.6)。一個從枯草芽孢桿菌中篩選的強的天然信號序列(seqid:no.7)被插入到α淀粉酶變體編碼基因啟動子的上游，用以增強表達酶的分泌效率。用clone-ez克隆試劑盒(genscript)將完整的α淀粉酶變體表達框插入線性化的pyf-tsde中的bglii位點，最終得到的溫敏型整合質(zhì)粒被命名為pyf-tsint-amy(圖3)。上述序列的合成由genscript公司來完成，將上述序列依次無縫串聯(lián)得到α淀粉酶酶表達框。本框架中信號肽序列是從枯草芽孢桿菌中篩選出的，能夠有效的提高α淀粉酶的分泌。3.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化將上述整個α淀粉酶表達框(包含amye基因上下游同源片段)利用重組技術(shù)環(huán)化bglii線性化的pyf-tsde質(zhì)粒(重組試劑盒由genscript公司提供)，構(gòu)建好的溫敏型質(zhì)粒命名為pyf-tsint-amy。該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化至apre及blase蛋白酶基因缺失的地衣芽孢桿菌中(cicc22794，中國微生物菌種庫購得)，無抗性標(biāo)記的α淀粉酶變體表達框?qū)⑻鎿Qamye。采用上述的方法，成功整合α淀粉酶變體編碼基因至b.licheniformis染色體上的菌株在藍色淀粉平板上產(chǎn)生透明圈，pcr進一步驗證表達框被整合在受體菌株的amye位點。產(chǎn)α淀粉酶變體的b.licheniformis工程菌株在-80℃保存。實施例4:α淀粉酶變體生產(chǎn)的搖瓶發(fā)酵取一個活化的細菌單克隆(含有α淀粉酶變體表達框)，接種到20ml培養(yǎng)基中(含有麥芽糖漿4.0％，蛋白胨2.0％，酵母粉0.1％kh2po40.6％以及相應(yīng)抗生素)培養(yǎng)到對數(shù)期。取1.2ml培養(yǎng)液接種到30ml培養(yǎng)基中(含有麥芽糖漿12.0％，蛋白胨1.0％，酵母粉1％kh2po40.2％，mncl20.003％)，在往復(fù)搖床中120rpm振蕩培養(yǎng)3天。分別在24小時，48小時和72小時取樣1ml，1000rpm離心1min。將上清液保存，做sds-page分析。α淀粉酶變體分子量約為53kd。測定α淀粉酶變體活性，方法同實施例6。實施例5:α淀粉酶變體分步補料發(fā)酵工藝將實施例3中得到的-80℃冷凍保存的基因工程b.licheniformis菌株劃線與瓊脂斜面上，37℃過夜恢復(fù)培養(yǎng)。瓊脂斜面配方如下：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，nacl1％，瓊脂粉2％。首先，選取數(shù)個新鮮克隆在盛有50ml培養(yǎng)基的種子搖瓶中于37℃培養(yǎng)16小時。種子搖瓶配方：麥芽糖漿4.0％，蛋白胨2.0％，酵母提取物0.1％，kh2po40.6％。16小時后，將所有的種子發(fā)酵液全部轉(zhuǎn)移至盛有4l培養(yǎng)基的7l不銹鋼發(fā)酵罐中于37℃，攪拌速度350rpm，通氣速率為650l/h的條件下持續(xù)發(fā)酵12小時。發(fā)酵罐配方：麥芽糖漿6.0％，蛋白胨1.0％，酵母提取物1％，kh2po40.2％，mncl20.003％。然后用5％磷酸控制發(fā)酵ph在5.7±0.2左右，并在前18小時以速率1l/18hrs后110小時以速率0.5l/18hrs向發(fā)酵罐中不斷補料。補料配方如下：麥芽糖漿48％，蛋白胨6％，酵母提取物8％。整個發(fā)酵過程持續(xù)140-150小時。收集并在4℃，1010krpm，30分鐘離心發(fā)酵罐中所有培養(yǎng)基，離心后的上清用于α淀粉酶變體酶活分析。實施例6:淀粉酶活力測定淀粉酶活力測定用的是百斯杰淀粉酶活力(bau)。1個bau單位的定義：在ph6.0、70℃條件下，1分鐘液化1mg可溶性淀粉所需要的酶量。簡單的說，酶活測定如下操作：20ml20g/l可溶性淀粉溶液與5mlph6.0磷酸緩沖液混合，先在70℃預(yù)熱8min，加入1.0ml稀釋后的酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，然后取1ml反應(yīng)液，加入預(yù)先盛有0.5ml0.1mol/l鹽酸溶液和5ml稀碘液的試管中，搖勻，并以0.5ml0.1mol/l鹽酸溶液和5ml稀碘液為空白，于660nm波長下，迅速測定其吸光值，根據(jù)吸光度查表，獲得測試樣品的酶活。實施例7:淀粉酶的應(yīng)用除另外說明的，1bau:淀粉酶的活力測定用的是百斯杰淀粉酶單位(bau)。一個bau被定義為在ph6.0、70℃條件下，1分鐘液化1mg可溶性淀粉所需要的酶量。tds:每噸干物質(zhì)從地衣芽孢桿菌細胞中表達并分離獲得的淀粉酶變體首先用玉米淀粉進行第一輪液化測試。測試條件：18波美度(°bé)、充分混勻、ph用鹽酸調(diào)節(jié)至5.2。加入0.4kg/tds的淀粉酶，分別采用噴射溫度100、105、108、112、115度，維持5-8min后閃蒸，95度維持120min。液化后進行de和碘試測試，同時注意觀察蛋白絮凝和粘度情況，以wildtype為對照,結(jié)果見表格1和圖4。表1:不同噴射溫度條件下，淀粉酶液化應(yīng)用比較溫度(℃)wildtypede(％)8008突變體3de(％)10018.0219.0210517.7918.9810815.0018.2611213.8517.191157.0514.11結(jié)果顯示，8008突變體3(本發(fā)明淀粉酶變體)明顯優(yōu)于wildtype，8008突變體3在不同噴射溫度情況下，100、105、108℃液化過頭，112℃液化正合適，而且蛋白絮凝好，而在115℃，液化效果仍較好，蛋白絮凝正常，說明該l型淀粉酶變體具有非常好的耐熱性，而wildtype不能耐受115℃的高溫。其次，我們通過在不同淀粉漿濃度條件下的液化實驗，測定了淀粉酶對高底物濃度的耐受性。液化反應(yīng)條件同上所述，噴射溫度為108℃,以wildtype為對照,結(jié)果見表2和圖5。表2:不同淀粉漿濃度下，淀粉酶液化應(yīng)用比較波美度(°bé)wildtypede(％)8008突變體3de(％)1515.2718.111815.0417.722014.9817.892212.4916.45如表2所示，8008突變體3明顯優(yōu)于wildtype，8008突變體3在不同淀粉漿濃度條件下，淀粉漿濃度高達22°bé條件下，淀粉酶仍能正常液化，說明l型淀粉酶可以進行濃漿液化，有效節(jié)約工廠成本。然后，我們測定了淀粉酶的耐酸性，同時進行不同加酶量條件下的液化性能。液化反應(yīng)條件同上所述，ph為5.0，加酶量分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6kg/tds，以wildtype為對照，結(jié)果見表3和圖6。表3:在ph5.0下，淀粉酶不同加酶量液化應(yīng)用比較加酶量(kg/tds)wildtypede(％)8008突變體3de(％)0.28.2410.840.311.6114.730.414.9817.480.515.1617.590.616.7719.43如表3所示，8008突變體3明顯優(yōu)于wildtype，8008突變體3在低ph、0.2-0.3kg/tds添加量條件下，淀粉酶變體仍能正常液化，說明該l型淀粉酶變體對低ph具有較強的耐受性，同時在0.2kg/tds低加酶量條件下，該淀粉酶變體仍能正常液化，這可有效降低工廠用酶成本。另外，我們進行了淀粉酶對糖化的影響測試，同時以wildtype淀粉酶、liquozymesupra(購自novozymes)液化制得的液化液進行對比，測試條件：32％干物質(zhì)(ds)、充分混勻、ph用鹽酸調(diào)節(jié)至4.3。加入0.45kg/tds復(fù)合糖化酶，200ml的反應(yīng)在60℃分別反應(yīng)24和48小時。樣品經(jīng)0.22um膜過濾及100℃滅活后用于hplc分析。結(jié)果見表4。表4:淀粉酶對糖化的影響如表4所示，使用本發(fā)明淀粉酶變體液化液和wildtype液化液，本發(fā)明淀粉酶變體糖化效果明顯優(yōu)于wildtype，同時使用本發(fā)明淀粉酶變體液化液和liquozymesupra液化液，兩者糖化效果完全一樣，說明本發(fā)明淀粉酶變體可以應(yīng)用于淀粉糖行業(yè)。另外，我們進行了淀粉酶對小麥淀粉的影響測試，測試條件：22、25、28、30％(w/w)不同底物濃度、充分混勻、ph用鹽酸調(diào)節(jié)至5.6。加入0.4kg/tds的淀粉酶，采用91-95℃維持120min。液化后進行de和碘試測試，同時注意觀察蛋白絮凝和粘度情況，以wildtype為對照，結(jié)果見表5和圖7。表5:不同底物濃度條件下，淀粉酶液化應(yīng)用比較底物濃度(％)wildtypede(％)8008突變體3de(％)2220.8520.802520.2120.292819.6419.583018.1419.40結(jié)果顯示，8008突變體3與wildtype結(jié)果相似，在不同底物濃度情況下，22-25％液化正合適，而且蛋白絮凝好，而在28和30％，液化效果仍較好，蛋白絮凝正常，說明本發(fā)明淀粉酶變體可以進行濃漿液化，有效節(jié)約工廠成本。其次，我們測定了淀粉酶的耐酸性，同時進行不同ph條件下的液化性能。液化反應(yīng)條件同上所述，ph分別為4.8、5.2、5.6、6.0，加酶量為0.4kg/tds，以wildtype為對照，結(jié)果見表6和圖8。表6:在不同ph下，淀粉酶液化應(yīng)用比較如表6所示，在ph4.8條件下，本發(fā)明淀粉酶變體仍能正常液化，說明本發(fā)明淀粉酶變體對低ph具有較強的耐受性，而wildtype不能耐低ph。隨后，我們進行了淀粉酶對大米的影響測試，測試條件：12、15、18、20波美度(°bé)不同底物濃度、充分混勻、ph用鹽酸調(diào)節(jié)至5.2。加入0.4kg/tds的淀粉酶，噴射溫度108℃，維持5-8min后閃蒸，95度維持120min。液化后進行de和碘試測試，同時注意觀察蛋白絮凝和粘度情況，以wildtype為對照，結(jié)果見表格7和圖9。表7:不同底物濃度條件下，淀粉酶液化應(yīng)用比較底物濃度(°bé)wildtypede(％)8008突變體3de(％)1219.5322.341518.8721.351817.0620.962015.7220.13結(jié)果顯示，8008突變體3明顯優(yōu)于wildtype，8008突變體3在不同底物濃度情況下，12-18°bé液化正合適，而且蛋白絮凝好，而在20°bé，液化效果仍較好，蛋白絮凝正常，說明本發(fā)明淀粉酶變體可以進行濃漿液化，有效節(jié)約工廠成本。其次，我們通過在不同淀粉ph(4.8、5.2、5.4、5.6、5.8)條件下的液化實驗，測定了淀粉酶對高底物濃度的耐受性。液化反應(yīng)條件同上所述，噴射溫度為108℃，加酶量為0.4kg/tds，以wildtype為對照，結(jié)果見表8和圖10。表8:在不同ph下，淀粉酶液化應(yīng)用比較phwildtypede(％)8008突變體3de(％)4.87.4616.115.216.8920.235.417.4220.745.617.9621.355.818.4421.94如表8所示，在ph4.8-5.8條件下，本發(fā)明淀粉酶變體變體仍能正常液化，說明本發(fā)明淀粉酶變體變體對低ph具有較強的耐受性，而wildtype耐酸性較差。最后，因為淀粉酶在酒精工業(yè)生產(chǎn)上有重要應(yīng)用，我們還測試了淀粉酶在酒精生產(chǎn)上的液化效果，配制不同料水比的玉米粉(40目)，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至5.8，加入0.145kg/tds淀粉酶。在95℃蒸煮液化120min。反應(yīng)結(jié)束后，測定樣品de和粘度，同時與liquozymesupra(購自novozymes)進行對比試驗，。結(jié)果見表9和圖11.表9:淀粉酶在玉米酒精液化上的應(yīng)用比較玉米粉料水比de(％)粘度(mpas)淀粉酶-1:211.911538淀粉酶-1:2.312.411096淀粉酶-1:2.512.63557淀粉酶-1:2.712.74442liquozymesupra-1:212.191702liquozymesupra-1:2.312.781114liquozymesupra-1:2,512.88506liquozymesupra-1:2.713.32352如表9所示，本發(fā)明淀粉酶變體與liquzoymesupra可以達到同樣的應(yīng)用效果。說明其可以應(yīng)用于玉米酒精工業(yè)。綜上所述，依照本發(fā)明中的實驗結(jié)果，本發(fā)明淀粉酶變體變體有較好的耐熱性、ph耐受性，能應(yīng)用于高濃度淀粉漿液化，因此能應(yīng)用于淀粉糖行業(yè)和酒精行業(yè)。本發(fā)明的實施例除了應(yīng)用了本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)方法外，更離不開發(fā)明主旨的指導(dǎo)。因此，本發(fā)明不僅限于所公開的具體實施例，更要覆蓋本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的修訂條款，詳見權(quán)利要求。<110>南京百斯杰生物工程有限公司<120>淀粉酶應(yīng)用<160>7<210>1<211>1446<212>dna<213>b.licheniformis<220><223>b.licheniformis的α淀粉酶的全長編碼基因序列<400>1gtaaatggcacgctcatgcagtattttgaatggtatactccgaacgacggccagcattgg60aaacggttgcagaatgatgcggaacatttgtcggatatcggtattactgccgtctggatt120cccccggcatataagggaacgagccaagcggatgtgggctacggtgcttacgacctttat180gatttaggggagtttcatcaaaaagggacggttcggacaaagtacggcacaaaaggagag240ctgcaatctgcgatcaaaagtcttcattcccgcgacattaacgtttacggggatgtggtc300atcaaccacaaaggcggcgctgatgcgaccgaagatgtaaccgcggttgaagtcgatccc360gctgaccgcaaccgcgtaatttcaggagaacacctaattaaagcctggacacattttcat420tttccggggcgcggcagcacatacagcgattttaaatggcattggtaccattttgacgga480accgattgggacgagtcccgaaagctgaaccgcatctataagtttcaaggaaaggcttgg540gattgggaagtttccaatgaaaacggcaactatgattatttgatgtatgccgacatcgat600tatgaccatcctgatgtcgcagcagaaattaagagatggggcacttggtatgccaatgaa660ctgcaattggacggtttccgtcttgatgctgtcaaacacattaaattttcttttttgcgg720gattgggttaatcatgtcagggaaaaaacggggaaggaaatgtttacggtagctgaatat780tggcagaatgacttgggcgcgctggaaaactatttgaacaaaacaaattttaatcattca840gtgtttgacgtgccgcttcattatcagttccatgctgcatcgacacagggaggcggctat900gatatgaggaaattgctgaacggtacggtcgtttccaagcatccgttgaaatcggttaca960tttgtcgataaccatgatacacagccggggcaatcgcttgagtcgactgtccaaacatgg1020tttaagccgcttgcttacgcttttattctcacaagggaatctggataccctcaggttttc1080tacggggatatgtacgggacgaaaggagactcccagcgcgaaattcctgccttgaaacac1140aaaattgaaccgatcttaaaagcgagaaaacagtatgcgtacggagcacagcatgattat1200ttcgaccaccatgacattgtcggctggacaagggaaggcgacagctcggttgcaaattca1260ggtttggcggcattaataacagacggacccggtggggcaaagcgaatgtatgtcggccgg1320caaaacgccggtgagacatggcatgacattaccggaaaccgttcggagccggttgtcatc1380aattcggaaggctggggagagtttcacgtaaacggcgggtcggtttcaatttatgttcaa1440agataa1446<210>2<211>481<212>dna<213>b.licheniformis<220><223>b.licheniformis的α淀粉酶氨基酸序列<400>2valasnglythrleumetglntyrpheglutrptyrthrproasnasp151015glyglnhistrplysargleuglnasnaspalagluhisleuserasp202530ileglyilethralavaltrpileproproalatyrlysglythrser354045glnalaaspvalglytyrglyalatyraspleutyraspleuglyglu505560phehisglnlysglythrvalargthrlystyrglythrlysglyglu65707580leuglnseralailelysserleuhisserargaspileasnvaltyr859095glyaspvalvalileasnhislysglyglyalaaspalathrgluasp100105110valthralavalgluvalaspproalaaspargasnargvalileser115120125glygluhisleuilelysalatrpthrhisphehispheproglyarg130135140glyserthrtyrseraspphelystrphistrptyrhispheaspgly145150155160thrasptrpaspgluserarglysleuasnargiletyrlysphegln165170175glylysalatrpasptrpgluvalserasngluasnglyasntyrasp180185190tyrleumettyralaaspileasptyrasphisproaspvalalaala195200205gluilelysargtrpglythrtrptyralaasngluleuglnleuasp210215220glypheargleuaspalavallyshisilelyspheserpheleuarg225230235240asptrpvalasnhisvalargglulysthrglylysglumetphethr245250255valalaglutyrtrpglnasnaspleuglyalaleugluasntyrleu260265270asnlysthrasnpheasnhisservalpheaspvalproleuhistyr275280285glnphehisalaalaserthrglnglyglyglytyraspmetarglys290295300leuleuasnglythrvalvalserlyshisproleulysservalthr305310315320phevalaspasnhisaspthrglnproglyglnserleugluserthr325330335valglnthrtrpphelysproleualatyralapheileleuthrarg340345350gluserglytyrproglnvalphetyrglyaspmettyrglythrlys355360365glyaspserglnarggluileproalaleulyshislysileglupro370375380ileleulysalaarglysglntyralatyrglyalaglnhisasptyr385390395400pheasphishisaspilevalglytrpthrarggluglyaspserser405410415valalaasnserglyleualaalaleuilethraspglyproglygly420425430alalysargmettyrvalglyargglnasnalaglygluthrtrphis435440445aspilethrglyasnargsergluprovalvalileasnserglugly450455460trpglygluphehisvalasnglyglyservalseriletyrvalgln465470475480arg<210>3<211>1464<212>dna<213>人工序列<220><223>α淀粉酶變體的核苷酸編碼序列<400>3gcgaacgtaaatggcacgctcatgcagtattttgaatggtatactccgaacgacggccag60cattggaaacggttgcagaatgatgcggaacatttgtcggatatcggtattactgccgtc120tggattcccccggcatataagggaacgagccaagcggatgtgggctacggtgcttacgac180ctttatgatttaggggagtttcatcaaaaagggacggttcggacaaagtacggcacaaaa240ggagagctgcaatctgcgatcaaaagtcttcattcccgcgacattaacgtttacggggat300gtggtcatcaaccacaaaggcggcgctgatgcgaccgaagatgtaaccgcggttgaagtc360gatcccgctgaccgcaaccgcgtaatttcaggagaacacctaattaaagcctggacacat420tttcattttccggggcgcggcagcacatacagcgattttaaatggcattggtaccatttt480gacggaaccgattgggacgagtcccgaaagctgaaccgcatctataagtttcaaggaaag540gcttgggattgggaagtttccaatgaaaacggcaactatgattatttgatgtatgccgac600atcgattatgaccatcctgatgtcgcagcagaaattaagagatggggcacttggtatgcc660aatgaactgcaattggacggtttccgtcttgatgctgtcaaacacattaaattttctttt720ttgcgggattgggttaatcatgtcagggaaaaaacggggaaggaaatgtttacggtagct780gaatattggcagaatgacttgggcgcgctggaaaactatttgaacaaaacaaattttaat840cattcagtgtttgacgtgccgcttcattatcagttccatgctgcatcgacacagggaggc900ggctatgatatgaggaaattgctgaacggtacggtcgtttccaagcatccgttgaaatcg960gttacatttgtcgataaccatgatacacagccggggcaatcgcttgagtcgactgtccaa1020acatggtttaagccgcttgcttacgcttttattctcacaagggaatctggataccctcag1080gttttctacggggatatgtacgggacgaaaggagactcccagcgcgaaattcctgccttg1140aaacacaaaattgaaccgatcttaaaagcgagaaaacagtatgcgtacggagcacagcat1200gattatttcgaccaccatgacattgtcggctggacaagggaaggcgacagctcggttgca1260aattcaggtttggcggcattaataacagacggacccggtggggcaaagcgaatgtatgtc1320ggccggcaaaacgccggtgagacatggcatgacattaccggaaaccgttcggagccggtt1380gtcatcaattcggaaggctggggagagtttcacgtaaacggcgggtcggtttcaatttat1440gttcaaagataaaaaacgacctaa1464<210>4<211>486<212>prt<213>人工序列<220><223>α淀粉酶變體的氨基酸序列<400>4alaasnvalasnglythrleumetglntyrpheglutrptyrthrpro151015asnaspglyglnhistrplysargleuglnasnaspalagluhisleu202530seraspileglyilethralavaltrpileproproalatyrlysgly354045thrserglnalaaspvalglytyrglyalatyraspleutyraspleu505560glygluphehisglnlysglythrvalargthrlystyrglythrlys65707580glygluleuglnseralailelysserleuhisserargaspileasn859095valtyrglyaspvalvalileasnhislysglyglyalaaspalathr100105110gluaspvalthralavalgluvalaspproalaaspargasnargval115120125ileserglygluhisleuilelysalatrpthrhisphehisphepro130135140glyargglyserthrtyrseraspphelystrphistrptyrhisphe145150155160aspglythrasptrpaspgluserarglysleuasnargiletyrlys165170175pheglnglylysalatrpasptrpgluvalserasngluasnglyasn180185190tyrasptyrleumettyralaaspileasptyrasphisproaspval195200205alaalagluilelysargtrpglythrtrptyralaasngluleugln210215220leuaspglypheargleuaspalavallyshisilelyspheserphe225230235240leuargasptrpvalasnhisvalargglulysthrglylysglumet245250255phethrvalalaglutyrtrpglnasnaspleuglyalaleugluasn260265270tyrleuasnlysthrasnpheasnhisservalpheaspvalproleu275280285histyrglnphehisalaalaserthrglnglyglyglytyraspmet290295300arglysleuleuasnglythrvalvalserlyshisproleulysser305310315320valthrphevalaspasnhisaspthrglnproglyglnserleuglu325330335serthrvalglnthrtrpphelysproleualatyralapheileleu340345350thrarggluserglytyrproglnvalphetyrglyaspmettyrgly355360365thrlysglyaspserglnarggluileproalaleulyshislysile370375380gluproileleulysalaarglysglntyralatyrglyalaglnhis385390395400asptyrpheasphishisaspilevalglytrpthrarggluglyasp405410415serservalalaasnserglyleualaalaleuilethraspglypro420425430glyglyalalysargmettyrvalglyargglnasnalaglygluthr435440445trphisaspilethrglyasnargsergluprovalvalileasnser450455460gluglytrpglygluphehisvalasnglyglyservalseriletyr465470475480valglnarglysthrthr485<210>5<211>873<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的啟動子序列<400>5ggtaccagctattgtaacataatcggtacgggggtgaaaaagctaacggaaaagggagcg60gaaaagaatgatgtaagcgtgaaaaattttttatcttatcacttgaaattggaagggaga120ttctttattataagaaaacggatgctgaaggaaggaaacgaagtcggcaaccattcctgg180gaccatccgttattgacaaggctgtcaaatgaaaaagcgtatcaggagattaacgacacg240caagaaatgatcgaaaaaatcagcggacacctgcctgtacacttgcgtcctccatacggc300gggatcaatgattccgtccgctcgctttccaatctgaaggtttcattgtgggatgttgat360ccggaagattggaagtacaaaaataagcaaaagattgtcaatcatgtcatgagccatgcg420ggagacggaaaaatcgtcttaatgcacgatatttatgcaacgtccgcagatgctgctgaa480gagattattaaaaagctgaaagcaaaaggctatcaattggtaactgtatctcagcttgaa540gaagtgaagaagcagagaggctattgaataaatgagtagaaagcgccatatcggcgcttt600tcttttggaagaaaatatagggaaaatggtatttgttaaaaattctgaatatttatacaa660tatcatatgtttcacagggaggagaatcggccttaagggcctgcaatcgattgtttgaga720aaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggtattttttatgctgtc780cagactgtccgctgtgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgacattattttactgatat840gtataatataatttgtataagaaaatggagctc873<210>6<211>98<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的終止序列<400>6tcaataataataacgctgtgtgctttaagcacacagcgttttttagtgtgtatgaatcga60gatcctgagcgccggtcgctaccattaccagttggtct98<210>7<211>96<212>dna<213>人工序列<220><223>天然信號序列<400>7atgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgtta60tttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagccgca96當(dāng)前第1頁12