專利名稱：血清對氧磷酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸，由此多核苷酸編碼的多肽，此多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及此多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明的多肽為血清對氧磷酶。本發(fā)明還涉及此多肽活性的抑制。
對硫磷(二乙基-對-硝基苯基硫代磷酸)和chlorpyrifos(O，O-二乙基-O-3，5，6-三氯-2-吡醇(pyridinol))是普遍使用的有機(jī)磷殺蟲劑，每年都有大量農(nóng)業(yè)工人和其它工人因此而中毒(Hayes，W.J.，Pesticides Studied in Man，Wilkins and Wilkins，Baltimore，pp.284-435(1982))。兩種化合物在體內(nèi)激活形成相應(yīng)的膽堿酯酶的毒性氧磷抑制劑。這導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和相關(guān)的神經(jīng)紊亂。兩種氧磷被血清酶對氧磷酶/芳基酯酶水解，如果不是全部，那就是絕大多數(shù)的酶位于高密度脂蛋白(HDL)顆粒中(Mackness，M.I.，et al.，Biochem.Pharmacol.，322291-2296(1983))。
在人類中，這種酶顯示依賴底物的活性多態(tài)性(Mallinckrodt，M.G.and Diepgen，T.L，Toxicol.Environ.Chem.，1879-196(1988))。人血清對氧磷酶/芳基酯酶催化有機(jī)磷化合物，芳香羧酸酯和氨基甲酸酯的水解。似乎存在兩個等位基因，一個等位基因產(chǎn)物以高的轉(zhuǎn)換數(shù)水解對氧磷，另外一個以低的轉(zhuǎn)換數(shù)水解對氧磷。其他底物諸如苯乙酸酯，β和萘乙酸酯(Gan，K.N.，et al.，Drug Metab.Dispos.，19100-106(1991))和chlorpyrifos氧磷(Furlong，C.E.，et al.，Anal.Biochem.，180242-247(1989))被兩個等位基因產(chǎn)物以相同的或相近的速率水解。此酶還水解神經(jīng)毒劑soman和沙林(Gan，K.N.，et al.，Drug Metab.Dispos.，19100-106(1991))。對有神經(jīng)毒性的有機(jī)磷化合物的水解是對氧磷酶的一個有益的偶然的活性。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一個新的成熟多肽，和其有生物學(xué)活性并有益于診斷或治療的片段，類似物和衍生物。本發(fā)明的多肽是人源性的。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸分子，包括mRNA，DNA，cDNA，基因組DNA，及其類似物和有生物學(xué)活性的有益于診斷或治療的片段。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)此多肽的方法，包括在促進(jìn)所說蛋白質(zhì)表達(dá)和所說蛋白的回收的條件下培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了此多肽或編碼此多肽的多核苷酸用作藥物的方法，例如，作為有機(jī)磷中毒的解毒劑(殺蟲劑中毒)和防止神經(jīng)元細(xì)胞死亡。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一個抗此多肽的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了核酸探針，包括與本發(fā)明的核酸序列特異性雜交的足夠長的核酸分子。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了檢測與編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列中突變有關(guān)的疾病或疾病易感性的診斷分析方法。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了利用此多肽或編碼此多肽的多核苷酸進(jìn)行體外目的的科學(xué)研究的方法，例如，DNA的合成和DNA載體的構(gòu)建。
從本文的講授中，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該明白本發(fā)明的這些和其它一些方面。
下列附圖意在描述本發(fā)明實(shí)施方案的說明，并非是對由權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的范圍的限制。


圖1顯示推斷的成熟血清對氧磷酶多肽的cDNA序列和推測的氨基酸序列。氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫表示。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了編碼具有圖1所示的推測的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽或由1994年5月12日保藏的ATCC保藏號為75773的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的分離的核酸(多核苷酸)。
本發(fā)明的多核苷酸是從人扁桃體cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的，結(jié)構(gòu)上與人血清對氧磷酶/芳基酯酶家族有關(guān)。它含有一個編碼約356個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放閱讀框架。此蛋白質(zhì)與oryctolagus cuniculus的血清對氧磷酶的同源性最高，在一個249個氨基酸片段中67％相同，83％相似。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，并且如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以與圖1所示的編碼序列(SEQ ID NO1)相同，或與保藏克隆的編碼序列相同，或者也可以是不同的編碼序列，該編碼序列由于遺傳密碼的豐余性或簡并性，與圖1的DNA(SEQ ID NO1)或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽(SEQ ID NO2)或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和另外的編碼序列如前導(dǎo)序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的另外的編碼序列)和非編碼序列如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即僅包括多肽編碼序列的多核苷酸，以及包括另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ IDNO2)的多肽或編碼由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的該多核苷酸的等位基因變異體，或是該多核苷酸的非天然發(fā)生的變異體。
因此，本發(fā)明包括編碼圖1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NO2)或由保藏克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變異體，所述變異體編碼圖1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物。這些核苷酸變異體包括缺失變異體、置換變異體和增加或插入變異體。
如上所述，多核苷酸可以具有為圖1所示的編碼序列(SEQ ID NO1)的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列，或保藏克隆的編碼序列的天然發(fā)生變異體的編碼序列。如本領(lǐng)域所公知的，等位基因變異體是多核苷酸的另一種形式，其可以置換、缺失或增加一個或多個核苷酸，但基本上不改變編碼多肽的功能。
本發(fā)明還包括這樣的多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以在同一讀框中與有助于從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌多肽的多核苷酸序列融合，例如前導(dǎo)序列，其功能是作為分泌序列控制多肽從細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)。具有前導(dǎo)序列的多肽是一種前蛋白，宿主細(xì)胞可裂解前導(dǎo)序列以形成多肽的成熟形式。所述的多核苷酸還可編碼一種蛋白原，其是成熟蛋白加上附加的5’氨基酸殘基。具有序列原的成熟蛋白是一種蛋白原及該蛋白的非活性形式。一旦序列原被切下，則保留一有活性的成熟蛋白。
因此，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白，或編碼具有序列原的蛋白，或編碼具有序列原或前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸還可以具有在讀框內(nèi)與標(biāo)記序列融合的編碼序列，其可用于純化本發(fā)明的多肽。標(biāo)記序列可以是，例如，由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記物用于在細(xì)菌宿主中純化與該標(biāo)記物融合的成熟多肽，或者，例如，當(dāng)使用哺乳動物宿主如COS-7細(xì)胞時，標(biāo)記序列可以是血凝素標(biāo)記物(HA)。HA標(biāo)記物相應(yīng)于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
術(shù)語“基因”意思是產(chǎn)生多肽鏈的DNA片段；它包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域(前導(dǎo)序列和尾部序列)和各個編碼片段(外顯子)之間的中斷序列(內(nèi)含子)。
本發(fā)明的全長基因片段可以用作cDNA文庫的雜交探針以分離全長的cDNA和分離與本發(fā)明基因的序列高度相似或有相似生物學(xué)活性的其它c(diǎn)DNA。這種類型的探針優(yōu)選有至少30個堿基和可以含有，例如，50或更多個堿基。此探針還可以用于鑒定與全長轉(zhuǎn)錄文庫和基因組文庫相對應(yīng)的cDNA克隆，或含有包括調(diào)和啟動子區(qū)，外顯子和內(nèi)含子的完整基因的克隆。篩選的一個例子包括用已知DNA序列合成一個寡核苷酸探針以分離基因的編碼區(qū)。具有與本發(fā)明的基因互補(bǔ)的序列的標(biāo)記寡核苷酸被用來篩選人cDNA，基因組DNA或mRNA文庫以確定探針可以雜交到哪個文庫。
本發(fā)明還涉及可與上述序列雜交的多核苷酸，條件是序列間具有至少70％、優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％的同一性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所用的，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指雜交僅發(fā)生在序列間具有至少95％、優(yōu)選97％同一性的情況下。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼基本上保持了由圖1的cDNA(SEQ ID NO1)或保藏的cDNA編碼的成熟多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。
作為選擇，此多核苷酸可以有至少20個、優(yōu)選至少30個、更優(yōu)選至少50個可與本發(fā)明的多核苷酸雜交并與本發(fā)明的多核苷酸相同的堿基，如本文所描述的，這些堿基可能也可能不保留活性。例如，這種多核苷酸可以用作SEQ ID NO1的多肽的探針以用于，例如，回收此多核苷酸或作為診斷探針或作為PCR引物。
因此，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸有至少70％同一性，更好至少90％同一性和最好至少95％同一性的多核苷酸及其片段，其中的片段有至少30個堿基和有最好至少50個堿基，本發(fā)明還涉及由此種多核苷酸編碼的多肽。
本文所指的保藏物將根據(jù)國際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定期限保藏。這些保藏僅為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，而不是對根據(jù)35 U.S.C112索取保藏物的許可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及該序列編碼的多肽的氨基酸序列引入本文作參考，并且在與本文的序列描述有抵觸時，其是參照。制造、使用或銷售保藏物需經(jīng)許可，而本文不授予這種許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的血清對氧磷酶多肽，以及該多肽的片段、類似物和衍生物。
當(dāng)指圖1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA編碼的多肽時，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持這些多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，類似物包括蛋白原，其可通過裂解蛋白原部分而激活以生產(chǎn)有活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中的一或多個氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基取代(優(yōu)選由保守的氨基酸殘基取代)，并且這種取代的氨基酸殘基可以由遺傳密碼編碼，也可不是由遺傳密碼編碼，或者(ii)其中的一或多個氨基酸殘基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物例如為增加多肽的半壽期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iV)其中有附加的氨基酸與成熟多肽融合，例如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于純化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。這種片段、衍生物和類似物被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選地以分離的形式提供，并優(yōu)選純化至均一性。
術(shù)語“分離的”是指從其原始環(huán)境(例如，若其是天然存在的則是天然環(huán)境)中脫離的物質(zhì)。例如，存在于活體動物中的天然發(fā)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但從一些或所有共存物質(zhì)中分離的相同的多核苷酸或DNA或多肽則是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是某種組合物的一部分，并且如果這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，則其還是分離的。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽(尤其是成熟多肽)及與SEQ ID NO2的多肽有至少70％相似性(最好至少70％相同)的多肽和與SEQ ID NO2的多肽有最好至少90％相似性(最好至少90％相同)的多肽和與SEQ ID NO2的多肽有最好至少95％相似性(最好至少95％相同)的多肽，還包括通常含有至少30個氨基酸和最好至少50個氨基酸的此多肽的一部分。
如本領(lǐng)域所公知的，兩個多肽之間的“相似性”是通過比較一個多肽與另一個多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸殘基來確定的。
本發(fā)明多肽的片段或部分可以通過肽合成用于生產(chǎn)相應(yīng)的全長多肽；因此，此片段可以用作生產(chǎn)此全長多肽的中間物。本發(fā)明的多肽的片段或部分可以用于合成本發(fā)明的全長多肽。
本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，以及用重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞用本發(fā)明的載體遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述的載體可以是克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等。遺傳工程化的宿主細(xì)胞可以在改良的傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，改良培養(yǎng)基是為了激活啟動子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增血清對氧磷酶基因。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是先前用于選擇用來表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件，其對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可通過重組技術(shù)用于生產(chǎn)多肽，因此，例如，該多核苷酸可以包括在任一種表達(dá)載體中特別是載體或質(zhì)粒中以表達(dá)多肽。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA的結(jié)合體的載體；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和擬狂犬病毒。然而，也可使用任何其它載體，只要其在宿主中可復(fù)制和生存。
可通過多種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入載體，通常，通過本領(lǐng)域公知的程序?qū)NA序列插入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些和其它程序?qū)儆诒绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范疇。
表達(dá)載體中的DNA序列與合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動子)連接以指導(dǎo)mRNA合成，作為這些啟動子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40啟動子，E.colilac或trp啟動子，λ噬菌體PL啟動子和其它公知用于控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或者病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可包括用于擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
另外，表達(dá)載體優(yōu)選含有一個用于為選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞提供表型標(biāo)記的基因，如對于真核細(xì)胞培養(yǎng)為二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如為四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
可采用含有如上所述合適DNA序列以及合適啟動子或調(diào)控序列的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主以使宿主表達(dá)蛋白質(zhì)。
作為合適的宿主的例子，可以提及的有細(xì)菌細(xì)胞，如E.coli、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏桿菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅和粘蟲Sf9；動物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。選擇合適的宿主細(xì)胞被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
更具體地，本發(fā)明還包括重組構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一或多種上述序列。該構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)?；虿《据d體，在該載體中以正向或反向插入本發(fā)明的序列。在這一實(shí)施方案的一個優(yōu)選方面，該構(gòu)建體還包括調(diào)節(jié)序列，包括例如，與所述序列連接的啟動子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知大量的合適的載體和啟動子，它們是可商購的。以下舉出載體的例子，細(xì)菌的載體pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pbs，pD10，phagescript，psiX174，pbluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核載體pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它質(zhì)?；蜉d體，只要其可在宿主中復(fù)制和生存即可。
啟動子區(qū)可以選自使用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)的載體或其它帶有選擇性標(biāo)記的載體的任何所需基因，兩個合適的載體是PKK232-8和PCM7。特別提到的細(xì)菌啟動子包括lacI，1acZ，T3，T7，gpt，lambda PI，PL和trp；真核啟動子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR，和鼠金屬硫蛋白-I。選擇合適的載體和啟動子屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平范疇。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
可以用傳統(tǒng)的方式使用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體以生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物?；蛘?，也可通過常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
在合適的啟動子的控制下，可以在哺乳細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)成熟蛋白質(zhì)，也可采用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)使用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體衍生的RNA生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)。原核和真核宿主使用的合適的克隆和表達(dá)載體見Sambrook，et al，Molecular ClonningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，該書引入本文作參考。
高等真核生物對編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄可通過在載體中插入一增強(qiáng)子序列而得以增加，增強(qiáng)子是約10-300bp的順式作用的DNA因子，其作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄。其例子包括位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)(100-270bp處)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子，以及腺病毒增強(qiáng)子。
通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，如E.coli的氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表達(dá)基因的啟動子以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。這種啟動子可以衍生于編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或熱休克蛋白的操縱子。在合適的階段，雜合結(jié)構(gòu)序列裝配上翻譯起始和終止序列，以及優(yōu)選地，裝配一能指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)入周質(zhì)空間或胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列。任選地，雜合序列可以編碼一包括N-末端鑒別肽的融合蛋白質(zhì)，以賦予所需的特征，如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性和純化簡便性。
用于細(xì)菌的表達(dá)載體的構(gòu)建是通過將編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列與合適的翻譯起始和終止信號一起插入帶有功能啟動子的可操縱閱讀相而完成。載體包括一或多種表型選擇標(biāo)記及一個復(fù)制起點(diǎn)以確證載體保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中擴(kuò)增。合適的用于轉(zhuǎn)化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各菌種，當(dāng)然，也可采用其它菌。
作為代表性而非限制性的例子，有用的細(xì)菌表達(dá)載體可以包括衍生于包含熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳因子的商購質(zhì)粒的選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，這些商購質(zhì)粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322“骨架”部分與合適的啟動子及待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列結(jié)合。
轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株并將宿主菌株培養(yǎng)至合適的細(xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度改變或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選定的啟動子，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時間。
典型地，細(xì)胞由離心收集，用物理或化學(xué)方法破碎，保留得到的粗提物以進(jìn)一步純化。
用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞可用任何常規(guī)方法破碎，如凍-融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎，或使用細(xì)胞裂解試劑，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
也可使用各種哺乳細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系，以及其它能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK細(xì)胞系。哺乳類表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)，合適的啟動子和增強(qiáng)子，以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’旁側(cè)非轉(zhuǎn)錄序列。可使用源自SV40剪接體的DNA序列和多腺苷酸化位點(diǎn)以提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳因子。
血清對氧磷酶多肽可以通過包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水互作層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化。如果需要，可以使用蛋白質(zhì)再折疊步驟以完成成熟蛋白的構(gòu)象。最后，可以用高壓液相色譜(HPLC)作為最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是一個天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成方案的產(chǎn)物，或是通過重組技術(shù)從原核或真核宿主產(chǎn)生(例如，通過培養(yǎng)的細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)。根據(jù)重組生產(chǎn)步驟中所用的宿主的不同，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本發(fā)明的多肽還包括一個起始的甲硫氨酸氨基酸殘基。
本發(fā)明的血清對氧磷酶多肽可以用作有機(jī)磷中毒的解毒劑，因?yàn)槟憠A酯酶的毒性氧磷抑制劑可以被血清對氧磷酶水解。
血清對氧磷酶多肽可以用于阻止因這類中毒引起的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。如果不治療有機(jī)磷中毒，將導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡。
本發(fā)明的序列還可用于染色體鑒定，該序列特異地定向于個別的人染色體的特定位置并可與之雜交。血清對氧磷酶基因的位置靠近染色體7上的囊性纖維化基因。另外，目前需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)，而現(xiàn)在只有很少幾種基于實(shí)際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑可以商購用于標(biāo)記染色體位置。本發(fā)明的將DNA定位于染色體是將這些序列與相關(guān)疾病的基因聯(lián)系起來的非常重要的第一步。
本發(fā)明的多肽可以與合適的藥物載體結(jié)合應(yīng)用，這種組合物包括治療有效量的多肽以及藥物學(xué)可接受的載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水、緩沖的鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其結(jié)合物。配制品應(yīng)適合給藥方式。
本發(fā)明還提供了一種藥物包裝盒或試劑盒，其包括一或多個填充有一或多種本發(fā)明的藥物組合物成分的容器。與這種容器在一起的還有由控制藥品或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)出具的通知，該通知反應(yīng)了該機(jī)構(gòu)許可其為人體用而生產(chǎn)、使用或銷售。另外，本發(fā)明的多肽可以與其它治療化合物結(jié)合應(yīng)用。
所述的藥物組合物可以以傳統(tǒng)的方式給藥，如口服、局部、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)給藥。血清對氧磷酶的給藥量應(yīng)足以有效治療和/或預(yù)防具體的癥狀。通常血清對氧磷酶是以至少約10μg/kg體重而給予，在大多數(shù)情況下，給藥量不超過約8mg/kg體重/天，考慮到給藥途徑、癥狀等，劑量是約每天為10μg/kg體重-1mg/kg體重。
根據(jù)本發(fā)明，這些多肽還可以用于體內(nèi)表達(dá)，即通常所指的“基因治療”。
因此，例如，患者的細(xì)胞可以用編碼某多肽的多核苷酸(DNA或RNA)在體外進(jìn)行工程化，然后用工程化的細(xì)胞提供給需要此多肽治療的患者。這些方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如，細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域所熟知的方法使用含編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆病毒顆粒進(jìn)行工程化。
類似地，例如也可通過本領(lǐng)域公知的程序在體內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行工程化以在體內(nèi)表達(dá)多肽。如本領(lǐng)域所公知的，可將生產(chǎn)含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)者細(xì)胞給予患者以在體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的工程化并在體內(nèi)表達(dá)多肽。通過這種方法給予本發(fā)明的多肽的這些和其它方法對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)是顯而易見的。例如，用于工程化細(xì)胞的表達(dá)載體可以不是反轉(zhuǎn)錄病毒，而是例如腺病毒，其在與合適的輸送載體結(jié)合后可用于在體內(nèi)工程化細(xì)胞。
衍生上述反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的反轉(zhuǎn)錄病毒可以包括，但不限于，莫洛尼氏鼠白血病毒，脾壞死病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒諸如勞氏肉瘤病毒，哈維氏肉瘤病毒，禽類白血病病毒，長臂猿白血病病毒，人類免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增生肉瘤病毒，和乳腺腫瘤病毒。在一個實(shí)施方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體由莫洛尼氏鼠白血病毒衍生而來。
載體包括一個或多個啟動子，可以使用的適當(dāng)?shù)膯幼影ǎ幌抻?，反轉(zhuǎn)錄病毒LTR，SV40啟動子，和Miller，et al.，Biotechniques，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述的人細(xì)胞肥大病毒(CMV)啟動子，或任何其它啟動子(例如，諸如真核細(xì)胞啟動子的細(xì)胞啟動子包括，但不限于，組蛋白，pol III，和β-肌動蛋白啟動子)。其它可以使用的病毒啟動子包括，但不限于，腺病毒啟動子，胸苷激酶(TK)啟動子，和B19細(xì)小病毒啟動子。根據(jù)本文的講授，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該明白如何選擇適當(dāng)?shù)膯幼印?br> 編碼本發(fā)明多肽的核酸序列處于一個適當(dāng)?shù)膯幼涌刂浦??？梢允褂玫倪m當(dāng)?shù)膯幼影?，但不限于，諸如腺病毒主晚期啟動子的腺病毒啟動子；諸如細(xì)胞肥大病毒(CMY)啟動子的異源啟動子；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動子；諸如MMT啟動子的誘導(dǎo)性啟動子；金屬硫蛋白啟動子；熱激啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人類珠蛋白啟動子；諸如單皰疹胸苷激酶啟動子的病毒胸苷激酶啟動子；反轉(zhuǎn)錄病毒LTR(包括上面描述的修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒LTR)；β-肌動蛋白啟動子；人生長激素啟動子。啟動子還可以是控制編碼本發(fā)明多肽的基因的天然啟動子。
反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體用來轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系。可以被轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞系的例子包括，但不限于，如Miller，Human Gene Therapy，Vol.1，pgs.5-14(1990)(引入本文作為參考文獻(xiàn))描述的PE501，PA317，φ-2，φ-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，φCRE，φCRIP，GP＋E－86，GP＋envAm12，和DAN細(xì)胞系。載體可以通過本領(lǐng)域所公知的任何方法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，這些方法包括，但不限于，電穿孔法，脂質(zhì)體法和磷酸鈣沉淀法。在一個選擇中，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以被裝入脂質(zhì)體內(nèi)，或與脂質(zhì)相伴隨，然后轉(zhuǎn)染宿主。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生感染性反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，其中包括編碼本發(fā)明多肽的核酸序列。然后這些反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒可以用于體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的核酸序列?？梢员晦D(zhuǎn)染的真核細(xì)胞包括，但不限于，胚干細(xì)胞，胚癌細(xì)胞，以及造血干細(xì)胞，肝細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，成肌細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，和支氣管上皮細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的基因用作診斷的用途。此基因的突變體的檢測將使某疾病的診斷或?qū)σ蜓鍖ρ趿酌傅退奖磉_(dá)引起的疾病的易感性的診斷成為可能。
攜帶本發(fā)明基因的突變的個體可以通過各種各樣的技術(shù)在DNA水平上進(jìn)行檢測。用于診斷的核酸可以從患者的細(xì)胞中獲得，包括但不限于，血液，尿，唾液，組織活體解剖和尸檢材料。基因組DNA可以直接用于檢測，或在分析前用PCR方法擴(kuò)增(Saiki et al.，Nature，324163-166(1986))。RNA和cDNA也可以用于同樣目的。作為一個例子，與編碼血清對氧磷酶的核酸互補(bǔ)的PCR引物可以用于鑒定和分析突變。例如，缺失和插入可以通過與正?；蛐偷臄U(kuò)增產(chǎn)物相比片段長度大小的改變來檢測。點(diǎn)突變可以通過將擴(kuò)增DNA與放射性標(biāo)記的RNA或放射性標(biāo)記的反義DNA序列雜交來進(jìn)行鑒定?？梢酝ㄟ^核糖核酸酶A消化或熔點(diǎn)溫度的改變將精確配對的序列從錯誤配對的雙螺旋中區(qū)別出來。
參考基因和有突變的基因之間的序列差異可以通過直接的DNA測序方法來揭示。另外，克隆的DNA片段可以用作探針以檢測特定DNA片段。當(dāng)這種方法與PCR方法結(jié)合時其靈敏性大大加強(qiáng)。例如，某測序引物與雙鏈PCR產(chǎn)物或通過修飾的PCR方法產(chǎn)生的單鏈模板分子共同使用。序列測定用傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記的核苷酸方案或用熒光標(biāo)記物的自動測序方案。
基于DNA序列差異的遺傳學(xué)測試可以通過檢測有或沒有變性劑時DNA片段在凝膠內(nèi)的泳動性的改變來完成，小的序列缺失和插入可以通過高分辨率凝膠電泳看到。不同序列的DNA片段可以在變性的甲酰胺梯度凝膠上分開，在這種凝膠中不同DNA片段的泳動性根據(jù)其特定的熔解或部分熔解溫度被阻滯在凝膠的不同位置(參見，例如，Myers et al.，Science，2301242(1985))。
在特定位點(diǎn)上的序列改變也可以用核酸酶(如核糖核酸酶)保護(hù)分析，和S1保護(hù)或化學(xué)斷裂方法來揭示(例如，Cotton et al.，PNAS，USA，854397-4401(1985))。
因此，某特定DNA序列的檢測可以用諸如雜交，核糖核酸酶保護(hù)，化學(xué)斷裂，直接的DNA測序或使用限制酶(例如，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP))和基因組DNA的Southern雜交等方法來完成。
除了更傳統(tǒng)的凝膠電泳和DNA測序方法外，突變還可以通過原位分析來鑒定。
本發(fā)明還涉及檢測各種組織中本發(fā)明多肽的水平改變的診斷分析，因?yàn)榕c正常的對照組織樣品相比此蛋白的過量表達(dá)可以檢測血清對氧磷酶的存在。用于檢測從宿主獲得的樣品中的本發(fā)明的多肽水平的分析方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的，包括放射免疫分析，競爭性結(jié)合分析，Western雜交分析和優(yōu)選的ELISA分析(酶聯(lián)免疫吸附分析)。ELISA分析包括制備血清對氧磷酶抗原特異性的抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。另外通過抗此單克隆抗體來制備報(bào)道抗體。報(bào)道抗體被結(jié)合上一種可檢測到的試劑，如放射性，熒光或?qū)嵤├械睦备^氧化物酶。某樣品從宿主中取出并在固體支持物，例如一個聚苯乙烯皿上溫育，以使樣品中的蛋白與之結(jié)合。然后通過與諸如牛血清白蛋白的非特異性蛋白溫育封閉皿上的任何自由的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。接下來，單克隆抗體在皿中溫育，在這段時間內(nèi)單克隆抗體結(jié)合到與聚苯乙烯皿結(jié)合的任何本發(fā)明的多肽。所有未結(jié)合的單克隆抗體用緩沖液洗掉。然后將偶聯(lián)辣根過氧化物酶的報(bào)道抗體放入皿中，從而導(dǎo)致報(bào)道抗體與任何與本發(fā)明的多肽結(jié)合的單克隆抗體相結(jié)合，然后未結(jié)合的報(bào)道抗體被洗掉。隨后將過氧化物酶底物加入皿中，與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，在指定的時間內(nèi)產(chǎn)生的顏色的深淺是衡量患者樣品的指定體積中本發(fā)明的多肽的數(shù)量的標(biāo)尺。
競爭性分析是將本發(fā)明多肽的特異性抗體結(jié)合到固體支持物上，標(biāo)記的血清對氧磷酶和宿主樣品通過此固體支持物，結(jié)合到此固體支持物上標(biāo)記的數(shù)量與樣品中本發(fā)明的多肽的數(shù)量呈相關(guān)性。
本發(fā)明還提供了篩選藥物的方法以鑒定那些增強(qiáng)(激動劑)血清對氧磷酶和其底物相互作用的藥物，該方法包括，例如，用多種藥物和對硫磷或chlorpyrifos接觸包含編碼血清對氧磷酶的DNA分子的哺乳動物細(xì)胞，檢測那些增強(qiáng)毒性氧磷被血清對氧磷酶水解的藥物，然后即可鑒定起特異性激動劑作用的藥物?？梢允褂酶鞣N各樣的檢測方法，毒性氧磷可以用一種可檢測的標(biāo)記物質(zhì)來“標(biāo)記”(例如，放射性標(biāo)記或非同位素標(biāo)記，如生物素)以使其水解可以測量。用本領(lǐng)域所公知的放射性配基結(jié)合方法，通過選擇與轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的血清對氧磷酶多肽高親和性結(jié)合的化合物來鑒定藥物候選者。
本發(fā)明的序列還可用于染色體鑒定，該序列特異地定向于個別的人染色體的特定位置并可與之雜交。另外，目前需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)，而現(xiàn)在只有很少幾種基于實(shí)際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑可以商購用于標(biāo)記染色體位置。本發(fā)明的將DNA定位于染色體是將這些序列與相關(guān)疾病的基因聯(lián)系起來的非常重要的第一步。
簡而言之，可通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)而將序列定位在染色體上。使用基因的3’非翻譯區(qū)的計(jì)算機(jī)分析快速選擇長度不超過基因組DNA的一個外顯子并因而不會使擴(kuò)增復(fù)雜化的引物，隨后使用這些引物對含有個別的人染色體的體細(xì)胞雜合子進(jìn)行PCR篩選。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合子能得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
體細(xì)胞雜合子的PCR作圖是將特定DNA定位于特定染色體的一個快速程序。采用本發(fā)明相同的寡核苷酸引物，可以類似的方式將來自特定染色體的一組片段或大基因組克隆的集合體進(jìn)行亞定位。其它的可類似用于染色體作圖的作圖策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流選的染色體進(jìn)行的預(yù)篩選，以及通過雜交預(yù)選以構(gòu)建染色體-特異cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的一步法染色體定位。這一技術(shù)可使用短至50或60個堿基cDNA。此技術(shù)的綜述見Verma et al.，HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精確定位于染色體某一位置，則可比較該序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜資料的關(guān)系，這種資料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man中發(fā)現(xiàn)(可在線從Johns Hopkins University Welch Medical Library獲得)。隨后可通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)鑒別基因與已定位于相同染色體區(qū)的疾病之間的關(guān)系。
接著，必須確定感染個體和未感染個體之間的cDNA或基因組序列的差異，如果在一些或所有感染個體中觀察到某一突變而未在任何正常個體中觀察到這種突變，則該突變可能是該疾病的致病原。
應(yīng)用目前的物理作圖和遺傳作圖技術(shù)的分辨率，一種精確定位于與疾病有關(guān)的染色體區(qū)的cDNA可以是50-500個潛在的致病基因中的一個(這假定作圖分辨率為1兆堿基，并且每20kb為一個基因)。
多肽、其片段或其它衍生物、或其類似物、或表達(dá)其的細(xì)胞可用作免疫原生產(chǎn)抗體，這些抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體，以及Fab片段，或者Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)中公知的各種程序生產(chǎn)這些抗體和片段。
抗對應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽的抗體可以通過將多肽直接注射給動物或?qū)⒍嚯慕o予動物、優(yōu)選非人而獲得，如此獲得的抗體隨后與多肽本身結(jié)合。以這種方式，僅編碼多肽的一個片段的序列也可用于生產(chǎn)與完整天然多肽結(jié)合的抗體，這種抗體隨后可用于從表達(dá)該多肽的組織中分離該多肽。
為制備單克隆抗體，可使用任何提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物生產(chǎn)的抗體的技術(shù)，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kozbor et al.，1983，Immunology Today 472)，以及生產(chǎn)人單克隆多肽的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(USP4.946，778)可以用來生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。另外，轉(zhuǎn)基因小鼠也可用于表達(dá)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
以下述實(shí)施例為參考將進(jìn)一步描述本發(fā)明；但是眾所周知，本發(fā)明不僅限于這些實(shí)施例。除非另有特別描述，所有的份和量都根據(jù)重量。
為促進(jìn)對下述實(shí)施例的理解，以下將描述常用的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)?！钡拿菍⑿懽帜竝置于前面和/或后跟大寫字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)?；蛘呤巧藤彽玫降?，或者是公眾可以不受限制地得到的，或者可以根據(jù)公布的程序由可得到的質(zhì)粒構(gòu)建的。另外，與所述的這些等效的質(zhì)粒是本領(lǐng)域公知的，并對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用僅作用于DNA的特定序列的限制性酶對DNA的催化裂解。本文所用的各種限制性酶是可商購的，其反應(yīng)條件、輔因子和其它要求對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。為分析目的，典型地，1μg質(zhì)?；駾NA片段使用約2單位的酶，反應(yīng)體積為20μl緩沖液；為分離DNA片段用于構(gòu)建質(zhì)粒的目的，典型地，在較大體積中用20-250單位酶消化5-50μgDNA。對特定限制性酶的合適的緩沖液和底物由廠商提供。通常使用37℃1小時的溫育時間，但可根據(jù)供應(yīng)商的指示而變化。消化后，將反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠上電泳以分離所需片段。
裂解片段的大小分離是根據(jù)Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行。
“寡核苷酸”是指可化學(xué)合成的單鏈聚脫氧核苷酸或兩個互補(bǔ)的聚脫氧核苷酸鏈。這種合成的寡核苷酸沒有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸則不能與另一寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒有經(jīng)過脫磷酸化的片段連接。
“連接”是指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有說明，連接可以采用公知的緩沖液，在每0.5μg約等摩爾的待連接DNA片段使用10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)的條件下進(jìn)行。
除非另有說明，使用Graham，F(xiàn).and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1血清對氧磷酶的細(xì)菌表達(dá)和純化編碼血清對氧磷酶的DNA序列，ATCC#75773，首先用對應(yīng)于加工的血清對氧磷酶蛋白的5’基因序列(減去信號肽序列)和血清對氧磷酶基因3 ’端的載體序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增。與血清對氧磷酶相對應(yīng)的附加序列相應(yīng)地加到5’和3’序列上。5’寡核苷酸引物的序列為5’-TCAGGATCCAGAAATCGACTTAAAGCCTCC-3’(SEQ IDNO3)，其含有一個Bam HI限制酶位點(diǎn)，后跟從加工蛋白密碼子的假定末端氨基酸起始的血清對氧磷酶密碼序列的21個核苷酸。3’序列為5’-TCAAAGCTTTAGAGTTCACAATACAAGGC-3’(SEQ ID NO4)，含有與Hind III限制酶位點(diǎn)的互補(bǔ)序列并后跟血清對氧磷酶的21個核苷酸。限制酶位點(diǎn)與細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9上的限制酶位點(diǎn)相對應(yīng)(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE-9編碼抗生素抗性(Amp)，一個細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)(ori)，一個IPTG-可調(diào)節(jié)啟動子操縱子(P/O)，一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，一個6-His標(biāo)記物和限制酶位點(diǎn)。然后pQE-9用Bam HI和Hind III消化。擴(kuò)增的序列連入pQE-9并與編碼組氨酸標(biāo)記物和RBS的序列在一個讀框中。然后連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE(可從Stratagene Cloning Systems，11099 NorthTorrey Pines Road，LA Jolla，CA 92037得到)，操作方法按Sambrook，J et al，.MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，1989進(jìn)行。轉(zhuǎn)化子按他們在LB平板上的生長能力來鑒定，選擇對氨芐青霉素/卡那霉素有抗性的菌落。分離質(zhì)粒DNA，進(jìn)行限制分析鑒定。含所需構(gòu)建體的克隆在補(bǔ)加Amp(100μg/m1)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中生長過夜(O/N)。過夜培養(yǎng)物以1∶100到1∶250的比率進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)胞生長至光密度600(O.D.600)值在0.4到0.6之間，然后加入IPTG(“異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)至終濃度為1mM。IPTG通過使lacI抑制子失活，清除P/O來誘導(dǎo)增強(qiáng)基因表達(dá)。細(xì)胞繼續(xù)生長3到4個小時，然后離心回收細(xì)胞，細(xì)胞沉淀物溶于6摩爾鹽酸胍中。清澈后，在允許含6-His標(biāo)記物的蛋白緊密結(jié)合的情況下用鎳螯合柱層析從此溶液中純化溶解的血清對氧磷酶。Hochuli，E.et al.，J.Chromatography 411177-184(1984)。用pH5.0的6摩爾鹽酸胍從柱子中洗脫血清對氧磷酶，為了復(fù)性的需要，將洗脫液調(diào)整到含3摩爾鹽酸胍，100mM磷酸鈉，10毫摩爾還原型谷胱甘肽和2毫摩爾氧化型谷胱甘肽。在此溶液中溫育12小時后，將蛋白對10毫摩爾磷酸鈉進(jìn)行透析。
實(shí)施例2重組的血清對氧磷酶在CHO細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒血清對氧磷酶HA是由載體pcDNAI/Amp(Invitrogen)衍生而來的，此載體包含1)SV40復(fù)制起始位點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)，4)CMV啟動子，緊接著多接頭區(qū)，一個SV40內(nèi)含子和多腺苷化位點(diǎn)。將編碼整個血清對氧磷酶前體的DNA片段和融合到其框架3’端的HA標(biāo)記物克隆到載體的多接頭區(qū)，因此，重組蛋白的表達(dá)就直接在CMV啟動子的指導(dǎo)下。HA標(biāo)記物與來源于以前所描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素蛋白的一個表位相對應(yīng)(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A.Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA標(biāo)記物與我們目標(biāo)蛋白的融合可以讓我們用識別HA表位的抗體輕而易舉地鑒定重組蛋白。
質(zhì)粒的構(gòu)建策略描述如下編碼血清對氧磷酶的DNA序列，ATCC#75716用PCR的方法構(gòu)建，使用兩個引物5’引物序列為5’-CGCGGGATCCACCATGGGGGCGGCTGGTGGCTCT-3’(SEQ IDNO5)，含有一個Bam HI限制酶位點(diǎn)，后接從起始密碼子開始的血清對氧磷酶密碼序列的21個核苷酸。3’序列為5’-CGCGTCTAGACGGTTAGAGTTCACAATACAAGGC-3’(SEQ ID NO6)，包含互補(bǔ)于一個Xba I限制酶位點(diǎn)和翻譯終止密碼子的序列，和血清對氧磷酶密碼序列的最后18個核苷酸(不包括終止密碼子)。因此，PCR產(chǎn)物含有一個Bam HI位點(diǎn)，血清對氧磷酶的密碼序列，一個翻譯終止密碼子，和一個Xba I位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp用限制酶Bam HI和Xba I消化并連接。連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE(Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037有售)。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物涂于含氨芐青霉素的培養(yǎng)基平板上，挑選抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，用限制分析檢測正確片段的存在。為了重組血清對氧磷酶的表達(dá)，用DEAE-DEXTRAN方法使表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。血清對氧磷酶HA蛋白的表達(dá)用放射標(biāo)記和免疫沉淀的方法檢測(E.Harlow，D.Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。轉(zhuǎn)染后兩天，蛋白用35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時，然后收集培養(yǎng)基，用去污劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5))裂解細(xì)胞。(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))。細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基用一個HA特異性的單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀。用15％的SDS-PAGE凝膠分析沉淀的蛋白。
實(shí)施例3血清對氧磷酶在人組織中的表達(dá)模式用Northern雜交分析檢測血清對氧磷酶在人組織中的表達(dá)水平。細(xì)胞總RNA樣品用RNAzolTMB系統(tǒng)(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South Loop East，Houston，TX 77033)分離。從每個特定的人組織中分離的約10μg總RNA在1％瓊脂糖凝膠上分離并雜交到尼龍膜上。(Sambrook，F(xiàn)ritsch，and Maniatis，Molecular Cloning，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。標(biāo)記反應(yīng)用50ng DNA片段根據(jù)Strategene Prime-It kit進(jìn)行，標(biāo)記的DNA用Select-G-50柱純化(5 Prime-3 Prime，Inc.5603 Arapahoe Road，Boulder，CO 80303)。然后尼龍膜用處于0.5M NaPO4，pH 7.4和7％SDS中的1,000,000cpm/ml的放射性標(biāo)記的全長血清對氧磷酶基因在65℃雜交過夜。用0.5×SSC，0.1％SDS室溫洗滌兩次，60℃洗滌兩次后，將尼龍膜與一個增感膠片置于-70℃曝光過夜。
實(shí)施例4通過基因治療的表達(dá)通過皮膚活體解剖從患者獲得成纖維細(xì)胞，得到的組織置于組織培養(yǎng)基中并將其分割成小塊。將小的組織塊置于組織培養(yǎng)瓶的濕潤表面上，每瓶約10塊。將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)，封緊置室溫過夜。在室溫放置24小時后，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，組織塊仍固定于培養(yǎng)瓶的底部，加入新鮮培養(yǎng)基(例如，含10％FBS，青霉素和鏈霉素的Ham’s F12培養(yǎng)基)，然后37℃培養(yǎng)約一個星期。此時，加入新鮮培養(yǎng)基，此后每隔幾天換一次培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)兩星期后即出現(xiàn)單層成纖維細(xì)胞。將單層細(xì)胞用胰蛋白酶處理并轉(zhuǎn)到更大的培養(yǎng)瓶中。
一側(cè)含有莫洛尼氏鼠白血病病毒的長末端重復(fù)序列的pMV-7(Kirschmeier，P.T.et al.DNA，7219-25(1988))用EcoRI和HindIII消化，然后用牛腸磷酸酶處理，在瓊脂糖凝膠上分離線性載體并用玻璃珠純化。
編碼本發(fā)明多肽的cDNA用分別與5’和3’序列相對應(yīng)的PCR引物擴(kuò)增。5’引物含有一個EcoRI位點(diǎn)，3’引物包括一個HindIII位點(diǎn)。在T4 DNA連接酶存在的條件下，將等量的莫洛尼氏鼠白血病病毒的線性骨架和擴(kuò)增的EcoRI和HindIII片段加到一起，混合物保持在適合兩個片段連接的條件下。連接混合物用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后將細(xì)菌置于含卡那霉素的瓊脂板上以確定載體含有適當(dāng)插入的感興趣的基因。
雙向性的pA317或GP＋aml2包裝細(xì)胞在補(bǔ)加10％小牛血清(CS)，青霉素和鏈霉素的Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)培養(yǎng)基中生長到鋪平表面的密度。然后在培養(yǎng)基中加入含有本發(fā)明基因的MSV載體，這樣包裝細(xì)胞被此載體轉(zhuǎn)染?，F(xiàn)在包裝細(xì)胞即可產(chǎn)生含本發(fā)明基因的有感染性的病毒顆粒(包裝細(xì)胞此時為生產(chǎn)細(xì)胞)。
將新鮮的培養(yǎng)基加到轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)細(xì)胞中，然后從一個鋪有生產(chǎn)細(xì)胞的10cm平板中收獲培養(yǎng)基。含感染性病毒顆粒的培養(yǎng)基用一個微孔濾膜過濾以除去混在一起的生產(chǎn)細(xì)胞，然后此培養(yǎng)基用于感染成纖維細(xì)胞。從即將鋪滿的成纖維細(xì)胞平板上移去培養(yǎng)基，迅速用從生產(chǎn)細(xì)胞來的培養(yǎng)基代替。移去此培養(yǎng)基并用新鮮的培養(yǎng)基代替。如果病毒的滴度高，那么實(shí)際上所有的成纖維細(xì)胞都被感染，不需要進(jìn)行選擇。如果滴度很低，那么有必要用具有選擇性標(biāo)記，例如neo或his，的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
然后將工程化的成纖維細(xì)胞單獨(dú)或在cytodex 3微載劑珠上生長到鋪滿后注射到宿主體內(nèi)?，F(xiàn)在成纖維細(xì)胞開始生產(chǎn)蛋白產(chǎn)物。
從上述的講授中可知，本發(fā)明的各種修改和變化是可能的，因此，在所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以不同于已描述的方式實(shí)施。
序列表(1)一般信息(i)申請者HUDSON，ET AL(ii)發(fā)明名稱血清對氧磷酶(iii)序列數(shù)6(iv)聯(lián)系地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART & OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州NEW JERSEY(E)國家USA(F)郵政編碼07068(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型3.5英寸軟盤(B)歸檔日期IBMPS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)本申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日同時(C)分類(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/270，583(B)申請日1994年7月5日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號36，134(C)案號/文檔號325800-(ix)電訊信息(A)電話201-994-1700(B)電傳201-994-1744(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度1079堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CCCATGGGGC GGCTGGTGGC TGTGGGCTTG CTGGGGATCG CCCTGGCCCT CCTGGGCGAG 60AGGCTTCTGG CACTCAGAAA TCGACTTAAA GCCTCCAGAG AAGTAGAATC TGTAGACCTT120CCACACTGCC ACCTGATTAA AGGAATTGAA GCTGGCTCTG AAGATATTGA CATACTTCCC180AATGGTCTGG CTTTTTTAAG TGTGGGTCTA AAATTCCCAG GACTCCACAG CTTTGCACCA240GATAAGCCTG GAGGTATACT AATGATGGTT CTAAAAGAAG CAAAACCAAG GGGACGGGAA300TTAAGAATCA GTCGTGGGTT TGATTTGGCC TCATTCAATC CACATGGGAT CAGCACTTTC360ATAGACAACG ATGACACAGT TTATCTCTTG GTTGTAAACC ACCCAGAATT CAAGAATACA420GTGGAAATTT TTAATTTGGA AGAAGCAGAA AATTCTCTGT TGCATCTGAA AACAGTCAAA480CATGAGCTTC TTCCAAGTGT GAATGACATC ACAGCTGTTG GACCGGCACA TTTCTATGCC540ACAAATGACC ACTACTTCTC TGATCCTTTC TTAAAGTATT TAGAAACATA CTTGGAATTA600CACTGGGCAA ATGTTGTTTA CTACAGGCCA AATGAAGTTA AAGGTGGTAG CAGGAAGGAT660TTGGATTCAG CAAATGGGAT CAATATTTCA CCTGGATGGA TAAGTTTTTC TATGTTGGCT720GACATATTGG CTCATGAAAT TCATGTTTGG GGAAAACACA CTAATATGAA TTTAACTCAG780TTGAAGGTAC TTGAGCTGGA TACACTGGTG GATAATTTAT CTATTGATCC TTCCTCGGGG840GACATCTGGG TAGGCTGTCA TCCTAATGGC CAGAAGCTCT TCGTGTATGA CCCGAACAAT900CCTCCCTCGT CAGAGGTTCT CCGCATCCAG AACATTCTAT CTGAGAAGCC TACAGTGACT960ACAGTTTATG CCAACAATGG GTCTGTTCTC CAAGGAAGTT CTGTAGGCTC AGTGTATGAT 1020GGGAAGCTGC TCATAGGCAC TTTATACCAC AGAGCCTTGT ATTGTGAACT CTAAATTGT1079(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度356個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Gly Arg Leu Val Ala Val Gly Leu Leu Gly Ile Ala Leu Ala5 10 15Leu Leu Gly Glu Arg Leu Leu Ala Leu Arg Asn Arg Leu Lys Ala20 25 30Ser Arg Glu Val Glu Ser Val Asp Leu Pro His Cys His Leu Ile35 40 45Lys Gly Ile Glu Ala Gly Ser Glu Asp Ile Asp Ile Leu Pro Asn50 55 60Gly Leu Ala Phe Leu Ser Val Gly Leu Lys Phe Pro Gly Leu His65 70 75Ser Phe Ala Pro Asp Lys Pro Gly Gly Ile Leu Met Met Val Leu80 85 90Lys Glu Ala Lys Pro Arg Gly Arg Glu Leu Arg Ile Ser Arg Gly95 100 105Phe Asp Leu Ala Ser Phe Asn Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Ile110 115 120Asp Asn Asp Asp Thr Val Tyr Leu Leu Val Val Asn His Pro Glu125 130 135Phe Lys Asn Thr Val Glu Ile Phe Asn Leu Glu Glu Ala Glu Asn140 145 150Ser Leu Leu His Leu Lys Thr Val Lys His Glu Leu Leu Pro Ser155 160 165Val Asn Asp Ile Thr Ala Val Gly Pro Ala His Phe Tyr Ala Thr170 175 180Asn Asp His Tyr Phe Ser Asp Pro Phe Leu Lys Tyr Leu Glu Thr185 190 195Tyr Leu Glu Leu His Trp Ala Asn Va1 Val Tyr Tyr Arg Pro Asn200 205 210Glu Val Lys Gly Gly Ser Arg Lys Asp Leu Asp Ser Ala Asn Gly215 220 225Ile Asn Ile Ser Pro Gly Trp Ile Ser Phe Ser Met Leu Ala Asp230 235 240Ile Leu Ala His Glu Ile His Val Trp Gly Lys His Thr Asn Met245 250 255Asn Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Glu Leu Asp Thr Leu Val Asp260 265 270Asn Leu Ser Ile Asp Pro Ser Ser Gly Asp Ile Trp Val Gly Cys275 280 285His Pro Asn Gly Gln Lys Leu Phe Val Tyr Asp Pro Asn Asn Pro290 295 300Pro Ser Ser Glu Val Leu Arg Ile Gln Asn Ile Leu Ser Glu Lys305 310 315Pro Thr Val Thr Thr Val Tyr Ala Asn Asn Gly Ser Val Leu Gln320 325 330Gly Ser Ser Val Gly Ser Val Tyr Asp Gly Lys Leu Leu Ile Gly335 340 345Thr Leu Tyr His Arg Ala Leu Tyr Cys Glu Leu350 355(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型寡核苷酸TCAGGATCCA GAAATCGACT TAAAGCCTCC 30(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型寡核苷酸TCAAAGCTTT TAGAGTTCAC AATACAAGGC30(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型寡核苷酸CGCGGGATCC ACCATGGGGG CGGCTGGTGG CTCT 34(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型寡核苷酸CGCGTCTAGA CGGTTAGAGT TCACAATACA AGGC 3權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，包括(a)編碼包括SEQ ID NO2所示的1-356位氨基酸的多肽的多核苷酸；(b)能與(a)的多核苷酸雜交并至少有70％同一性的多核苷酸；和(c)(a)，(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸為DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸為RNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸為基因組DNA。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO2的1-356位氨基酸的多肽。
6.一種分離的多核苷酸，包括選自如下一組的成員(a)編碼具有由ATCC保藏號75773所含的DNA表達(dá)的氨基酸序列的成熟多肽的多核苷酸；(b)編碼具有由ATCC保藏號75773所含的DNA表達(dá)的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(c)能與(a)和(b)的多核苷酸雜交并至少有70％同一性的多核苷酸；和(d)(a)，(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO1所示的1-1079位核苷酸的序列。
8.權(quán)利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO1所示的4-1079位核苷酸的序列。
9.含有權(quán)利要求2的DNA的載體。
10.用權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
11.生產(chǎn)多肽的方法，包括從權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞表達(dá)由所說DNA編碼的多肽。
12.生產(chǎn)能夠表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括由用權(quán)利要求9的載體遺傳工程化細(xì)胞。
13.包括選自如下一組成員的多肽(i)具有SEQ ID NO2的推測的氨基酸序列的多肽和所說多肽的片段，類似物和衍生物；和(ii)由ATCC保藏號75773的cDNA編碼的多肽和所說多肽的片段，類似物和衍生物。
14.權(quán)利要求13的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO2的1-356位氨基酸。
15.治療需要血清對氧磷酶的患者的方法，包括給患者以治療有效劑量的權(quán)利要求13的多肽。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說的多肽的治療有效劑量是以給患者提供編碼所說多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所說多肽的方式給藥。
17.診斷與權(quán)利要求13的多肽的低水平表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，包括鑒定編碼所說多肽的核酸序列中的突變。
18.一種診斷方法，包括分析來自宿主的樣品中的權(quán)利要求13的多肽的存在。
19.鑒定作為權(quán)利要求13的多肽的激動劑的化合物的方法，包括將多肽的底物與待篩選的化合物接觸；和測定此化合物是否水解此底物。
20.抗權(quán)利要求13的多肽的抗體。
全文摘要
本發(fā)明披露了人血清對氧磷酶和編碼此血清對氧磷酶的DNA(RNA)。還提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)此多肽的步驟。此多肽的用途包括用作有機(jī)磷中毒的解毒劑和防止神經(jīng)元細(xì)胞死亡。本發(fā)明還披露了鑒定編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列中的突變和檢測本發(fā)明的多肽水平改變的診斷分析方法。
文檔編號C07K16/40GK1151760SQ95193978
公開日1997年6月11日 申請日期1995年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月5日
發(fā)明者彼德·L·赫德森, 何為無, 斯蒂文·M·魯賓 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司