本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，涉及視網(wǎng)膜細胞方面，具體涉及一種視網(wǎng)膜節(jié)細胞特異性表面蛋白的篩選方法。
背景技術：
：：視覺是機體最重要的感覺功能，視覺系統(tǒng)疾病分為可逆性(如：白內(nèi)障)和不可逆性(如：青光眼)兩大類。調(diào)查結(jié)果表明，截至2010年，全世界大約有6050萬青光眼患者，并且這種疾病的發(fā)病呈上升態(tài)勢，預計到2020年大約會升至7960萬。青光眼主要累及視網(wǎng)膜節(jié)細胞，導致視神經(jīng)受損，使得視覺傳導通路障礙，視覺信號不能正常傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。青光眼的主要致病因素為眼壓升高，但青光眼發(fā)病早期幾乎沒有癥狀，且往往在臨床診斷之前已經(jīng)發(fā)生了嚴重的視力喪失。目前治療青光眼的主要手段就是降低眼內(nèi)壓，但只能減緩青光眼的病程進展，并不能完全阻止病情的發(fā)展，因此，基于干細胞的節(jié)細胞移植療法給青光眼的逆轉(zhuǎn)和治愈帶來了新的希望。目前的研究結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞、視網(wǎng)膜前體細胞以及müller細胞移植后可以與宿主的視網(wǎng)膜節(jié)細胞發(fā)生整合，甚至有些移植的細胞可能表達一些節(jié)細胞特異性蛋白。而誘導的多能干細胞來源的節(jié)細胞樣細胞則不能和宿主的視網(wǎng)膜節(jié)細胞發(fā)生整合。另外，即使移植的細胞可以發(fā)生整合，但沒有發(fā)現(xiàn)模型動物表現(xiàn)出視覺功能的改善，可能是移植的細胞不能地很好與視覺中樞系統(tǒng)建立突觸聯(lián)系有關。目前，細胞替代療法治療神經(jīng)元退行性疾病首要解決的問題是細胞純度的問題。其原因顯而易見，首先，將誘導分化的細胞在體外進行藥物篩選或功能鑒定時，混雜的其它細胞將會影響結(jié)果的可靠性；其次，如果將混雜的細胞移植到模型動物體內(nèi)，將會產(chǎn)生異常增生甚至致瘤的風險。雖然目前已經(jīng)有很多研究致力于提高節(jié)細胞的誘導分化率，例如：將math5轉(zhuǎn)染到干細胞，然后通過facs篩選來獲得純化的節(jié)細胞，然而，這些方法存在致命缺陷，即：將報告載體轉(zhuǎn)染到干細胞內(nèi)會導致干細胞基因組的改變，從而限制了其臨床應用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種視網(wǎng)膜節(jié)細胞特異性表面蛋白的篩選方法，從而 找到節(jié)細胞前體細胞的特異性表面蛋白，用于人胚胎干細胞/人多能干細胞來源的視網(wǎng)膜節(jié)細胞前體細胞的純化，從而用于臨床利用細胞移植替代療法治療青光眼。本發(fā)明的具體技術方案如下：一種視網(wǎng)膜節(jié)細胞特異性表面蛋白的篩選方法，包括如下步驟：(1)將人多能干細胞誘導分化至第6周的視網(wǎng)膜細胞球在含有ⅱ型膠原酶的hanks溶液中消化過夜，得到細胞懸液；(2)第二天，在細胞懸液中加入等體積的含有ⅱ型膠原酶、?；撬帷⒁叶茧p(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的hanks溶液進一步消化，獲得單細胞；(3)應用bd公司的細胞表面蛋白篩選試劑盒對消化的單細胞進行篩選、篩選出cd抗體，然后對cd抗體進行篩選、確定節(jié)細胞特異性表面蛋白。如果細胞球過硬，不容易消化，為了充分分散細胞球，將步驟(2)得到的單細胞用0.25％胰酶/edta進一步消化，然后進行步驟(3)的操作。步驟(1)中，hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml。步驟(1)中，所述消化是在25℃的條件下進行消化。步驟(2)中，hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml、牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度為1mg/ml，?；撬岬奈镔|(zhì)的量濃度為10mm/ml、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸的物質(zhì)的量濃度為0.1mm/ml。所述步驟(3)中具體篩選方法如下：a、對單細胞表面蛋白進行染色，然后用lsrii流式細胞儀進行分析，單細胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的pbs溶液中進行；b、選用bd公司的facsariatmii細胞分選儀對106/ml的單細胞進行分選，分選過程中單細胞重懸液為含有6％胎牛血清的pbs溶液；c、選用mitenyimacs磁珠分選系統(tǒng)進行磁珠分選、分選出cd抗體，選用bd公司針對lsrii的高通量樣品分析對于cd抗體的高通量細胞流式分析；d、所得到的數(shù)據(jù)應用流式分析軟件treestar進行分析，確定節(jié)細胞特異性表面蛋白。采用本發(fā)明所述的視網(wǎng)膜節(jié)細胞特異性表面蛋白的篩選方法，對已知的370種cd抗體對人胚胎干細胞來源的視網(wǎng)膜節(jié)細胞前體細胞進行篩選；通過篩選得到一種cd抗原特異性表達在人胚胎干細胞以及人多能干細胞來源的視網(wǎng)膜節(jié)細胞前體細胞的細胞膜表面。利用facs技術對這種細胞表面蛋白進行篩選，可 以將誘導的人胚胎干細胞或人多能干細胞來源的節(jié)細胞前體細胞進行純化。將這種純化的節(jié)細胞進行貼壁培養(yǎng)，可以觀察到有長的軸突產(chǎn)生，另外，將這種節(jié)細胞與小鼠腦片共培養(yǎng)，節(jié)細胞的長軸突可以與腦片形成突觸聯(lián)系。將純化的節(jié)細胞移植到青光眼動物模型的玻璃體腔，經(jīng)過長時間的觀察，可以發(fā)現(xiàn)動物視網(wǎng)膜光感功能得到改善。利用本發(fā)明所述方法篩選出的其中一種cd抗原特異性表達在人胚胎干細胞以及人多能干細胞來源的視網(wǎng)膜節(jié)細胞前體細胞的細胞膜表面，這將提供一種簡單的方法用于人多能干細胞來源的視網(wǎng)膜節(jié)細胞前體細胞的純化。通過表面蛋白篩選獲得的純化節(jié)細胞，可以避免轉(zhuǎn)基因或者應用多種小分子化合物為誘導劑所帶來的潛在危險。這一關鍵科學問題的解決，將加快干細胞向臨床轉(zhuǎn)化的過程，符合醫(yī)學研究的需要，為人類青光眼的細胞替代治療奠定了基礎。具體實施方式本發(fā)明所述的“人胚胎干細胞誘導分化”采用申請?zhí)枮?01210301765.x，名稱為“一種誘導人多能干細胞分化為視網(wǎng)膜前體細胞的方法”中提到的方法。本發(fā)明其他未提及部分均為現(xiàn)有技術。一種視網(wǎng)膜節(jié)細胞特異性表面蛋白的篩選方法，包括如下步驟：(1)將人多能干細胞誘導分化至第6周的視網(wǎng)膜細胞球在含有ⅱ型膠原酶的hanks溶液中于25℃的條件下消化過夜，消化時在搖床輕搖，得到細胞懸液；hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml；(2)第二天，在細胞懸液中加入等體積的含有ⅱ型膠原酶、?；撬?、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的hanks溶液進一步消化，輕輕吹打以分散細胞，細胞分散后，1000r/m離心5min，篩網(wǎng)過濾后備用；如果細胞球過硬，不容易消化，則需要用0.25％胰酶/edta進一步消化，以充分分散細胞球，獲得單細胞；hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml、牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度為1mg/ml，?；撬岬奈镔|(zhì)的量濃度為10mm/ml、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸的物質(zhì)的量濃度為0.1mm/ml；(3)應用bd公司的細胞表面蛋白篩選試劑盒對消化的單細胞進行篩選、篩選出cd抗體，然后對cd抗體進行篩選、確定節(jié)細胞特異性表面蛋白。步驟(3)中具體篩選方法如下：a、對單細胞表面蛋白進行染色，然后用 lsrii流式細胞儀進行分析，單細胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的pbs溶液中進行；b、選用bd公司的facsariatmii細胞分選儀對106/ml的單細胞進行分選，分選過程中單細胞重懸液為含有6％胎牛血清的pbs溶液；c、選用mitenyimacs磁珠分選系統(tǒng)進行磁珠分選、分選出cd抗體，選用bd公司針對lsrii的高通量樣品分析對于cd抗體的高通量細胞流式分析；d、所得到的數(shù)據(jù)應用流式分析軟件treestar進行分析，確定節(jié)細胞特異性表面蛋白。人多能干細胞的培養(yǎng)和誘導分化ⅰ.人多能干細胞的培養(yǎng)：將人多能干細胞接種在鋪有0.65×105/mlmefs的六孔板內(nèi)；干細胞培液內(nèi)含：dmem/f12(1：1)、20％血清替代物、1mml-谷氨酰胺、1％非必須氨基酸(memnon－essentialaminoacids)、0.1mmβ-巰基乙醇、4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)；每5至7天傳代一次，傳代時將形態(tài)上已明顯分化的細胞刮除。ⅱ.人多能干細胞的誘導：dispase酶(1mg/ml)消化人多能干細胞約2min后，吸除dispase酶，用干細胞培液(1ml/孔)漂洗一次，再次加入干細胞培液，用吸管將干細胞克隆吹下成小片狀移入離心管中，800r/min離心1min后，用干細胞培液重懸細胞，將細胞重懸液移入非粘附的培養(yǎng)皿中，用干細胞培液培養(yǎng)4天，隔天換液，得到細胞球。將細胞球移入神經(jīng)誘導培養(yǎng)基中(hnm)，hnm包含：dmem/f12，1％n2復合物，1％非必須氨基酸(memnon－essentialaminoacids)，2ug/ml肝素(heparin)，1％l-谷氨酰胺，2天后，將細胞球移入粘附性培養(yǎng)皿中，為了促使細胞球貼壁，可以在hnm中加入10％的胎牛血清(fbs)，12h后更換新鮮的不含fbs的hnm。幾天后，貼壁的細胞球會形成許多神經(jīng)管樣的結(jié)構(gòu)，大約在貼壁的第9天，將貼壁后形成的神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)吹下，移入視網(wǎng)膜誘導培養(yǎng)基中(rdm),rdm包含：dmem/f12、15％血清替代物、1％l-谷氨酰胺、1％非必須氨基酸(neaa)、10mm煙酰胺(nicotinamide,nic)。將形成的神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)，每2～3天換液。ⅲ.報告細胞系的建立：利用talen的同源重組技術，將編碼gfp的序列插入到h9人胚胎干細胞系的brn3基因位點，從而建立報告細胞系。人胚胎以及成年人視網(wǎng)膜組織的收集研究用經(jīng)藥物流產(chǎn)的4周至12周人胚胎共18例(table2.2)。胎齡的計算 是根據(jù)當事人末次月經(jīng)的日期減去2周的時間，即受孕時作為第0天。成年人視網(wǎng)膜取自捐獻角膜后的眼球組織。人組織的獲取及相關研究經(jīng)相關倫理委員會批準，并在捐贈者簽署知情同意書的情況下進行。細胞流式及細胞分選將誘導分化至第6周的視網(wǎng)膜細胞球在含有ⅱ型膠原酶(1mg/ml；worthington)的hanks溶液(nacl:136mm,nahco3:4.16mm,napo4:0.34mm,kcl:5.36mm,kh2po4:0.44mm,dextrose:5.55mm,hepes:5mm)中25℃消化過夜，消化時在搖床輕搖。第二天，在細胞懸液中加入等量的含有ⅱ型膠原酶(1mg/ml；worthington)、?；撬?0mm、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸0.1mm、牛血清白蛋白1mg/ml的hanks溶液進一步消化，輕輕吹打以分散細胞。細胞分散后，1000r/m離心5min，篩網(wǎng)過濾后備用。如果細胞球過硬，不容易消化，則需要用0.25％胰酶/edta進一步消化，以充分分散細胞球，獲得單細胞。應用bd公司的細胞表面蛋白篩選試劑盒，對消化的單細胞進行分析。單細胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％saponin(sigma)的pbs溶液中進行，細胞染色后用lsrii流式細胞儀(bd公司)進行分析。對于細胞分選，我們選用facsariatmii(bd公司)細胞分選儀(sickkids-uhnflowcytometryfacility)對106/ml的細胞進行分選，細胞重懸液為含有6％胎牛血清的pbs溶液。為了防止細胞分選過程中由于壓力和剪切力所導致的細胞死亡，我們選用100um的吹管進行分選。另外，我們選用mitenyimacs磁珠分選系統(tǒng)進行磁珠分選，分選出cd抗體；操作步驟和分選條件按照說明書進行。對于cd抗體的高通量細胞流式分析，我們選用bd公司針對lsrii的高通量樣品分析(high-throughputsampler,hts)進行操作，操作步驟參照說明書。所有數(shù)據(jù)應用流式分析軟件treestar進行分析。免疫染色免疫熒光染色的步驟按照常規(guī)進行，對于細胞球切片或組織切片，過程如下：取出-80℃冰箱內(nèi)保存的冰凍切片，室溫復溫30分鐘。0.01mpbs洗3次，每次10分鐘。含有0.25％tritonx-100和10％驢血清的0.01mpbs孵育1小時。加一抗，濕盒內(nèi)4℃冰箱孵育過夜。0.01mpbs洗3次，每次10分鐘。加二抗，避光室溫孵育1小時。0.01mpbs洗3次，每次10分鐘。用抗熒光淬滅的封片液進行封片，避 光晾干后，于熒光顯微鏡下進行觀察和拍照。對于細胞爬片，所不同的是前面的固定過程，即：4％多聚甲醛固定30min,0.01mpbs洗3次，每次10分鐘，-20℃甲醇固定10min,0.01mpbs洗3次，每次10分鐘，后續(xù)封閉以及抗體孵育的步驟同前。如果染色的是細胞膜抗原，則封閉時不加tritonx-100。rt-qpcr用rna提取試劑盒(ambion)進行細胞rna的抽提。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(invitrogen)對50ng～1ug的rna進行逆轉(zhuǎn)錄。qpcr使用quantifastsybrgreenpcr試劑盒(qiagen)。表達量以管家基因tata盒子(tbp)為標準參照，除此之外，基因組dna作為dna的參考標準?；蚪Mdna的靶基因拷貝數(shù)按照如下計算方式：人基因組大小2.7×109bp，對應于6.022×1023個單基因拷貝，1ug的基因組dna對應于3.4×105個單基因拷貝。rt-qpcr圖的y軸代表被tbp拷貝數(shù)分隔開的目的基因的拷貝數(shù)，因此是一個隨機的獨立單位，可用于不同實驗組之間的對比。當前第1頁12當前第1頁12