本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種表達(dá)豬流行性腹瀉病毒s1蛋白的重組偽狂犬病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉病是一種流行性疾病。據(jù)農(nóng)業(yè)部流行病學(xué)中心統(tǒng)計(jì)，最近幾年豬流行性腹瀉(ped)病引起豬的死亡數(shù)已占據(jù)現(xiàn)有豬病的首位。調(diào)查結(jié)果表明，發(fā)病場(chǎng)的哺乳仔豬的發(fā)病率在10～100％，病死率在40～92.58％之間。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)因該病的死亡率約占總存欄數(shù)的3～5％給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。

pedv屬于尼多病毒目冠狀病毒科、冠狀病毒屬。病原研究的初步結(jié)果表明，目前中國(guó)從本次流行中腹瀉病豬檢測(cè)到的pedv大多數(shù)為基因2型，與泰國(guó)、菲律賓、越南等地2009－2010年所流行的毒株非常相似。s基因序列分析表明，2010年以前pedv毒株s基因序列與英國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株cv777(af353511)同源性很高，達(dá)到98％，2010年后，對(duì)9個(gè)豬場(chǎng)27個(gè)s基因序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果只有3個(gè)豬場(chǎng)8個(gè)s基因序列與cv777同源，7個(gè)豬場(chǎng)19個(gè)s基因序列與pedv韓國(guó)分離株(dq862099.1)同源，與cv777的同源性?xún)H有85％左右，存在基因的插入和缺失，pedv基因序列的改變可能導(dǎo)致了其流行規(guī)律的變化。

s蛋白位于病毒表面，是pedv最大的結(jié)構(gòu)蛋白，人為的劃分為s1和s2亞基，其中s1亞基主要是識(shí)別細(xì)胞膜上特異受體并與之結(jié)合，是病毒中最早與細(xì)胞接觸的部分，且s1中含有兩個(gè)中和抗原表位(coe和s1d)和多個(gè)線性表位，s2主要是膜融合區(qū)。

因此，針對(duì)豬流行性腹瀉病毒s1構(gòu)建一種新的重組病毒，對(duì)于豬流行性腹瀉病的治療具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種重組偽狂犬病毒。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種重組偽狂犬病毒的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種重組偽狂犬病毒的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種重組偽狂犬病毒，所述重組偽狂犬病毒的基因組插入有優(yōu)化后的豬流行性腹瀉病毒s1基因，所述優(yōu)化后的豬流行性腹瀉病毒s1基因的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示。

本發(fā)明中所述優(yōu)化后的豬流行性腹瀉病毒s1基因是在豬流行性腹瀉病毒s1基因(pedv-s1)5’端加入bamhi酶切位點(diǎn)ggattc和kozak序列g(shù)ccacc，3’端加入ecori酶切位點(diǎn)gaattc和flag標(biāo)簽gattacaaggatgacgacgataag得到的。

優(yōu)選的，所述重組偽狂犬病毒的基因組插入有優(yōu)化后的豬流行性腹瀉病毒s1基因的表達(dá)框pcmv-s1-bgh-pa；其中，s1表示優(yōu)化后的豬流行性腹瀉病毒s1基因，pcmv表示啟動(dòng)子cmv，bgh-pa表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾。

進(jìn)一步，所述重組偽狂犬病毒的基因中標(biāo)記gfp的cmv啟動(dòng)子替換為ef1啟動(dòng)子，且gi和ge基因替換為優(yōu)化后的豬流行性腹瀉病毒s1基因的表達(dá)框pcmv-s1-bgh-pa。

一種構(gòu)建表達(dá)豬流行性腹瀉病毒s1蛋白重組偽狂犬病毒的方法，包括以下步驟：

(1)將pprv-baczj株中標(biāo)記gfp的cmv啟動(dòng)子替換成ef1啟動(dòng)子，得到pprv-ef1；

(2)將pprv-ef1中的gi和ge基因替換成優(yōu)化后的豬流行性腹瀉病毒s1基因的表達(dá)框pcmv-s1-bgh-pa，得到pprv-s1-δgie；

(3)將pprv-s1-δgie轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞中，拯救得到表達(dá)豬流行性腹瀉病毒s1蛋白重組偽狂犬病毒，命名為rprv-s1-δgie。

在本發(fā)明中，所述標(biāo)記gfp的cmv啟動(dòng)子替換成ef1啟動(dòng)子的步驟為：

(1)以pep-ef1-in質(zhì)粒為模板，利用核苷酸序列如序列表seqidno.8和seqidno.9所示的引物擴(kuò)增得到目的片段；

(2)將目的片段轉(zhuǎn)入pprv電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，得到pprv-ef1-kan；

(3)刪除pprv-ef1-kan中kan基因，得到pprv-ef1。

所述將pprv-ef1的gi和ge基因替換成優(yōu)化后的豬流行性腹瀉病毒s1基因表達(dá)框pcmv-s1-bgh-pa的步驟為：

(1)將優(yōu)化后的豬流行性腹瀉病毒s1基因，插入到pep-bgh-end中，得到pep-s1-end；

(2)以pep-s1-end為模板，利用核苷酸序列seqidno.6和seqidno.7所示的引物擴(kuò)增得到目的片段；

(3)將目的片段轉(zhuǎn)入pprv-ef1/gs1783電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，得到pprv-s1-δgie-kan；

(4)刪除pprv-s1-δgie-kan中kan基因，得到pprv-s1-δgie。

本發(fā)明還提供了所述重組偽狂犬病毒在制備動(dòng)物疫苗中的應(yīng)用。

將本發(fā)明重組病毒免疫小鼠，能夠檢測(cè)出抗pedv和抗prv的抗體，為研制pedv-prv重組活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明重組偽狂犬病毒中偽狂犬病毒是目前廣泛流行的變異株偽狂犬病毒，表達(dá)的s1蛋白也是以豬流行性腹瀉病毒流行株s1基因進(jìn)行優(yōu)化的。因此免疫重組偽狂犬病毒后既能產(chǎn)生針對(duì)變異株偽狂犬病毒抗體，又能產(chǎn)生針對(duì)流行株豬流行性腹瀉病毒s1蛋白抗體，為豬偽狂犬病毒-豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1示出真核表達(dá)質(zhì)粒pep-bgh-end的圖譜。

圖2示出prv-baczjbamhⅰ酶切鑒定結(jié)果；m、marker，1：prv-baczjbamhⅰ酶切結(jié)果。

圖3重組質(zhì)粒pep-s1-end的pcr驗(yàn)證；m、2000bpmarker，1-3：重組質(zhì)粒樣品pcr產(chǎn)物，4：陰性對(duì)照。

圖4示出細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果；a、pep-s1-end轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞免疫熒光結(jié)果，b、陰性對(duì)照pep-end空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞免疫熒光結(jié)果。

圖5示出質(zhì)粒pep-ef1-in的圖譜。

圖6示出pprv-s1-δgiebamhⅰ酶切鑒定結(jié)果；其中，1-5pprv-s1-δgiebamh酶切結(jié)果，6對(duì)照，m:marker。

圖7示出westernblot檢測(cè)pedvs蛋白的表達(dá)；1-3:rprv-s1-δgie表達(dá)的蛋白，m:marker。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

1、試驗(yàn)材料和試劑來(lái)源

pedv流行株(zj131016)分離自浙江省某豬場(chǎng)；新型prv(浙江株)細(xì)菌人工染色體感染性克隆(prv-baczj)由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所構(gòu)建并保存；工程菌gs1783、真核表達(dá)質(zhì)粒pep-bgh-end(質(zhì)粒圖譜如圖1所示)、vero細(xì)胞和bhk-21細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

其中，新型prv(浙江株)細(xì)菌人工染色體感染性克隆(prv-baczj)的構(gòu)建方法：將prv浙江分離株prv-zj的ul22和ul24基因片段作為同源臂，先后克隆到pmd18t載體，構(gòu)建pul22-24；再將攜帶bac元件和綠色熒光(gfp)標(biāo)記的minif片段插入到pul22-24，構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體pul22-gfp-24-ha2；將prv基因組與轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，獲得攜帶bac載體的prv重組病毒prv-ha2，提取重組病毒prv-ha2基因組，電轉(zhuǎn)gs1783感受態(tài)細(xì)胞，涂含50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的lb瓊脂平板，32℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑單克隆菌落于含50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的lb液體培養(yǎng)基，32℃過(guò)夜培養(yǎng)，提取bac質(zhì)粒，bamhi酶切鑒定如圖2所示，出現(xiàn)ladder狀條帶即為prv-baczj陽(yáng)性克隆。

磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于promega公司；l-阿拉伯糖、氯霉素(cap)、卡那霉素(kan)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；dmem細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自gibco公司(美國(guó))；胰酶購(gòu)自difico公司(美國(guó))；胎牛血清購(gòu)自四季青生物工程公司；3flag購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；酚：氯仿、異丙醇、rnasea、各種dna限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程有限公司；磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于promega公司；甲基纖維素購(gòu)自gibco公司。

2、引物設(shè)計(jì)與合成

引物pedvs1-p1/pedvs1-p2用于s1與真核表達(dá)載體pep-bgh-end載體連接后的驗(yàn)證；引物s1f/s1r用于驗(yàn)證s1基因與pprv重組后的s1序列；引物prv-in-ie-f/prv-in-ie-r用于s1基因表達(dá)框pcmv-s1-bgh-pa替換ge和gi基因；引物ef1-epf/ef1-epr用于prv-baczj株的pcmv啟動(dòng)子更換，均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1試驗(yàn)用引物和編號(hào)

實(shí)施例1pedvs1基因的優(yōu)化

pedvs1基因密碼子由南京金斯瑞生物科技股份有限公司優(yōu)化并合成，克隆到puc57質(zhì)粒載體中。優(yōu)化的pedv-s1(2325bp)基因5’端加入bamhi酶切位點(diǎn)ggattc和kozak序列g(shù)ccacc，3’端加入ecori酶切位點(diǎn)gaattc和flag標(biāo)簽gattacaaggatgacgacgataag。優(yōu)化后的pedv-s1基因的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示。

實(shí)施例2驗(yàn)證s1蛋白的表達(dá)

1、真核表達(dá)質(zhì)粒pep-s1-end的構(gòu)建

1.1重組質(zhì)粒puc57-s1和真核表達(dá)載體酶切

將重組質(zhì)粒puc57-s1和真核表達(dá)載體pep-bgh-end分別用bamhi、ecori雙酶切，酶切體系如表2所示。

表2酶切體系

37℃水浴酶切5h，將酶切產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析酶切效果，然后分別將目的片段用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.2表達(dá)載體與目的基因連接

以t4dnaligase連接酶切純化后的目的基因和表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pep-s1-end，連接反應(yīng)體系如下：

混勻后，16℃連接過(guò)夜。

1.3連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

(1)將10μl的連接產(chǎn)物加入到100μltranse10感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置25min；

(2)體系在42℃水浴熱擊90s，迅速冰浴2min；

(3)加入700μl的lb液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm震蕩培養(yǎng)1h；

(4)菌液5000rpm離心3min,棄去600μl上清，剩余菌液重懸菌體；

(5)涂布含50μg/ml氨芐的lb平板，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

1.4重組菌的鑒定

用酒精燈燒過(guò)的無(wú)菌接種環(huán)，隨機(jī)挑選過(guò)夜培養(yǎng)平板上的單個(gè)菌落，置于2mlamp抗性的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

將培養(yǎng)的菌液各取0.5μl作為模板，引物pedvs1-p1/pedvs1-p2(其核苷酸序列seqidno.2和seqidno.3所示)對(duì)s1進(jìn)行菌液pcr鑒定。體系如下：

擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4min；94℃變性2min，60℃退火15s，72℃延伸1min30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃總延伸10min。

pcr產(chǎn)物用濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀觀測(cè)結(jié)果并拍照記錄，結(jié)果如圖3。將pcr產(chǎn)物大小正確的克隆送到杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pep-s1-end。

2、真核質(zhì)粒的體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

取測(cè)序正確的陽(yáng)性菌液去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒(購(gòu)自天根公司)，具體操作步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

以脂質(zhì)體3000作為轉(zhuǎn)染試劑將真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至vero細(xì)胞，具體操作步驟為：將vero細(xì)胞傳于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至細(xì)胞瓶底面積70％～90％時(shí)即可轉(zhuǎn)染，步驟如下：

1)在125μlopti-mem培養(yǎng)基中加入4μl3000試劑，充分混勻；

2)使用125μlopti-mem培養(yǎng)基稀釋4μgpep-s1-end和pep-s2-end質(zhì)粒，制備dna預(yù)混液，然后加入4μlp3000試劑，充分混勻；

3)將1、2兩管混勻，室溫靜置5min；

4)吸盡6孔板中培養(yǎng)基，每孔加入750μlopti-mem培養(yǎng)基；

5)將dna-脂質(zhì)體復(fù)合物加至細(xì)胞中，每孔250μl，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，在37℃、5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，每孔加1ml含20％血清的dmem培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平。

3、間接免疫熒光法檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞棄上清，pbst溶液將細(xì)胞板洗兩次；用冷甲醇和丙酮按1∶1混合，室溫固定15min；再用pbst洗兩次，每次5min，隨后用pbst透膜15min；用稀釋2000倍抗flag標(biāo)簽抗體的一抗，37℃作用1h；pbst洗3次，每次5min；用伊文思藍(lán)稀釋100倍的山羊抗鼠fitc異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗體作為二抗，37℃溫育1h后；pbst洗3次，每次5min。結(jié)果如圖4所示，在熒光顯微鏡下可以看到pep-s1-end表達(dá)綠色熒光蛋白，說(shuō)明重組質(zhì)?？稍趘ero細(xì)胞中成功瞬時(shí)表達(dá)s1蛋白。

實(shí)施例3表達(dá)pedvs1的重組prv的構(gòu)建

1、prv-baczj株的pcmv啟動(dòng)子更換

1.1pep-ef1-in質(zhì)粒的制備

取prv-baczj菌種在kan抗性的平板上劃線，37℃培養(yǎng)18h，以獲得其純培養(yǎng)物。從純培養(yǎng)物中挑取單菌落，接種于3ml含kan抗性的lb培養(yǎng)液中，37℃220r/min震蕩培養(yǎng)16h后提取pep-ef1-in質(zhì)粒(質(zhì)粒圖譜如圖5所示)。

1.2pcr擴(kuò)增帶有i-scei-kan和ef1的同源重組序列

以提取的pep-ef1-in質(zhì)粒為模板，用引物對(duì)ef1-epf/ef1-epr(其核苷酸序列如序列表seqidno.8和seqidno.9所示)擴(kuò)增含有i-scei-kan和ef1的dna片段i-scei-kan-ef1。

pcr的反應(yīng)體系(總體積25μl)為：5×primestarbuffer5μl，dntp(2.5mm)2μl，質(zhì)粒dna0.1μl，ef1-epf(10um)1μl，ef1-epr(10um)1μl，primestarhsdnapolymerase(2.5u/μl)0.25μl，ddh2o15.65μl，pcr的反應(yīng)條件如下：95℃5min；94℃45s，58℃45s，72℃2min30ms，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

將pcr產(chǎn)物按照試劑盒回收說(shuō)明書(shū)操作步驟回收。

1.3pprv電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備

取保存的菌種prv-baczj，在含有氯霉素抗性(cap)的lb平板上劃線，32℃培養(yǎng)20h后，從平板上挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種于2ml含cap抗性的lb液體培養(yǎng)基中，32℃震蕩培養(yǎng)20h。取2ml培養(yǎng)好的菌液接種于100ml在32℃預(yù)熱的含cap抗性的lb液體培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)至培養(yǎng)物的od600nm值達(dá)到0.6時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到42℃水浴搖床中以220r/min振蕩培養(yǎng)15min，震蕩完畢后立刻將培養(yǎng)物置于冰上冰浴20min。然后將菌液分裝到4個(gè)滅菌預(yù)冷的50ml離心管中，以4℃4500r/min離心5min，棄上清，用滅菌預(yù)冷的10％的甘油重懸沉淀，12,000r/min4℃離心5min，棄上清，洗滌3次，最后1％菌液體積的預(yù)冷的10％的甘油將沉淀重懸，混勻后分裝至1.5ml的滅菌的ep管中，50μl/管，用于電轉(zhuǎn)化。

1.4i-scei-kan-ef1替換pcmv序列

取100ng純化的i-scei-kan-ef1dna片段，加入新鮮制備的pprv電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，充分混勻后，將此混合物立即轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯(內(nèi)部間隔為0.1cm)中，冰上靜置30min后，在1.7kv、25μf，200ω的條件下電擊3.7ms，電擊完成后在無(wú)菌條件下向電轉(zhuǎn)杯中加入1ml無(wú)抗lb培養(yǎng)基重懸菌體，將電轉(zhuǎn)后菌液轉(zhuǎn)至1.5ml滅菌的ep管中，32℃振蕩培養(yǎng)90min后，取150μl菌液涂布于含kan和cap雙抗性的lb平板上，剩余的菌液低速離心后用100μl無(wú)抗lb液體培養(yǎng)基重懸后，也涂布于含kan和cap雙抗性的lb平板上，在32℃溫箱中培養(yǎng)24h。待菌落長(zhǎng)出后，隨機(jī)挑取多個(gè)單菌落分別接種于3ml含kan、cap雙抗性的lb液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ酶切鑒定，最終獲得pprv-ef1-kan突變體。

酶切體系(25μl)為：10×kbuffer3μl，bacdna10μl，bamhⅰ1μl，ddh2o16μl，30℃水浴中作用3h，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離酶切結(jié)果，便于下一步分析。將該菌保存，并純培養(yǎng)。

1.5pprv-ef1-kan突變體kan基因的刪除

挑取pprv-ef1-kan突變體單菌落，置于含34μg/ml氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜后，取100μl新鮮的菌液接入1ml預(yù)熱的含有氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)3h后加入1ml預(yù)熱的含有34μg/ml氯霉素和1％阿拉伯糖的lb液體培養(yǎng)基，32℃振蕩培養(yǎng)1h后轉(zhuǎn)入42℃水浴搖床以220r/min繼續(xù)培養(yǎng)20min，最后將其移至32℃再振蕩培養(yǎng)4h。將菌液稀釋10⁴倍后分別取150μl稀釋的菌液涂布于含有34μg/ml氯霉素和1％阿拉伯糖的lb平板上，32℃培養(yǎng)36-48h。待菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落同時(shí)點(diǎn)種于含氯霉素的lb平板上和含氯霉素和卡那霉素雙抗性的lb平板上，32℃溫箱中培養(yǎng)24h-48h。挑取在氯霉素抗性lb平板上生長(zhǎng)而在含氯霉素和卡那霉素雙抗性的lb平板上不生長(zhǎng)的單菌落，接種于3ml含氯霉素的液體lb培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)16h后提取質(zhì)粒，用限制性核酸內(nèi)切酶bamhⅰ進(jìn)行單酶切鑒定，篩選獲得pprv-ef1突變體。

2、pprv-s1-δgie突變體的構(gòu)建

2.1pcr擴(kuò)增帶有i-scei-kan和s1的同源重組序列

以提取的pep-s1-end質(zhì)粒為模板，用引物對(duì)prv-in-ie-f、prv-in-ie-r(其核苷酸序列seqidno.6和seqidno.7所示)擴(kuò)增含有i-scei-kan和s1的dna片段i-scei-kan-s1，即pedvs1表達(dá)框(pcmv-s1-bgh-pa)。

pcr的反應(yīng)體系(總體積25μl)為：2×primestartmgcbuffer12.5μl，dntp(2.5mm)2μl，質(zhì)粒dna1μl，prv-in-ie-f(10um)0.1μl，prv-in-ie-r(10um)0.1μl，primestarhsdnapolymerase(2.5u/μl)0.25μl，ddh2o9.05μl。pcr的反應(yīng)條件如下：95℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃4min30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

用tiangelmidipurificationkit試劑盒對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化。

2.2pcr產(chǎn)物模板質(zhì)粒的去除

用甲基化酶dpnⅰ選擇性降解pcr產(chǎn)物中的質(zhì)粒模板，反應(yīng)體系如下：

混勻后，置于37℃反應(yīng)4h。用tiangelmidipurificationkit試劑盒回收去除質(zhì)粒的pcr產(chǎn)物，具體步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

2.3pprv-ef1/gs1783電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備

1)取pprv-ef1/gs1783突變體菌液在含有氯霉素的lb平板上劃線，32℃震蕩培養(yǎng)20h。

2)取培養(yǎng)好的菌種接種于5-200ml預(yù)熱的含氯霉素抗性的lb培養(yǎng)液，以1:20-1:50的比例，220rpm,32℃培養(yǎng)至od600為0.5～0.7之間。

3)將其轉(zhuǎn)移到42℃水浴搖床，220rpm培養(yǎng)15min。

4)震蕩完畢后立即將培養(yǎng)物置于冰上20min。

5)將菌液分裝到4個(gè)滅菌預(yù)冷的50ml管中，以4℃，4500rpm離心5min。

6)用滅菌預(yù)冷的10％甘油重懸沉淀,12000r/min,4℃離心5min棄上清，洗滌3次。

7)最后用1％菌液體積的10％甘油懸浮沉淀，混合后分裝至1.5mlep管中，50μl/管，用于電轉(zhuǎn)化。

2.4pprv-s1-δgie-kan突變體的構(gòu)建

通過(guò)rede/t兩步重組用pedvs1表達(dá)框(pcmv-s1-bgh-pa)替換pprv-ef1的gi和ge基因。具體操作步驟為：將100ngpcr產(chǎn)物加入到50μlpprv-ef1/gs1783電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，混合后，將此混合物立即轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，在1.5kv，25μf，200兆的條件下電擊3.7ms，電擊完成后，在無(wú)菌條件下向電轉(zhuǎn)杯中加入1mlsoc培養(yǎng)液重懸菌體，然后將電轉(zhuǎn)液轉(zhuǎn)移到1.5mlep管中，32℃搖菌培養(yǎng)1h，取150μl菌液涂布于含有kan、cap雙抗性的lb培養(yǎng)基上，32℃倒置培養(yǎng)24h。待菌落長(zhǎng)出后，隨機(jī)挑取多個(gè)單菌落分別接種于3ml含kan、cap雙抗性的lb液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶bamhⅰ酶切鑒定，最終獲得pprv-s1-δgie-kan突變體。

2.5pprv-s1-δgie突變體的構(gòu)建

按照1.5的方法將pprv-s1-δgie-kan突變體中的kan基因刪除，得到pprv-s1-δgie突變體。

實(shí)施例4拯救pprv-s1-δgie重組病毒

1、提取pprv-s1-δgie質(zhì)粒及酶切鑒定

轉(zhuǎn)化的平板挑取20個(gè)單菌落，用1:1000的卡那霉素和氯霉素抗性的lb培養(yǎng)液搖菌，菌液用prvge基因的引物擴(kuò)增驗(yàn)證，沒(méi)有條帶證明缺失成功。同時(shí)用s1f/s1r引物(其核苷酸序列如序列表seqidno.4和seqidno.5所示)擴(kuò)增驗(yàn)證，有相應(yīng)的條帶證明目的基因已經(jīng)連接bac載體，引物擴(kuò)增驗(yàn)證后，挑取疑似陽(yáng)性菌3ml提取pprv-s1-δgie質(zhì)粒，具體操作步驟如下：

1)1.5ml菌液加入1.5mlep管中，8000rpm離心2min。

2)棄上清，加入1.5ml菌液再次離心，8000rpm離心2min。

3)棄上清，加入300μl不含rna酶的p1懸浮沉淀，震蕩混勻。

4)加入300μlp2裂解，輕輕搖勻，室溫放置5min。

5)加300μlp3終止液，混勻，輕輕的置于冰上10min，每管加20μlrnase酶，14000rpm，離心10min。

6)將上清液移入另一個(gè)離心管中，加入900μl酚氯仿，輕輕的顛倒數(shù)次，13000rpm離心10min。

7)將800μl上層液體(包含dna),移入另一離心管中。

8)加入等量的800μl異丙醇，和盒子一起搖勻，置于冰上10min，15000rpm離心15min。

9)棄上清，勿打擾到沉淀，70％預(yù)冷的無(wú)水乙醇500μl洗dna，15000rpm離心5min。

10)棄上清，不能打擾到沉淀，常溫干燥15min左右。

11)含有rnase的30μl水溶解dna，1：50加入rnase(rnase保存濃度為10mg/ml)。

提取的pprv-s1-δgie質(zhì)粒用bamhⅰ單酶切驗(yàn)證，以篩選重組的陽(yáng)性克隆，驗(yàn)證體系如下，30℃酶切4h，結(jié)果如圖6所示。

酶切產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離后，挑選陽(yáng)性質(zhì)粒送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的pprv-s1-δgie突變體，可通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞進(jìn)行該重組病毒的拯救。

2、rprv-s1-δgie重組病毒的拯救

將提取的pprv-s1-δgie質(zhì)粒純化并測(cè)定濃度后根據(jù)磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法在bhk-21細(xì)胞中進(jìn)行該重組病毒的拯救。具體操作步驟為：取2μgpprv-s1-δgiebacdna用4℃保存滅菌的50μl10mmtris-hcl(ph為7.5)稀釋?zhuān)缓蠹尤?88μl的滅菌水，室溫放置4h，期間輕輕搖勻，使bacdna充分伸展，然后將62μl的2mcacl2逐滴加入，溫柔混勻后置于4℃過(guò)夜，在上述dnacacl2混合液中，逐滴加入500μl2×hbs，室溫下15min，此時(shí)，棄掉六孔板中剛長(zhǎng)滿(mǎn)單層bhk-21細(xì)胞的培養(yǎng)液，加入500μl含10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，然后將500μlbacdna混合物緩慢加入六孔板中，在37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。棄掉上清，用2ml1×pbs洗滌一次，每孔加入1.5ml高滲緩沖液(1×hbs，15％甘油)室溫作用2.5min，棄上清后用1×pbs洗兩次，每孔加入2ml含10％胎牛血清的新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)及病毒噬斑形成情況，獲得的病毒命名為rprv-s1-δgie。

實(shí)施例5westernblot檢測(cè)pedvs1蛋白的表達(dá)

擴(kuò)繁rprv-s1-δgie病毒液，收集后，7000rpm離心5min，收集上清，100℃煮樣品10min后，用膠濃度為12％的sds-page電泳后將其電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5％的脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，加入鼠的flag標(biāo)簽抗體，稀釋2000倍，37℃作用1h，以辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的山羊抗鼠igg為二抗，稀釋2000倍，37℃作用1h，加入底物顯色液，放置于暗箱中5min后，終止反應(yīng)，顯色后，在94kda處有特異性條帶與預(yù)期蛋白大小一致為pedvs1蛋白，結(jié)果如圖7所示，說(shuō)明pedvs1外源蛋白獲得表達(dá)。

實(shí)施例6重組病毒免疫小鼠試驗(yàn)

將20只balb/c小白鼠隨機(jī)分為二組，每組10只，第一組免疫重組病毒rprv-s1-δgie，第二組注射生理鹽水作為空白對(duì)照，通過(guò)肌肉注射分別進(jìn)行免疫，首免后14d進(jìn)行二免，共免疫兩次，于首次免疫后的28d，小鼠采血通過(guò)elisa測(cè)定抗體。具體方法：用s663蛋白包被酶標(biāo)板，包被濃度為1μg/ml，用pbst分別將不同組的小鼠血清倍比稀釋?zhuān)?00μl/孔，37℃作用1h；pbst洗滌液洗滌3次，每次5min；加入1:5000稀釋的hrp標(biāo)記額山羊抗鼠的igg,100μl/孔，37℃作用1h；pbst洗滌液洗滌3次，每次5min；加入底物100μl/孔顯色，37℃溫育20min，最后加入2mh2so4，50μl/孔，終止反應(yīng)。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定od490值，結(jié)果如表3?？擅黠@看出，rprv-s1-δgie檢測(cè)出的抗體濃度較高，說(shuō)明重組病毒rprv-s1-δgie的免疫原性較好，可以作為研究pedv-prv活載體疫苗。

表3倍比稀釋后得到的od490值

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。

sequencelisting

<110>浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>表達(dá)豬流行性腹瀉病毒s1蛋白的重組偽狂犬病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

<130>jlc17i0205e

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2352

<212>dna

<213>人工合成優(yōu)化后的pedv-s1基因序列

<400>1

ggatccgccaccatggccaacaccaacttccgccggttcttctccaagttcaacgtgcag60

gctccagctgtggtggtgctgggaggctacctgccaatcggcgagaaccagggcgtgaac120

agcacctggtactgcgctggacagcacccaaccgcttccggagtgcacggcatcttcgtg180

agccacatcaggggcggccacggcttcgagatcggcatctcccaggagcccttcgaccca240

agcggctaccagctgtacctgcacaaggccaccaacggcaacaccaacgccaccgccagg300

ctgagaatctgccagttcccctccatcaagaccctgggcccaaccgccaacaacgacgtg360

accaccggcagaaactgcctgttcaacaaggccatccccgcccacatgtccgagcacagc420

gtggtgggcatcacctgggacaacgacagggtgaccgtgttctccgacaagatctactac480

ttctacttcaagaacgactggagcagagtggccaccaagtgctactccagcggcggctgc540

gccatgcagtacgtgtacgagcccacctactacatgctgaacgtgacctccgccggagag600

gacggaatcagctaccagccatgcaccgccaactgcatcggctacgccgccaacgtgttc660

gccaccgagcccaacggccacatcccagagggcttctccttcaacaactggttcctgctg720

tccaacgacagcaccctggtgcacggcaaggtggtgagcaaccagcccctgctggtgaac780

tgcctgctggccatcccaaagatctacggcctgggccagttcttctccttcaaccagacc840

atcgacggcgtgtgcaacggagctgctgtgcagagggctccagaggccctgcggttcaac900

atcaacgacacctccgtgatcctggctgagggcagcatcgtgctgcacaccgccctgggc960

accaacctgtccttcgtgtgcagcaactccagcgacccacacctggccaccttcgccatc1020

ccactgggagctacccaggtgccatactactgcttcctgaaggtggacacctacaacagc1080

accgtgtacaagttcctggccgtgctgccaccaatcgtgcgcgagatcgtgatcaccaag1140

tacggcgacgtgtacgtggacggcttcggatacctgcacctgggactgctggacgctgtg1200

accatcaacttcaccggacacggaaccgacgacgacgtgtccggcttctggaccatcgcc1260

agcaccaacttcgtggacgctctgatcgaggtgcagggaaccgccatccagcgcatcctg1320

tactgcgacgaccccgtgtcccagctgaagtgcagccaggtggccttcgacctggacgac1380

ggcttctacccaatctccagccggaacctgctgtcccacgagcagcccatcagcttcgtg1440

accctgccatccttcaacgaccacagcttcgtgaacatcaccgtgtccgccagcttcggc1500

ggacactccggagctaacctgatcgccagcgacaccaccatcaacggcttctccagcttc1560

tgcgtggacacccgccagttcaccatccggctgttctacaacgtgacctccagctacggc1620

tacgtgtccaacagccaggactccaactgccccttcaccctgcagagcgtgaacgactac1680

ctgtccttcagcaagttctgcgtgtccaccagcctgctggcttccgcctgcaccatcgac1740

ctgttcggctacccagacttcggcggcgccgtgaagttcaccagcctgtacttccagttc1800

accaagggagagctgatcaccggaaccccaaagccactggagggagtgaccgacgtgtcc1860

ttcatgaccctgtacgtgtgcaccaagtacaccatctacggcttcaagggcgagggcgtg1920

atcacccccaccaactccagcttcctggccggcatctactacacctccgacagcggccag1980

ctgctggccttcaagaacgtgacctccggagccgtgtacagcgtgaccccatgctccttc2040

agcgagcaggccgcctacgtggacgacgacatcgtgggcgtgatctccagcctgtccaac2100

agcaccttcaacaacaccagggagctgcccggcttcttctaccactccaacgacggcagc2160

aactgcaccgagccagtgctggtgtactccaacatcggcgtgtgcaagtccggcagcatc2220

ggatacgtgccatcccagagcggacaggtgaagatcgcccccaccgtgaccggcaacatc2280

agcatcccaaccaacttctccatgagcatccgcaccgaggattacaaggatgacgacgat2340

aagtgagaattc2352

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工合成引物pedvs1-p1

<400>2

ttggatccgccaccatggccaacaccaac29

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工合成引物pedvs1-p2

<400>3

gggaattctcacttatcgtcgtcatccttg30

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工合成引物s1f

<400>4

accgtgttctccgacaagatctac24

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工合成引物s1r

<400>5

aggatcacggaggtgtcgttgatg24

<210>6

<211>82

<212>dna

<213>人工合成引物prv-in-ie-f

<400>6

ggtccgtagcctccgcagtaccggcgtcgatgatgatggtggcttaaataccgggagaac60

cgggcgatgtacgggccagata82

<210>7

<211>88

<212>dna

<213>人工合成引物prv-in-ie-r

<400>7

ggcatgtcggaatgcgggcggaccggttctcccggtatttaagccaccatcatcatcgac60

gccggcccatagagcccaccgcatcccc88

<210>8

<211>88

<212>dna

<213>人工合成引物ef1-epf

<400>8

ttttgcgcacggttatgtggacaaaatacctggttacccaggccgtgccggcacgttaac60

cgggctcgtgaggctccggtgcccgtca88

<210>9

<211>88

<212>dna

<213>人工合成引物ef1-epr

<400>9

tggtggcgaccggtagcgctagcggatctgacggttcactaaaccagctctgcttatata60

gacctctcacgacacctgaaatggaaga88