專利名稱：鷹嘴豆種子中蛋白類型α‐淀粉酶抑制劑的提取分離方法
技術領域：
本發(fā)明屬于食品科學生物活性成分分離純化領域，涉及一種鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法，具體涉及一種以鷹嘴豆成熟種子為材料，經(jīng)提取液浸提-適溫加熱-硫酸銨分級沉淀-離子交換色譜-高效液相反相色譜對鷹嘴豆種子中所含蛋白類型α-淀粉酶抑制劑進行分離純化的新方法。
背景技術：
α -淀粉酶抑制劑可有效地抑制人腸道內唾液中α -淀粉酶及胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，降低人體糖分吸收以及血糖和血脂的含量，減少脂肪合成，減輕體重，這在醫(yī)藥和保健食品行業(yè)上，可用于開發(fā)糖尿病人專用食品，減肥藥，食品添加劑等；同時由于α -淀粉酶抑制劑對哺乳動物、昆蟲以及微生物的α -淀粉酶有很強的特異性抑制作用，其殺蟲機理在于能抑制昆蟲消化道內α-淀粉酶的活性，使昆蟲食入 的淀粉不能水解消化，從而阻斷了昆蟲的主要能量來源；而且α-淀粉酶抑制劑和昆蟲淀粉消化酶結合形成EI復合物，也會刺激昆蟲的消化腺過量分泌消化酶，通過神經(jīng)系統(tǒng)的反饋，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應，導致發(fā)育不良或死亡，這在生物農(nóng)藥上，可為設計新型無毒無污染抗蟲、抗菌藥物，減少環(huán)境污染等提供良好的實驗材料，在作物品質育種方面，可為轉基因抗病蟲農(nóng)作物新品種的培育提供基因源，既具有重要的理論意義，又具有廣闊的應用前
旦
-5^ O鷹嘴豆(Cicer arietinum)是世界上第三大豆科作物，極度耐旱耐瘠薄，主要種植在干旱和半干旱地區(qū)，在我國新疆已有2500年的種植歷史，是我國維吾爾族人民喜愛的一種副食品，也是新疆維吾爾族人民常用藥材，在新疆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、人民生活和生態(tài)環(huán)境保護中有著重要作用。近年來鷹嘴豆種子中許多活性成分已引起國內外研究者的廣泛重視和興趣。因此，研究和開發(fā)鷹嘴豆籽粒中所含的蛋白質類α-淀粉酶抑制劑，這不僅可為鷹嘴豆的開發(fā)利用提供思路，促進新疆鷹嘴豆的生產(chǎn)，進一步發(fā)揮其在解決新疆土壤干旱、退化、沙化等問題中不可替代的作用；同時還可為其蛋白質類α-淀粉酶抑制劑在醫(yī)藥和保健食品行業(yè)、生物制藥、生物農(nóng)藥開發(fā)以及作物抗病蟲基因工程育種等方面應用提供理論和基因基礎。由于鷹嘴豆種子蛋白含量豐富，從眾多的種子蛋白中分離得到具有α-淀粉酶抑制劑活性的蛋白物質具有很大的難度，各項純化技術過程的選擇和優(yōu)化條件需要合理選擇和合理的參數(shù)設置。以新疆鷹嘴豆種子為材料，建立適用于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的分離純化技術，可為開發(fā)利用鷹嘴豆重要種質資源和優(yōu)良保健成分提供實驗基礎和參考。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法。
本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)一種適宜于鷹嘴豆種子中蛋白類型α -淀粉酶抑制劑的提取分離方法，包含如下步驟(I)采用成熟收獲的鷹嘴豆種子，曬干，磨碎的豆粉；(2)制備的豆粉，按5mL蛋白提取液lg豆粉比例加入預冷的蛋白提取液，4°C充分攪拌混合3h ;蛋白提取液為pH=8. 0，且含有500mmol/L NaCl、2mmol/L PMSFU % β -巰基乙醇和 10mmol /T, EDTA-Na2 的 10mmol /I,的 Tris-HCl 緩沖液；(3)混合物于12000Xg，4°C下離心lOmin，取上清液；(4)上清液70°C水浴5min,期間不斷搖動使液體受熱均勻，于12000Xg,4°C下離心lOmin，取上清液，即為α -淀粉酶抑制劑的粗提液；
(5)將α -淀粉酶抑制劑粗提液進行硫酸銨分級沉淀，收集各級沉淀物；(6)分別取具有較高α-淀粉酶抑制活性的硫酸銨飽和度60% -80%和80% -100%的分級沉淀透析除鹽，透析結束后冷凍干燥；(7)對兩種透析除鹽后的硫酸銨分級蛋白沉淀，分別利用離子交換色譜進行蛋白純化分離，收集具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白進行透析除鹽，并在冷凍干燥機上冷凍干燥。所述的離子交換色譜條件如下①液相色譜儀采用AKTA prime蛋白純化系統(tǒng)，離子交換柱為HiPr印16/10Q XL ；②緩沖液A 為 20mmol/L 的 Tris-HCl，ρΗ=8· O,緩沖液 B 為 I. OmoI/L 的 NaCl ；③用Tris-HCl (20mmol/L, ρΗ=8· O)溶解蛋白粉末，蛋白濃度為40mg/mL，上樣體積為2mL，緩沖液流速為3mL/min，洗脫體積為200mL ；④洗脫方式采用梯度洗脫；(8)硫酸銨飽和度60% -80%分級蛋白沉淀上樣活性峰出峰時間為37min，硫酸銨飽和度80% -100%分級蛋白沉淀上樣活性峰出峰時間也為37min。對上一步得到的兩種具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白，分別進一步采用高效反相液相色譜法進行蛋白純化分離，收集具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白成分真空冷凍干燥，即制備得到兩種蛋白類型α-淀粉酶抑制劑凍干粉。所述的高效反相液相色譜條件如下①液相色譜儀采用AKTA purifier液相系統(tǒng)；②緩沖液A為含O. 05% TFA的超純水，緩沖液B為含O. 05% TFA的乙腈；③用超純水溶解蛋白粉末，蛋白濃度為5mg/mL，上樣體積為100 μ L，緩沖液流速為I. OmL/min，洗脫梯度乙腈5% -100% ；④洗脫方式采用梯度洗脫。(9)從硫酸銨飽和度80% -100%分級蛋白沉淀分離得到的具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白濃縮后經(jīng)SDS-PAGE電泳，測得其分子量約為25. OkDa，此SDS-PAGE電泳蛋白條帶經(jīng)基質輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質譜儀(MALDI TOF-TOF)鑒定，并根據(jù)獲得的肽段信息，經(jīng)網(wǎng)上搜索比對NCBI數(shù)據(jù)庫，確定該純化所得蛋白為一種鷹嘴豆清蛋白，具植物凝集素作用，其在NCBI中基因序列號為gi I 339961380 ;從硫酸銨飽和度60% -80%分級蛋白沉淀分離得到的具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白濃縮后經(jīng)SDS-PAGE電泳，測的其分子量約為60kDa，此SDS-PAGE電泳蛋白條帶經(jīng)LC-MS/MS鑒定，并根據(jù)獲得的肽段信息，經(jīng)網(wǎng)上搜索比對NCBI數(shù)據(jù)庫，確定此蛋白為一種鷹嘴豆球蛋白，其在NCBI中基因序列號為gi I 75266099。其中步驟(I)所述的豆粉優(yōu)選磨碎至能過60目篩。所述的硫酸銨分級沉淀優(yōu)選包含如下步驟①將α -淀粉酶抑制劑粗提液在冰水浴中平衡到0°C，逐漸加入硫酸銨粉末，當溶液中硫酸銨飽和度達到40%時，繼續(xù)冰浴中靜置2h ；②4°C下12000 Xg離心30min，收集沉淀并做標記，上清液重新返回0°C冰水??；③繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨固體直到達到飽和度60%，繼續(xù)冰浴中靜置2h ；④重復步驟②一次；
⑤繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨固體直到達到飽和度80%，繼續(xù)冰浴中靜置2h ；⑥重復步驟②一次；⑦繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨固體直到達到飽和度100%，繼續(xù)冰浴中靜置2h ；⑧重復步驟②一次；所述的α -淀粉酶抑制劑活性測定采用如下方法25 μ L的人唾液α -淀粉酶與等體積的蛋白類型α -淀粉酶抑制劑提取液于37°C水浴中共培養(yǎng)30min后，加入400yL的I %可溶性淀粉溶液，37°C水浴中繼續(xù)處理IOmin后，加入250 μ L的DNS溶液終止反應，迅速經(jīng)沸水浴處理lOmin，用流水冷卻，加水稀釋到一定的體積，546nm下測定吸光值，蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的相對抑制率(即α-淀粉酶抑制劑活性)的計算公式表示如下相對抑制率(*% ) = (Α對照_Α樣品)/A對照X 100其中，Am I代表酶的吸光值;A#S代表樣品的吸光值。所述的高效反相液相色譜法優(yōu)選使用Resource RPC反相柱。有益效果由于鷹嘴豆種子中富含多種蛋白，從眾多種類的鷹嘴豆蛋白中分離獲得具有α -淀粉酶抑制劑活性的蛋白物質成為挖掘鷹嘴豆應用價值的重大挑戰(zhàn)，本發(fā)明建立了一套適合于鷹嘴豆中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的分離純化方法。本套發(fā)明方法首先對鷹嘴豆種子中總蛋白進行制備，然后再采用硫酸銨分級沉淀一離子交換色譜一高效反相液相色譜方法對其中所含蛋白類型α-淀粉酶抑制劑進行分離提取。經(jīng)本發(fā)明方法可從鷹嘴豆種子中分離制備到兩種蛋白類型α-淀粉酶抑制劑，制備的蛋白量多、純度好、α -淀粉酶抑制劑的抑制活性高，是一種可廣泛應用于植物種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑分離制備的新工藝。


圖I Desi型鷹嘴豆種子中硫酸銨分級蛋白沉淀(60% -80% )離子交換色譜分離圖譜(箭頭所指此峰共收集到3管，α-淀粉酶抑制活性測定結果分別為45. 45%,44. 67%和 42. 42%)。圖2 Desi型鷹嘴豆種子中硫酸銨分級蛋白沉淀(80%-100%)離子交換色譜分離圖譜(箭頭所指此峰所測定的α -淀粉酶抑制活性為87. 42%)。圖3 Desi型鷹嘴豆種子蛋白經(jīng)硫酸銨分級蛋白沉淀(60%-80%)以及離子交換色譜分離后的活性部分高效液相反相色譜分離圖(箭頭所示部分為具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白組分)。圖4 Desi型鷹嘴豆種子蛋白經(jīng)硫酸銨分級蛋白沉淀(60%-80%)以及離子交換色譜-高效液相反相色譜分離后的活性部分SDS-PAGE電泳圖(箭頭所示部分為具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白組分)。圖5 Desi型鷹嘴豆種子蛋白經(jīng)硫酸銨分級蛋白沉淀(80%-100%)以及離子交換色譜分離后的活性部分高效液相反相色譜分離圖(箭頭所示部分為具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白組分)。圖6 Desi型鷹嘴豆種子蛋白經(jīng)硫酸銨分級蛋白沉淀(80% -100%)以及離子交換色譜-高效液相反相色譜分離后的活性部分SDS-PAGE電泳圖(箭頭所示部分為具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白組分)。
具體實施例方式實施例I : 采用美國Beckmen高速低溫離心機、液相色譜AKTA系統(tǒng)。(I)采用成熟收獲的鷹嘴豆種子，曬干去除癟粒和雜質后，采用籽粒飽滿的種子，在實驗室_20°C以下保存?zhèn)溆谩?2)將鷹嘴豆種子放入快速粉碎機中磨碎，過60目篩，獲得精細豆粉，-20°C條件下保存?zhèn)溆谩?3)制備的精細豆粉，按5mL蛋白提取液lg豆粉比例加入預冷的蛋白提取液，4°C充分攪拌混合3h。蛋白提取液配制方法10mmol/L的Tris-HCl，pH=8. O (包含500mmol/L的 NaCl,2mmol/L 的 PMSF，I % 的 β -巰基乙醇和 IOmmoI/L 的 EDTA-Na2) (4)混合物12000Xg，4°C下離心lOmin，取蛋白提取上清液。(5)蛋白提取上清液70°C水浴5min，期間不斷搖動使液體受熱均勻。(6)重復步驟(4) 一次，收集到的蛋白上清液即為α-淀粉酶抑制劑的粗提液，放置4°C備用。(7)將α -淀粉酶抑制劑粗提液在冰水浴中平衡到0°C，逐漸加入硫酸銨粉末，充分攪拌均勻溶解，進行硫酸銨分級沉淀。硫酸銨分級沉淀具體操作步驟如下①當溶液中硫酸銨飽和度達到40%時(每IOOmL提取液中加入22. 6g硫酸銨固體)，繼續(xù)冰浴中靜置2h;②4°C下12000 Xg離心30min，收集沉淀并做標記，上清液重新返回0°C冰水??；③繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨固體直到達到飽和度60% (每IOOmL上清液中加入15. 3g硫酸銨固體)，繼續(xù)冰浴中靜置2h ；④重復步驟②一次；⑤繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨固體直到達到飽和度80% (每IOOmL上清液中加入12. 9g硫酸銨固體)，繼續(xù)冰浴中靜置2h ；⑥重復步驟②一次；⑦繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨固體直到達到飽和度100% (每IOOmL上清液中加入13. 9g硫酸銨固體)，繼續(xù)冰浴中靜置2h ；⑧重復步驟②一次。
(8)收集到的各組分蛋白沉淀物采用透析袋透析除鹽，透析結束后在真空冷凍干燥機上冷凍干燥。(9)分別取具有較高α -淀粉酶抑制活性的硫酸銨60% -80%分級沉淀(硫酸銨鹽飽和度由60%增加到80%所沉淀的蛋白)和80% -100%分級沉淀(硫酸銨鹽飽和度由80%增加到100%所沉淀的蛋白)，用于離子交換色譜進一步進行蛋白分離純化，檢測α -淀粉酶抑制活性，并分別收集具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白進行透析除鹽，并在冷凍干燥機上冷凍干燥。此過程中離子交換色譜條件如下①液相色譜儀采用AKTA prime蛋白純化系統(tǒng)，離子交換柱為HiPr印16/10QXL ；②緩沖液A 為 20mmol/L 的 Tris-HCl，ρΗ=8· O,緩沖液 B 為 I. OmoI/L 的 NaCl ；③上樣體積為2mL，緩沖液流速為3mL/min，洗脫體積為200mL ； ④洗脫方式采用梯度洗脫，洗脫梯度如圖所示。Desi型鷹嘴豆種子中硫酸銨分級蛋白沉淀(60 % _80 % )離子交換色譜分離圖譜見圖1，箭頭所指此峰共收集到3管，α-淀粉酶抑制活性測定結果分別為45. 45%、44. 67%和42. 42%。Desi型鷹嘴豆種子中硫酸銨分級蛋白沉淀(80% -100%)離子交換色譜分離圖譜見圖2，箭頭所指此峰所測定的α -淀粉酶抑制活性為87. 42%。(10)對上述兩種具有α -淀粉酶抑制劑活性的蛋白，進一步分別采用高效反相液相色譜進行蛋白純化分離，收集具有α -淀粉酶抑制活性的成分真空冷凍干燥，即制備得到兩種蛋白類型α-淀粉酶抑制劑凍干粉。此過程中高效反相液相色譜條件如下①液相色譜儀采用AKTA purifier液相系統(tǒng),反相柱子為Resource RPC反相柱；②緩沖液A為含O. 05 % TFA的超純水，緩沖液B為含O. 05 % TFA的CAN ；③上樣體積為100 μ L，緩沖液流速為I. OmL/min,洗脫梯度乙腈濃度(5% -100%)；④洗脫方式采用梯度洗脫，洗脫梯度如圖所示。Desi型鷹嘴豆種子蛋白經(jīng)硫酸銨分級沉淀(60% -80%)以及離子交換色譜分離后的活性部分高效液相反相色譜分離圖見圖3，箭頭所示部分為具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白組分，此峰所測定的α-淀粉酶抑制活性為80. 85% ；Desi型鷹嘴豆種子蛋白經(jīng)硫酸銨分級沉淀(80% -100% )以及離子交換色譜分離后的活性部分高效液相反相色譜分離圖見圖5，箭頭所示部分為具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白組分，此峰所測定的α -淀粉酶抑制活性為85. 02% ；(11)從硫酸銨飽和度80% -100%沉淀蛋白分離得到的具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白濃縮后經(jīng)SDS-PAGE電泳，測得其蛋白分子量約為25. OkDa，此SDS-PAGE電泳蛋白條帶經(jīng)基質輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質譜儀(MALDI T0F-T0F)鑒定，得到以下蛋白肽段①GKEVYLFK (SEQ ID NO. I)②TMEAYLFK (SEQ ID NO. 2)③VLYGPSFVR (SEQ ID NO. 3)④NNEAYLFINDK (SEQ ID NO. 4)⑤VLYG PSFVRDGYK (SEQ ID NO. 5)
⑥TNEAYLFKGEYYAR (SEQ ID NO. 6)⑦INFTPGSTNDMGGVKK (SEQ ID NO. 7)⑧GTIFEAGMDSAFASHKTNEAYLFK (SEQ ID NO. 8)根據(jù)這些肽段信息，經(jīng)網(wǎng)上搜索比對NCBI數(shù)據(jù)庫，確定該純化所得蛋白為鷹嘴豆清蛋白的一種，具植物凝集素作用，其在NCBI中基因序列號為gi|339961380 ；從硫酸銨飽和度60% -80%沉淀蛋白分離得到的具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白濃縮后經(jīng)SDS-PAGE電泳，測的其蛋白分子量約為60kDa，此SDS-PAGE電泳蛋白條帶經(jīng)LC-MS/MS鑒定，得到以下蛋白肽段①RDFLEDALNVNRR (SEQ ID NO. 9)
②KSEGGLIETWNPSNKQ (SEQ ID NO. 10)③LHQNIGSSSSPDIYNPQAGR (SEQ ID NO. 11)④YQQEGSEEEENEGGNIFSGFK (SEQ ID NO. 12)⑤FYLAGNHEQEFLR (SEQ ID NO. 13)根據(jù)獲得的肽段信息，經(jīng)網(wǎng)上搜索比對NCBI數(shù)據(jù)庫，確定此蛋白為一種鷹嘴豆球蛋白，其在NCBI中基因序列號為gi I 75266099。本發(fā)明蛋白類型α -淀粉酶抑制劑的抑制活性測定采用Ishimoto的方法并作適當調整修改如下25 μ L的人唾液α-淀粉酶與等體積的蛋白類型α -淀粉酶抑制劑提取液于37°C水浴中共培養(yǎng)30min后，加入400yL的I %可溶性淀粉溶液，37°C水浴中繼續(xù)處理IOmin后，加入250 μ L的DNS溶液終止反應，迅速經(jīng)沸水浴處理lOmin，用流水冷卻，加水稀釋到一定的體積，546nm下測定吸光值。蛋白類型α -淀粉酶抑制劑的相對抑制率的計算公式表示如下相對抑制率(*% ) = (Α對照_Α樣品)/A對照X 100其中，Am I代表酶的吸光值；A#S代表樣品的吸光值。整個提取過程中蛋白溶液需保持在低溫條件(4°C)，所用溶液用純水或純水配制，蛋白溶液應保持在pH=8. O條件下。
權利要求
1.一種適宜于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法，其特征在于包含如下步驟(1)采用成熟收獲的鷹嘴豆種子，曬干，磨碎成豆粉；(2)制備的豆粉，按5mL蛋白提取液Ig豆粉比例加入預冷的蛋白提取液，4°C充分攪拌混合3h ;蛋白提取液為pH=8. 0，且含有500mmol/L NaCl、2mmol/L PMSFU % 巰基乙醇和 10mmol/L EDTA-Na2 的 10mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液；(3)混合物于12000Xg，4°C下離心lOmin，取上清液；(4)上清液70°C水浴5min，期間不斷搖動使液體受熱均勻，于12000Xg，4°C下離心lOmin，取上清液，即為α -淀粉酶抑制劑的粗提液；(5)將α-淀粉酶抑制劑粗提液進行硫酸銨分級沉淀，收集各級沉淀物；(6)分別取具有較高α-淀粉酶抑制活性的硫酸銨飽和度60% -80%和80% -100%的分級蛋白沉淀透析除鹽，透析結束后冷凍干燥；(7)對上述兩種透析除鹽后的硫酸銨分級蛋白沉淀，分別利用離子交換色譜進行蛋白純化分離，收集具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白進行透析除鹽，并在冷凍干燥機上冷凍干燥。所述的離子交換色譜條件如下①液相色譜儀采用AKTAprime蛋白純化系統(tǒng)，離子交換柱為HiPr印16/10QXL ；②緩沖液A 為 20mmol/L 的 Tris-HCl，ρΗ=8· O,緩沖液 B 為 I. OmoI/L 的 NaCl ；③用20mmol/L，pH=8.OTris-HCl溶解蛋白粉末，蛋白濃度為40mg/mL，上樣體積為2mL，緩沖液流速為3mL/min，洗脫體積為200mL ；④洗脫方式采用梯度洗脫；(8)硫酸銨飽和度60%-80%分級蛋白沉淀上樣活性峰出峰時間為37min，硫酸銨飽和度80% -100%分級蛋白沉淀上樣活性峰出峰時間也為37min。對上一步得到的兩種具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白，分別進一步采用高效反相液相色譜法進行蛋白純化分離，收集具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白成分真空冷凍干燥，即制備得到兩種蛋白類型α-淀粉酶抑制劑凍干粉。所述的高效反相液相色譜條件如下①液相色譜儀采用AKTApurifier液相系統(tǒng)；②緩沖液A為含0.05%TFA的超純水，緩沖液B為含0.05% TFA的乙腈；③用超純水溶解蛋白粉末，蛋白濃度為5mg/mL，上樣體積為100μ L，緩沖液流速為I.OmL/min，洗脫梯度乙腈濃度為5% -100% ；④洗脫方式采用梯度洗脫。(9)從硫酸銨飽和度80%-100%分級蛋白沉淀分離得到的具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白濃縮后經(jīng)SDS-PAGE電泳，測得其分子量約為25. OkDa，此SDS-PAGE電泳蛋白條帶經(jīng)基質輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質譜儀(MALDI T0F-T0F)鑒定，并根據(jù)獲得的肽段信息，經(jīng)網(wǎng)上搜索比對NCBI數(shù)據(jù)庫，確定該純化所得蛋白為一種鷹嘴豆清蛋白，具植物凝集素作用，其在NCBI中基因序列號為gi I 339961380 ;從硫酸銨飽和度60% -80%分級蛋白沉淀分離得到的具有α -淀粉酶抑制活性的蛋白濃縮后經(jīng)SDS-PAGE電泳，測得其分子量約為60kDa，此SDS-PAGE電泳蛋白條帶經(jīng)LC-MS/MS鑒定，并根據(jù)獲得的肽段信息，經(jīng)網(wǎng)上搜索比對NCBI數(shù)據(jù)庫，確定此蛋白為一種鷹嘴豆球蛋白，其在NCBI中基因序列號為gi I 75266099。
2.根據(jù)權利要求I所述的適宜于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法，其特征在于步驟(I)所述的豆粉需磨碎至能過60目篩。
3.根據(jù)權利要求I所述的適宜于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法，其特征在于所述的硫酸銨分級沉淀具體為①將α-淀粉酶抑制劑粗提液在冰水浴中平衡到0°C，逐漸加入硫酸銨粉末，當溶液中硫酸銨飽和度達到40%時，繼續(xù)冰浴中靜置2h ；②4°C下12000Xg離心30min,收集沉淀并做標記,上清液重新返回0°C冰水??；③繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨固體直到達到飽和度60%，繼續(xù)冰浴中靜置2h；④重復步驟②一次；⑤繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨固體直到達到飽和度80%，繼續(xù)冰浴中靜置2h；⑥重復步驟②一次；⑦繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨固體直到達到飽和度100%，繼續(xù)冰浴中靜置2h；⑧重復步驟②一次。
4.根據(jù)權利要求I所述的適宜于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法，其特征在于蛋白類型α-淀粉酶抑制劑抑制活性的測定采用如下方法25 μ L的人唾液α -淀粉酶與等體積的蛋白類型α -淀粉酶抑制劑提取液于37°C水浴中共培養(yǎng)30min后，加入400 μ L的I %可溶性淀粉溶液，37°C水浴中繼續(xù)處理IOmin后，加入250 μ L的DNS溶液終止反應，迅速經(jīng)沸水浴處理lOmin，用流水冷卻，加水稀釋到一定的體積，546nm下測定吸光值，蛋白類型α _淀粉酶抑制劑的相對抑制率的計算公式表示如下相對抑制率(％) = (Α對照-A樣品)/A對照X 100其中，Awm i代表酶的吸光值;A代表樣品的吸光值。
5.根據(jù)權利要求I所述的適宜于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法，其特征在于所述的高效反相液相色譜法使用Reso urce RPC反相柱。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品科學生物活性成分分離純化領域，涉及一種鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法。本發(fā)明以鷹嘴豆成熟種子為材料，經(jīng)提取液浸提-適溫加熱-硫酸銨分級沉淀-離子交換色譜-高效液相反相色譜對鷹嘴豆種子中所含蛋白類型α-淀粉酶抑制劑進行分離純化。目前，經(jīng)多次實驗證明，采用此提取方法可分離到兩種蛋白類型α-淀粉酶抑制劑，其中一個屬鷹嘴豆清蛋白，分子量約為25.0kDa，具植物凝集素作用，在NCBI中基因序列號為gi|339961380；另一個屬鷹嘴豆球蛋白，分子量約為60.0kDa，在NCBI中基因序列號為gi|75266099。該分離方法得到目的蛋白多，純度高，α-淀粉酶抑制活性強，提取程序簡便，是一套適用于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法。
文檔編號C07K1/36GK102924592SQ201210500059
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月29日 優(yōu)先權日2012年11月29日
發(fā)明者麻浩, 王占奎, 顧愛星, 葛杰, 馬洪雨, 苑煒 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學