專利名稱：一種制備針對糖基化修飾蛋白質的單克隆抗體雜交瘤的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫化學、蛋白質化學和細胞生物學領域。具體而言，本發(fā)明涉及一種制備特異識別糖基化修飾蛋白的單克隆抗體的方法。
背景技術：
蛋白質的翻譯后修飾狀態(tài)與蛋白質功能密切相關，其中糖蛋白發(fā)揮了多種重要的生物功用，如細胞膜上的糖蛋白參與胚胎發(fā)育、細胞移動、免疫反應以及細胞分裂等過程。另外，大部分血漿蛋白都具有不同程 度的糖基化修飾。值得注意的是，現在已知的作為各種疾病檢測標記物的蛋白質都是糖蛋白，如PSA，AFP，CA125，CA153和HER-2等。多年來，關于對血漿中的生物標記物的檢測的研究取得了一定的進展。其中最重要的方法就是生產針對這些蛋白的抗體，通過ELISA的方法實現對這些蛋白的檢測和定量。該方法的關鍵即是獲得特異性好、靈敏度高的抗體。目前，傳統(tǒng)的生產抗體的方法已經相當成熟且在大多數情況下非常有效，但是對于血漿中的這些糖蛋白抗體的生產，傳統(tǒng)的方法往往存在一定的不足，這是由于具有天然糖基化修飾的蛋白難以獲得，而且糖蛋白的抗原性往往不強。原核表達的蛋白，由于不具有糖基化修飾，籍此產生的抗體往往不能很好地識別人血液中的糖蛋白。糖蛋白抗體的生產通?？梢酝ㄟ^富集和純化生物體內的天然糖蛋白作為抗原，采用傳統(tǒng)的抗體生產方法進行抗體制備。但是這種方法對于那些在生物體內含量較低，或者難于純化的糖蛋白并不合適。而且更重要的是，在一系列體外操作過程中，對糖蛋白的各種性質是否造成不同程度的影響，也是不得而知的。因此為了克服以上困難，一些科學家已經研發(fā)出新的抗體制備方法以獲得特異針對糖蛋白的抗體。McKenzie采用小鼠腹腔注射在其細胞膜上穩(wěn)定表達外源糖蛋白Neu的腫瘤細胞作為免疫抗原的方法，刺激機體產生并篩選出針對該蛋白的單克隆抗體。在該方法中，將Neu基因導入到NIH3T3細胞中，使其在細胞膜上穩(wěn)定表達。細胞通過腹腔注射入小鼠后，該蛋白的細胞外部分即可作為抗原刺激機體產生抗體。該方法克服了膜上糖蛋白難于富集純化的困難，而且實驗結果也表明，這種方法生產的抗體比依靠合成Neu蛋白上的肽段作為抗原生產出的抗體具有更好的特異性，可以區(qū)分與其相似性極高的蛋白。Atabai也通過類似的方法將穩(wěn)定表達MFGE8蛋白的人的腫瘤細胞注射到兔子體內，通過篩選獲得特異性單克隆抗體。Suzuki等將heparin的糖鏈連接到載體蛋白KLH上作為抗原，采用傳統(tǒng)方法注射到小鼠體內，篩選出可特異識別該糖鏈的單克隆抗體。但是上述研究并沒有能夠提供一種應用性廣泛的方法，而且實驗操作比較復雜。本發(fā)明人以人AGP為例，試圖建立一套可生產特異識別糖基化蛋白的抗體的方案，由此生產的單克隆抗體可基本上克服糖蛋白抗原性低下和糖蛋白抗體特異性差的缺陷。將外源的糖蛋白基因通過逆轉錄病毒載體導入到小鼠黑色素瘤細胞B16中，經過篩選獲得穩(wěn)定表達株。該表達株可以持續(xù)地將外源糖蛋白分泌到細胞外。將穩(wěn)定細胞株和佐劑混合后經皮下注射到C57BL/6J小鼠體內，隨著細胞的不斷增殖和生長，外源糖蛋白被持續(xù)分泌到小鼠體內作為抗原刺激機體產生抗體。將血清呈陽性反應的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合后，通過多次篩選，可以得到可特異識別外源糖蛋白的單克隆抗體。該方法與傳統(tǒng)的生產糖蛋白單克隆抗體的方法相比具有明顯的優(yōu)勢:在此過程中，細胞表達分泌的蛋白具有正確的糖基化修飾，不需對它們進行富集，而且這些抗原是持續(xù)性的分泌到小鼠體內，不斷刺激機體的免疫系統(tǒng)，這樣既解決了糖蛋白富集的難題，又解決了糖蛋白抗原性低的問題。我們采用該方法成功地生產了 AGP的單克隆抗體，這些抗體可以特異性的識別糖基化修飾的AGP，而對非糖基化的AGP幾乎不具有識別能力。

發(fā)明內容
一 )本發(fā)明涉及制備特異識別糖基化修飾蛋白的單克隆抗體的方法，其中包括:
I)將含有帶有RFP標簽的外源基因AGP的逆轉錄病毒載體轉染病毒包裝細胞，收集病毒后感染B16細胞，并通過藥物處理進行穩(wěn) 定株的篩選，通過RFP抗體檢測穩(wěn)定株對這些糖蛋白的分泌；2)將所得的穩(wěn)定株與弗氏完全佐劑混合后，經皮下注射到C57BL/6J小鼠脾臟側的腰窩處；3)使用弗氏完全佐劑進行腹部皮下注射以增強免疫反應；4)使用人血漿蛋白和原核表達的AGP對單克隆抗體同時進行篩選，以獲得特異針對糖基化修飾蛋白的單克隆抗體；5)對這些單克隆抗體的檢測和評估。二)本發(fā)明選擇了分泌蛋白作為抗原，該抗原可以分泌到細胞外，直接入血，刺激機體產生體液免疫反應。與傳統(tǒng)的抗體生產方法不同，該抗原是隨著細胞的生長而不斷持續(xù)被分泌到細胞外的。因此，引起的刺激也是連續(xù)性的。在細胞和宿主選擇方面，黑色素瘤細胞B16即是宿主C57BL/J6小鼠來源的，因此，注射了穩(wěn)定株細胞的小鼠只對外源性的分泌糖蛋白有免疫反應，而不會對B16細胞自身來源的其他任何蛋白有免疫反應。這一策略保證了生產出的抗體的單一性和優(yōu)越性。而B16細胞是一種易轉染、對外源基因可以穩(wěn)定高效表達的細胞。三)本發(fā)明對標簽蛋白紅色熒光蛋白RFP的引入同時考慮到了三方面的因素:1)由于RFP基因是融合在外源糖蛋白的C端，因此，它不會對蛋白的分泌產生影響，而在整個轉染、感染和篩選的過程中，紅色熒光可以表明轉染、感染效率以及外源蛋白在細胞內的表達狀況；2)在對篩選到的穩(wěn)定株進行檢測時，RFP抗體可以作為一個有效的工具，對外源糖蛋白的分泌進行測定；3)作為一種載體蛋白，RFP可以增加肌體對糖蛋白的免疫反應。該原理類似于在使用多肽作為免疫原時采用KLH作為載體蛋白增強免疫反應。這是由于糖蛋白上的糖鏈作為一種半抗原降低了糖蛋白的抗原性，因此使用分子量較大的RFP(28Kd)，而不是通常用的HIS-Tag等作為融合蛋白。四)本發(fā)明傾向于選擇采用逆轉錄病毒作為載體將外源基因導入到B16細胞中。這是因為對一些基因長度比較大的糖蛋白來說，在與RFP基因融合后的基因長度過大不利于采用傳統(tǒng)的直接轉染的方法進行穩(wěn)定株的篩選。而逆轉錄病毒卻可以包裝比較大的基因片斷，而且它的感染效率往往很高，可以大大縮短篩選穩(wěn)定株所需的時間。但本發(fā)明同樣也涉及其他轉染方法在該抗體生產過程中的應用。五)本發(fā)明采用脾臟側腰窩處的皮下注射免疫。這主要是考慮到以下幾個方面:
I)首先機體內產生免疫反應的重要器官即是脾臟；2)在眾多的免疫方式中，抗原的直接脾臟免疫方式已經被證明是一種更加有效的選擇。但是，這種注射方法對于機體的影響顯著，很可能造成動物的死亡。在本發(fā)明中，由于B16是一種惡性程度高、易轉移的腫瘤細胞，很易導致小鼠的死亡。如果將B16細胞直接注射小鼠脾臟內，則在很短時間內就可能導致小鼠的死亡，而此時有效抗體還沒有大量產生。六)本發(fā)明首創(chuàng)佐劑與細胞混合注射。佐劑的使用在抗原呈遞過程中起到關鍵的作用，可以大大提高抗體的產生。在本發(fā)明中，佐劑與細胞混合注射后，雖然會殺死部分細胞，但是存活的細胞一旦分泌出糖蛋白后，其周圍的佐劑就會及時對這些抗原進行呈遞，增加抗體的產生。我們的實驗亦表明佐劑的混合注射會明顯提高抗體的產出。而在細胞注射后，單獨的佐劑腹下注射也是為了增強肌體的免疫反應。七)本發(fā)明所涉及的生產單克隆抗體的技術可適用于生產針對跨膜及膜外蛋白(如細胞基質類蛋白)的抗體。這是由于將這些基因轉入B16細胞后，這些位于細胞外的蛋白或蛋白中的一部分可以作為抗原持續(xù)性的刺激機體產生抗體。該方法產生的抗體往往僅識別跨膜蛋白的胞外區(qū)域，具 有較強的特異性。而且這些跨膜及膜外蛋白往往也具有一定的糖基化修飾，因此，使用該方法可以生產出可特異性識別這些糖基化修飾的抗體。使用該方法也可以生產特異針對蛋白質其它修飾形式的抗體，包括磷酸化、硝基化等。只要在天然狀態(tài)下會發(fā)生修飾的蛋白，通過該方法都能生產出能特異識別該修飾形式蛋白的抗體。


圖1:表示穩(wěn)定株分泌蛋白的免疫印跡檢測結果，結果顯示帶有RFP融合標簽的糖蛋白被順利地分泌到細胞外，且從目標蛋白的分子量變化上也表明AGP發(fā)生了明顯的糖基化修飾。抗RFP多抗?jié)舛葹?: 1000。圖2:表示B16-RFP-AGP穩(wěn)定株的熒光鏡檢測結果，具體而言，B16-RFP-AGP的熒光顯微照片表明紅色熒光僅分布在胞質區(qū)域，這也證實了 AGP糖蛋白的分泌性質。圖3:注射免疫B16-RFP-AGP穩(wěn)定株細胞的小鼠抗血清的免疫印跡檢測結果，具體可見，免疫了 B16-RFP-AGP穩(wěn)定細胞系的小鼠抗血清中已經包含了對蛋白糖基化修飾有特異性的識別傾向的多克隆抗體?？寡逑♂尡壤秊?: 2000。圖4:表示BP1-AGP單克隆抗體和Sigma-AGP單克隆抗體對不同修飾狀態(tài)AGP抗原的免疫印跡差異識別的實驗結果，具體而言，BP1-AGP單克隆抗體對糖基化蛋白特異識別，而對原核表達的無糖基化修飾的AGP沒有識別，對脫糖后AGP蛋白的識別也明顯的減弱。而Sigma-AGP單克隆抗體對這兩種不同修飾形式的蛋白的識別沒有偏向性。圖5:表示BP1-AGP單克隆抗體和Sigma-AGP單克隆抗體對不同修飾狀態(tài)AGP抗原的ELISA檢測結果的差異的實驗結果，具體而言，BP1-AGP單克隆抗體只對糖基化AGP有特異的結合，而對原核表達的非糖基化AGP幾乎無結合。而Sigma-AGP單克隆抗體對兩者的結合均沒有明顯的差異。左圖以糖基化AGP作為抗原，右圖以原核細胞表達的重組AGP蛋白作為抗原。圖6:表示BP1-AGP單克隆抗體和Sigma-AGP單克隆抗體的免疫組化實驗結果，該結果表明=BP1-AGP單克隆抗體對人肝臟組織中的糖基化AGP的識別的特異性高于Sigma-AGP單克隆抗體對人肝臟組織中的糖基化AGP的識別。所用單克隆抗體的濃度均為I: 500。
具體實施方式
實施例1糖蛋白的基因克隆本發(fā)明人根據已公布的人AGP的基因序列(SEQ ID N0.1)設計PCR引物:AGP 5，正向引物5，-GCCAAGCTTATGGCGCTGTCCTGGGTTCT-3’ (SEQ ID 0N.2)AGP 3’反向引物5，-GGCGGATCCTAGGATTCCCCCTCCTC-3’ (SEQ ID 0N.3)以人肝cDNA文庫為模板，PCR擴增出全長AGP基因，(PCR參數:95 °C 5分鐘；94°C 30s 54°C 30s 72°C I 分鐘，共 40 個循環(huán)；72°C后延伸 10 分鐘)經 Hind III 和 BamH I雙酶切后與PLNCX2-RFP質粒連接(RFP基因來自于pDsRed2質粒，從該質粒上用Hind III和Not I內切酶將RFP基因切下后，連接到經同樣雙酶切的PLNCX2質粒上)，化學轉化感受態(tài)細胞E.ColiDH5a，挑單克隆提取質粒進行測序，驗證序列無誤。實施例2穩(wěn)定表達并分泌外源 糖蛋白的細胞株的構建、篩選和驗證從E.coli DH5 α中提取構建好的pLNCX2_RFP_AGP質粒和編碼逆轉錄病毒包膜蛋白的質粒 pVSV-G,按照 DNA 和轉染試劑 Lipofectamine 2000 (11668-019, Invitrogen)的量為1: 5的比例進行兩種質粒的共轉染。在氯奎的幫助下，將兩種質粒轉入逆轉錄病毒包裝細胞GP2-293中。8小時后進行換液以清除氯奎對細胞的毒性作用。撤除氯奎后的48小時后，收集GP2-293的培養(yǎng)基上清，此時的培養(yǎng)基中被釋放出的含有外源基因的逆轉錄病毒顆粒最多。通過長時間的高速離心(4°C，50，000g，90分鐘)富集沉淀下來的逆轉錄病毒顆粒。將這些病毒進行復性后，加入到目標細胞B16的培養(yǎng)基中，在Polybrene (H9268，Sigma)試劑的幫助下，這些病毒即可感染B16細胞，同時將外源基因導入到目標細胞中。感染后的細胞，在G418的篩選作用下，經過大約2周的時間，即可獲得單克隆穩(wěn)定株細胞。采用免疫印跡的方法對篩選得到的穩(wěn)定株進行驗證。方法如下:將穩(wěn)定株細胞的完全培養(yǎng)基吸出后，用生理鹽水洗細胞3次，然后換成無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時。收集這些無血清培養(yǎng)基，通過截留分子量為30kD的Amicon Filter (UFC803008, Millipore)進行培養(yǎng)基中蛋白質的濃縮。濃縮40倍后的培養(yǎng)基即可直接用于免疫印跡檢測。圖1顯示了穩(wěn)定株分泌到細胞外的糖蛋白的免疫印跡檢測結果以及圖2顯示的穩(wěn)定株(B16-RFP-AGP)的熒光顯微照片。從圖1中可以看出帶有RFP融合標簽的糖蛋白被順利的分泌到細胞外，且從目標蛋白的分子量變化上也表明AGP發(fā)生了明顯的糖基化修飾。從圖2中可以看出，B16-RFP-AGP的熒光顯微照片表明紅色熒光僅分布在胞質區(qū)域，這也證實了 AGP糖蛋白的分泌性質。實施例3AGP重組抗原的制備根據已公布的人AGP的基因序列設計PCR引物:AGP 5’正向引物5，-GCCGGATCCATGGCGCTGTCCTGGGTTCT-3’ (SEQ ID 0N.4)AGP 3’反向引物5，-GGCAAGCTTCTAGGATTCCCCCTCCTC-3’ (SEQ ID 0N.5)以人肝cDNA文庫為模板，PCR擴增出全長AGP基因，經膠回收后進行BamH I和HindIII雙酶切，回收后，與同樣雙酶切的pET28a載體進行連接，化學轉化感受態(tài)細胞E.coli DH5ci，經過雙酶切驗證以及質粒測序選取陽性克隆菌株。將選取的陽性克隆的質?；瘜W轉化感受態(tài)細胞BL21 (DE3)。接種可表達AGP的BL21菌株，當菌液的OD值達到0.6左右時，加入lmmol/LIPTG誘導4小時。誘導以后的菌株經超聲后離心，上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳，結果顯示表達的產物為包涵體蛋白。大量培養(yǎng)細菌，IPTG誘導4小時后進行收菌，超聲破碎、離心、棄上清，在沉淀中加入含8M尿素的提取液溶解表達的包涵體蛋白。再次離心后，上清即可用于純化。使用N1-NAT親和層析柱對表達的AGP蛋白進行純化，柱子經平衡、上樣、淋洗后，使用10、20、50mM咪唑進行分段洗脫，去除其中的雜蛋白，最后采用IOOmM咪唑洗脫目的蛋白。純化后的蛋白經SDS-PAGE電泳，檢測AGP蛋白的純化效果。其他所用的重組蛋白的制備，如RFP也經歷了相同的表達和純化過程。實施例4抗人AGP單克隆抗體雜交瘤細胞系(BP1-AGP，保藏日2009年I月14日，保藏號為CGMCC2868，保藏地中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)的制備穩(wěn)定分泌表達RFP-AGP的B16細 胞經胰酶消化并終止后，離心收集細胞。這些細胞經PBS洗滌三次后，用無血清的培養(yǎng)基重懸，進行細胞計數。按照等體積(IOOyL: IOOyL)的比例將5-10萬個細胞與弗氏完全佐劑反復吹打幾次，混勻。混勻后的混合物經注射器注射到小鼠脾臟側腰窩處的皮下。以后，每隔7天在小鼠腹部皮下注射弗氏完全佐劑進行免疫加強。一個月后，通過眼眶取血，對血液中的抗血清進行免疫印跡檢測。選擇原核細胞表達的AGP，人血中的糖基化修飾的AGP(G9885，Sigma)，B16穩(wěn)定表達株分泌的糖基化的RFP-AGP蛋白以及原核細胞表達的RFP和RFP-AGP作為抗原檢測注射腫瘤細胞后的小鼠抗血清的效價。每種蛋白上樣約200ng，進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后立即進行電轉移，過程如下:將PVDF膜置于5mL甲醇中，處理5分鐘；加入4倍體積(20mL)水，慢加快搖，將甲醇逐級稀釋到20%，倒去液體；再用轉膜緩沖液(20%甲醇，25mM Tris-base,192mMGlycine)平衡15分鐘。將凝膠浸泡于含有0.01% SDS的轉膜緩沖液中，10分鐘。按照黑板-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜一濾紙-海綿-白板的順序，做好三明治夾，放入裝有 0.01% SDS 轉膜緩沖液的 Trans-Blot Cell 轉膜儀中(Bio-Rad, Hercules, U.S.A.),350mA，轉膜2小時。PVDF膜的進一步處理過程如下:膜以PBST浸濕，加PBST配制5%脫脂奶粉封閉，室溫搖床上搖2小時，4°C過夜，PBST洗膜后加入1: 2000稀釋的小鼠抗血清，室溫下孵育2小時，洗膜后加入1: 4000的羊抗鼠IgG的二抗(用HRP標記)，孵育I小時，再次PBST洗膜，使用ECL增強型免疫印跡檢測試劑盒(RPN2132，GE Healthcare)發(fā)光，X片曝光。圖3是注射了穩(wěn)定株細胞后的小鼠血清的免疫印跡檢測結果。免疫印跡實驗結果(圖3)顯示:在注射免疫了穩(wěn)定株細胞的小鼠血清中已經產生了可識別標簽蛋白RFP以及RFP-AGP原核表達的融合蛋白的抗體，同時，該多克隆抗體還可特異識別糖基化修飾蛋白，包括B16-RFP-AGP分泌到胞外的發(fā)生了糖基化修飾的AGP以及人血中天然存在的發(fā)生了糖基化修飾的AGP。而該抗體卻對原核表達的無糖基化修飾的AGP沒有識別。這表明該多克隆抗體具有了對糖基化修飾的蛋白有特異性的識別傾向。用Western blot的方法檢測小鼠多抗血清的效價，如在1: 2000稀釋或稀釋比例更高的情況下可以檢測0.5 μ L人血漿中的AGP即可用于進一步融合實驗。取免疫效價達到要求的C57BL/6J小鼠的脾臟，放在細胞篩上碾碎，按5: I的比例與SP2/0細胞經PEG1500進行融合。既融合后的細胞用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，經HAT進行篩選，挑出500個單克隆細胞在96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。使用原核表達純化的RFP以及去除了白蛋白和免疫球蛋白的人血清蛋白(Albumin/IgG Removal Kit,Cat.122642，CALBIOCHEM)分別作為抗原包板，對這些單克隆細胞的培養(yǎng)基上清進行ELISA篩選出分別識別不同抗原的抗體。得到的陽性克隆細胞先注射小鼠生產腹水，然后進行凍存。實施例5單克隆抗體的純化從_80°C冰箱或液氮罐中迅速取 出凍存管；迅速放入水浴鍋中快速攪動，使凍存液在2分鐘內全部融化成液體。用75%酒精擦拭凍存管。往15mL離心管中加入3mL血清培養(yǎng)基，將凍存液吸入離心管，1500轉/分鐘，離心5分鐘。棄上清，用完全培養(yǎng)基懸起細胞，培養(yǎng)于6孔板或瓶中。6孔板中培養(yǎng)基為3mL，第二天換液，再補足3mL ;培養(yǎng)瓶培養(yǎng)基為5mL。對數生長期細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起；計數大約5X 105，lmL。懸浮的細胞腹腔注射小鼠。一般7-10天后便可開始收集腹水，每隔2、3天可重復取，最終可收集1-1OmL/只。每次取出的腹水4000轉，10分鐘離心，中間為腹水。小心吸出腹水收集于離心管中，4°C保存。將腹水在4°C條件下，10000轉離心10分鐘，去除脂類物質。離心后吸取上清，并用偶聯緩沖液以1: 3 (腹水，偶連液比)稀釋，過0.22 μ m膜，用HiTrap ProteinAFF(17-5079-01,GE Healthcare)純化單克隆抗體。用5-10柱體積的偶聯緩沖液平衡柱子后上樣。再用5倍柱體積的偶聯緩沖液洗柱。在收集管中加入60-200 μ L中和液，利于維持抗體的生物活性，避免抗體失活。用5倍柱體積洗脫緩沖液洗脫抗體，并收集在步驟6的收集管中。可以得到純化較高的單克隆抗體。這些抗體被命名為BP1-AGP抗體。實施例6單克隆抗體親和常數的測定包被免疫用人血清中純化出的糖基化AGP(G9885，Sigma)以及原核表達純化的AGP，包被濃度為2 μ g/mL，100 μ L/孔，4°C包被過夜，I XPBST洗3次。每孔加200 μ L封閉液37°C封閉2小時，IXPBST洗3次?？笰GP單克隆抗體(BP1-AGP)以及商品單克隆抗體(A5566，Sigma)，從1: 200開始2倍梯度稀釋，最后I孔留空白對照，37°C孵育I小時，IXPBST洗3次。HRP標記的羊抗鼠二抗1: 20000稀釋，每孔100 μ L，37°C孵育I小時，I XPBST洗3次。顯色液100 μ L/孔顯色10分鐘，50 μ L/孔終止液終止反應。用酶標儀測定吸光值。親和常數
權利要求
1.一種制備單克隆抗體的方法，其特征在于制備特異性識別糖基化修飾的蛋白的抗體。
2.權利要求1所述的單克隆抗體的備方法，其特征在于其免疫方法將帶有外源目的基因穩(wěn)定細胞株與弗氏完全佐劑混合后，經皮下注射到C57BL/6J小鼠脾臟側的腰窩處。
3.權利要求1所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所使用的注射免疫用細胞株是近親動物來源的腫瘤細胞。
4.權利要求1所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述外源基因帶有RFP標簽。
5.權利要求1所述單克隆抗體的制備方法，其包括分泌蛋白和那些位于細胞質膜上，雖然不能被分泌到胞外，但有部分序列伸出到胞外的蛋白。
6.權利要求1所述單克隆抗體的制備方法中，其包括除糖基化蛋白質之外的其他翻譯后修飾形式蛋白質的特異性單克隆抗體的生產。
7.權利要求1所述單克隆抗體的制備方法中，其包括使用該思路通過除C57BL/6J小鼠之外的其他動物生產特異性抗體的方法。
全文摘要
本發(fā)明旨在提供一個制備針對糖基化修飾蛋白質的單克隆抗體雜交瘤的方法。該方法通過將穩(wěn)定表達外源目的基因的細胞株免疫與宿主細胞同來源的小鼠，使用糖基化和非糖基化的目的蛋白對單克隆抗體同時進行篩選，以獲得特異針對糖基化修飾蛋白的單克隆抗體雜交瘤。
文檔編號C07K16/18GK103102411SQ201210499609
公開日2013年5月15日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權日2009年6月11日
發(fā)明者任艷, 韋漢福, 潘秦, 劉玲, 徐寧志, 劉國振, 吳 琳, 劉斯奇 申請人:北京華大蛋白質研發(fā)中心有限公司