本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨主要是由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的無(wú)血管組織，主要依靠關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)和擠壓吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以軟骨損傷后自我修復(fù)能力比較弱，其損傷后的修復(fù)移植一直以來(lái)是醫(yī)學(xué)界的難題之一。近年來(lái)，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，自體軟骨移植在軟骨損傷的臨床治療在國(guó)內(nèi)外都有應(yīng)用。臨床研究對(duì)患者組織取材有限，并且也因?yàn)檐浌羌?xì)胞是終末分化細(xì)胞，體外增殖能力有限且易去分化，所以對(duì)體外軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增成為目前要解決的關(guān)鍵。
中國(guó)專利申請(qǐng)CN104480066A公開了一種軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基及軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，該軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、濃度為5-20％的血清、濃度為1-20ng/ml的血小板源性生長(zhǎng)因子和濃度為(1-5)*10-5M/Lβ-巰基乙醇。中國(guó)專利申請(qǐng)CN104120105A公開了一種用于培養(yǎng)老齡人群軟骨細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，添加劑濃度成分為：233μM-287μM維生素C，3.7μM-8.9μM亞油酸，9μM-17μM膽固醇，6nM-15nM地塞米松，43μM-58μM乙酰半胱氨酸，18μg/mL-32μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，22nM-52nM亞硒酸鈉，13μM-24μM泛酸鈉，28μM-43μM生物素，7μg/mL-18μg/mL胰島素，2ng/mL-9ng/mL表皮生長(zhǎng)因子，2ng/mL-9ng/mL成纖維生長(zhǎng)因子，2ng/mL-9ng/mL血小板衍生生長(zhǎng)因子，0.5％-2.5％人血清白蛋白。
現(xiàn)有的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基有的含有血清，因?yàn)檠迨怯珊芏啻笮〔煌锓肿咏M成的極為復(fù)雜的混合物，它能提供細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)所需要的生長(zhǎng)因子、激素、結(jié)合蛋白，并提供保護(hù)作用；而且本身血清中還富含有絲分裂因子，也利于細(xì)胞系和原代培養(yǎng)。但血清培養(yǎng)基存在一定的弊端，無(wú)法規(guī)避動(dòng)物血清中的異源體，如果使用動(dòng)物血清培養(yǎng)基培育出來(lái)的細(xì)胞，會(huì)存在人體異源體排斥和沖突。有的培養(yǎng)基雖然不含血清，但是，存在價(jià)格昂貴的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明提供的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基不含血清，排除了動(dòng)物來(lái)源的病原體污染，提高了軟骨細(xì)胞擴(kuò)增速度，大大縮短了軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間，本發(fā)明提供的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基的成本較低，有利于規(guī)?；瘧?yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：丁二胺2-3μM，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白10-20μg/mL，纖黏連蛋白15-25ng/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白25-35μg/mL，胰島素5-10μg/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1-10ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子3-15ng/mL，聚賴氨酸2-5mg/mL，花生四烯酸1-3μM，亞麻酸4-10μM，血清鋪展因子4-11ng/mL，維生素C15-25μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯10-30μg/mL，黃酮20-32μg/mL。
一種適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，優(yōu)選的方案是，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：丁二胺2.5μM，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白16μg/mL，纖黏連蛋白20ng/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白28μg/mL，胰島素8μg/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子10ng/mL，聚賴氨酸4mg/mL，花生四烯酸2μM，亞麻酸6μM，血清鋪展因子7ng/mL，維生素C 20μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯22μg/mL，黃酮25μg/mL。
優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM或F12培養(yǎng)基。
另外，本發(fā)明的還提供了所述適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，步驟如下：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入丁二胺、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、纖黏連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、聚賴氨酸、花生四烯酸、亞麻酸、血清鋪展因子、維生素C、銀膠菊內(nèi)酯和黃酮，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3-8％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至6.9-7.3，即得。
優(yōu)選地，所述步驟S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的氫氧化鈉溶液。
優(yōu)選地，所述步驟S2調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.2。
本發(fā)明提供的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，添加的添加劑包括丁二胺、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、聚賴氨酸等。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基中加入銀膠菊內(nèi)酯和黃酮，這兩種成分能與其他成分間相互作用，使軟骨細(xì)胞擴(kuò)增速度得到進(jìn)一步的提高。本發(fā)明提供的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基搭配合理，各成分間相互協(xié)調(diào)，共同作用，提高了軟骨細(xì)胞擴(kuò)增速度，大大縮短了軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基具有以下優(yōu)勢(shì)：
(1)本發(fā)明提供的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基提高了軟骨細(xì)胞擴(kuò)增速度，大大縮短了軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。
(2)本發(fā)明提供的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基不含血清，排除了動(dòng)物來(lái)源的病原體污染。
(3)本發(fā)明提供的是一種無(wú)動(dòng)物源性成分、成分確定的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，可以有效保證產(chǎn)品批次的質(zhì)量穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化。
(4)本發(fā)明提供的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基的成本較低，有利于規(guī)?；瘧?yīng)用。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明中DMEM培養(yǎng)基可購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，F(xiàn)12培養(yǎng)基可購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白可購(gòu)自Sigma公司，聚賴氨酸可購(gòu)自鄭州拜納佛生物工程股份有限公司，黃酮可購(gòu)自哈爾濱百愛(ài)科技有限公司，銀膠菊內(nèi)酯可購(gòu)自Sigma公司。
實(shí)施例1、一種適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基
所述適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：丁二胺2μM，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白10μg/mL，纖黏連蛋白15ng/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白25μg/mL，胰島素5μg/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子3ng/mL，聚賴氨酸2mg/mL，花生四烯酸1μM，亞麻酸4μM，血清鋪展因子4ng/mL，維生素C 15μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯10μg/mL，黃酮20μg/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入丁二胺、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、纖黏連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、聚賴氨酸、花生四烯酸、亞麻酸、血清鋪展因子、維生素C、銀膠菊內(nèi)酯和黃酮，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至6.9，即得。
實(shí)施例2、一種適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基
所述適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：丁二胺3μM，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白20μg/mL，纖黏連蛋白25ng/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白35μg/mL，胰島素10μg/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子10ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子15ng/mL，聚賴氨酸5mg/mL，花生四烯酸3μM，亞麻酸10μM，血清鋪展因子11ng/mL，維生素C25μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯30μg/mL，黃酮32μg/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入丁二胺、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、纖黏連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、聚賴氨酸、花生四烯酸、亞麻酸、血清鋪展因子、維生素C、銀膠菊內(nèi)酯和黃酮，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.3，即得。
實(shí)施例3、一種適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基
所述適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：丁二胺2.5μM，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白16μg/mL，纖黏連蛋白20ng/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白28μg/mL，胰島素8μg/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子10ng/mL，聚賴氨酸4mg/mL，花生四烯酸2μM，亞麻酸6μM，血清鋪展因子7ng/mL，維生素C 20μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯22μg/mL，黃酮25μg/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入丁二胺、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、纖黏連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、聚賴氨酸、花生四烯酸、亞麻酸、血清鋪展因子、維生素C、銀膠菊內(nèi)酯和黃酮，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.2，即得。
對(duì)比例1、一種適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基
所述適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：丁二胺2.5μM，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白16μg/mL，纖黏連蛋白20ng/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白28μg/mL，胰島素8μg/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子10ng/mL，聚賴氨酸4mg/mL，花生四烯酸2μM，亞麻酸6μM，血清鋪展因子7ng/mL，維生素C 20μg/mL，連翹苷元22μg/mL，黃酮25μg/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。
制備方法與實(shí)施例3類似。
與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將銀膠菊內(nèi)酯替換為連翹苷元。
對(duì)比例2、一種適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基
所述適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：丁二胺2.5μM，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白16μg/mL，纖黏連蛋白20ng/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白28μg/mL，胰島素8μg/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子10ng/mL，聚賴氨酸4mg/mL，花生四烯酸2μM，亞麻酸6μM，血清鋪展因子7ng/mL，維生素C 20μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯22μg/mL，異黃酮25μg/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。
制備方法與實(shí)施例3類似。
與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將黃酮替換為異黃酮。
試驗(yàn)例一、本發(fā)明適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)效果
1、試驗(yàn)對(duì)象：本發(fā)明實(shí)施例1-3所得適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1和對(duì)比例2所得適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基。
2、試驗(yàn)方法：
將獲取的軟骨組織切碎，然后在37℃用0.25％胰蛋白酶先消化40分鐘，再用0.1％Ⅱ型膠原酶消化過(guò)夜。在1200r/min離心5分鐘回收細(xì)胞，分別在本發(fā)明實(shí)施例1-3所得適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1和對(duì)比例2所得適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基中重懸。在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度鋪板。所有實(shí)驗(yàn)使用T75培養(yǎng)瓶。
細(xì)胞在達(dá)到50％到80％匯合時(shí)進(jìn)行傳代。在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞用PBS沖洗，收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)并重接種。在每次傳代結(jié)束時(shí)，測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)率并計(jì)算群體倍增數(shù)。結(jié)果如表1和表2所示。
表1：不同培養(yǎng)基測(cè)得細(xì)胞產(chǎn)率比較
由表1可以得出，在所有檢測(cè)的傳代中，生長(zhǎng)在本發(fā)明實(shí)施例1-3所得適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞產(chǎn)率，明顯高于生長(zhǎng)在對(duì)比例1和對(duì)比例2所得適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞產(chǎn)率。
表2：不同培養(yǎng)基測(cè)得生長(zhǎng)指數(shù)比較
由表2可以得出，在所有檢測(cè)的傳代中，生長(zhǎng)在本發(fā)明實(shí)施例1-3所得適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)，明顯大于生長(zhǎng)在對(duì)比例1和對(duì)比例2所得適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)。