專(zhuān)利名稱(chēng)：在無(wú)血清條件下培養(yǎng)原代細(xì)胞和擴(kuò)增病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法。將原代細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，該無(wú)血清培養(yǎng)基包含一種因子，該因子選自由生長(zhǎng)因子和粘附因子組成的組。該原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法可以是病毒，例如痘病毒，擴(kuò)增方法中的一個(gè)步驟。根據(jù)該后者的方法，將原代細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，該無(wú)血清培養(yǎng)基包含一種因子，該因子選自由生長(zhǎng)因子和粘附因子組成的組。細(xì)胞然后用病毒感染，并將感染的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到子代病毒產(chǎn)生。
背景技術(shù)：
大多數(shù)病毒疫苗，例如減毒或重組病毒，是由細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)制造的。用于病毒/疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞可以是細(xì)胞系，即在體外連續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，或者作為生物反應(yīng)器中的單細(xì)胞懸液培養(yǎng)物，或者作為組織培養(yǎng)瓶或滾瓶的細(xì)胞支持物表面上的單細(xì)胞層。一些用于生產(chǎn)病毒的細(xì)胞系的例子是用于制造脊髓灰質(zhì)炎病毒的人胎肺細(xì)胞系MRC-5，和用于制造麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒和風(fēng)疹病毒(MMR II)的人胎肺細(xì)胞系WI-38(Merk Sharp&Dohme)。
不但細(xì)胞系，而且原代動(dòng)物細(xì)胞也用于制造疫苗。用于病毒生產(chǎn)的原代細(xì)胞的一個(gè)例子是雞胚成纖維細(xì)胞(CEF細(xì)胞)。這些細(xì)胞用于生產(chǎn)麻疹和日本腦炎病毒(Pasteur Merieux)、流行性腮腺炎病毒(由Provaccine制造)、狂犬病病毒(由Chiron Berhing GmbH&Co.制造)、黃熱病病毒(由Aprilvax制造)、流感病毒(由Wyeth Labs和SmithKline&Beecham制造)和改良的安卡拉牛痘病毒(MVA)。
CEF細(xì)胞經(jīng)常被使用，因?yàn)樵S多病毒疫苗是通過(guò)在CEF細(xì)胞中連續(xù)傳代以使毒性致病性病毒減毒而制成的。減毒的病毒不再致病，但仍能刺激針對(duì)病毒的毒性形式的強(qiáng)有力的保護(hù)性免疫。該類(lèi)型病毒的一個(gè)例子是MVA。該病毒在人和大多數(shù)動(dòng)物中被嚴(yán)格地復(fù)制受限。MVA正被開(kāi)發(fā)成疫苗載體，因?yàn)樗苡糜诒磉_(dá)源自在人中致病的各種介質(zhì)的抗原。例如MVA的減毒病毒優(yōu)選不在人細(xì)胞上繁殖，因?yàn)榭紤]到病毒在人來(lái)源的細(xì)胞中可能再次成為具有復(fù)制能力的。然而，已恢復(fù)在人細(xì)胞中復(fù)制能力的病毒如果投藥給人可能會(huì)對(duì)健康造成危險(xiǎn)，特別是如果個(gè)體是免疫受損的。出于這個(gè)原因，一些減毒的病毒，例如MVA，如果想要供人使用，則嚴(yán)格地從CEF細(xì)胞制造。
此外，CEF細(xì)胞被用于那些只在該細(xì)胞上生長(zhǎng)的病毒。這樣的病毒的例子特別是鳥(niǎo)類(lèi)病毒如禽痘病毒，特別是金絲雀痘病毒、ALVAC、禽痘病毒和NYVAC。
在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞系和原代細(xì)胞需要特殊的生長(zhǎng)和維持的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能支持(I)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中細(xì)胞的復(fù)制和(II)一旦細(xì)胞不再分裂，即當(dāng)細(xì)胞處于穩(wěn)定期時(shí)的細(xì)胞維持。一般使用的細(xì)胞培養(yǎng)基包含富含鹽的溶液，該溶液含有維生素、氨基酸、必需微量元素和糖。支持細(xì)胞生長(zhǎng)和維持所需的生長(zhǎng)激素、酶和生物活性蛋白質(zhì)通常以動(dòng)物血液來(lái)源的血清產(chǎn)品的形式作為補(bǔ)充物加入到培養(yǎng)基中。動(dòng)物血液來(lái)源的血清產(chǎn)品的例子是胎牛血清、小雞血清、馬血清和豬血清。這些血清源自分級(jí)分離的血液，在該血液中紅細(xì)胞和白細(xì)胞已被除去。原代細(xì)胞，如CEF細(xì)胞，比細(xì)胞系甚至更依賴(lài)于動(dòng)物血清來(lái)源。因此，原代細(xì)胞通常被培養(yǎng)在包含5-10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，大多數(shù)情況為胎牛血清(FCS)中。
動(dòng)物血清不僅包含細(xì)胞生長(zhǎng)所需的因子，而且包含細(xì)胞所需的因子，這些細(xì)胞以貼壁細(xì)胞形式自然生長(zhǎng)來(lái)附著于培養(yǎng)容器的細(xì)胞支持物表面。因此，對(duì)于貼壁細(xì)胞來(lái)說(shuō)，將足夠的血清加入到培養(yǎng)基中是關(guān)鍵性的，以使得它們生長(zhǎng)并形成單細(xì)胞層。
令人遺憾的是，牛/胎牛血清以及來(lái)自其它動(dòng)物的血清可能包含外來(lái)致病介質(zhì)例如病毒。存在一種潛在的危險(xiǎn)，即這些致病介質(zhì)被傳播給動(dòng)物/人，該動(dòng)物/人將要用細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的疫苗或任何其它藥物產(chǎn)物治療或接種。如果將細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物投藥給免疫受損的人，則這是特別相關(guān)的。與一般使用的牛血清補(bǔ)充物相關(guān)的許多潛在的主要問(wèn)題之一是，有可能將引起牛海綿狀腦病(BSE)的介質(zhì)傳播給與細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的產(chǎn)物進(jìn)行接觸的動(dòng)物/人。
考慮到與在細(xì)胞培養(yǎng)中使用動(dòng)物血清相關(guān)的可能危險(xiǎn)，已經(jīng)清楚，人們非常期待不使用動(dòng)物產(chǎn)物的制造過(guò)程。
為了這一目的，不一定非要補(bǔ)充有動(dòng)物血清的特殊培養(yǎng)基已分別為持續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞系和為在持續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞系中生產(chǎn)病毒而被加以開(kāi)發(fā)。能被用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞系的這樣的無(wú)血清培養(yǎng)基的一個(gè)例子是由Gibco BRL/LifeTechnologies制造的VP-SFM。根據(jù)制造商的信息，VP-SFM特別地為VERO、COS-7、MDBK、Hep2、BHK-21和其它重要細(xì)胞系的生長(zhǎng)(Price，P.和Evege，E.Focus 1997，1967-69)和為在所述細(xì)胞系中病毒的生產(chǎn)而設(shè)計(jì)。得不到關(guān)于在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代細(xì)胞的信息。
US 5,503,582公開(kāi)了在包含4％小牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)CEF細(xì)胞、隨后在無(wú)血清培養(yǎng)基中用禽痘病毒感染細(xì)胞。Spataro，A.C.et al.，J.Cell.Sci.1976；21，407-413公開(kāi)了一旦形成單細(xì)胞層，CEF細(xì)胞能在無(wú)血清培養(yǎng)基中維持24小時(shí)。因此，根據(jù)這兩件出版物，用于接種后培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基包含血清。只有用來(lái)維持已附著于表面和已達(dá)到穩(wěn)定期的細(xì)胞，才使用無(wú)血清培養(yǎng)基。如果用常規(guī)培養(yǎng)基，例如培養(yǎng)基199或無(wú)血清的RPMI-1640接種，沒(méi)有單細(xì)胞層形成，且細(xì)胞在培養(yǎng)基中形成不能生活的聚集物。
WO 98/15614提到用于體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的一種特殊的無(wú)血清培養(yǎng)基。能在如WO 98/15614中公開(kāi)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞是動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞，包括獲自哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、昆蟲(chóng)或魚(yú)類(lèi)的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是人類(lèi)來(lái)源的原代細(xì)胞。沒(méi)有涉及原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞。
US 5,405,772公開(kāi)了用于細(xì)胞增殖和發(fā)育的無(wú)血清培養(yǎng)基。細(xì)胞優(yōu)選為造血細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞。沒(méi)有提及原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞。
WO 98/04680公開(kāi)了用于依賴(lài)貼壁哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如細(xì)胞系BHK、Vero或MRC-5的生長(zhǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基。WO 98/04680既沒(méi)有涉及原代細(xì)胞也沒(méi)有涉及鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種使得原代細(xì)胞得以培養(yǎng)的方法，所述原代細(xì)胞特別是在無(wú)血清培養(yǎng)基中的原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞，其中該方法使得(I)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中細(xì)胞得以生長(zhǎng)和(II)在穩(wěn)定期中細(xì)胞得以維持。此外，如果細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，則培養(yǎng)基可以?xún)?yōu)選使得(III)貼壁細(xì)胞附著于細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面。本發(fā)明的更進(jìn)一步目的是提供通過(guò)在無(wú)血清條件下使用原代細(xì)胞生產(chǎn)病毒的方法。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供培養(yǎng)原代細(xì)胞的方法，其特征在于將細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，所述無(wú)血清培養(yǎng)基包含一種因子，所述因子選自由生長(zhǎng)因子和粘附因子組成的組。
根據(jù)本發(fā)明，以貼壁細(xì)胞形式自然生長(zhǎng)的原代細(xì)胞在接種后附著于細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面，且在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中生長(zhǎng)，直到形成單細(xì)胞層。根據(jù)本發(fā)明，靜息細(xì)胞可被維持在細(xì)胞附著和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期間所使用的培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的方法不限于形成單細(xì)胞層的細(xì)胞。根據(jù)可供選擇的另一實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的方法可被用于所有其它類(lèi)型的原代細(xì)胞，例如在懸浮培養(yǎng)物中自然生長(zhǎng)的細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞或其它類(lèi)型的血細(xì)胞)或在自然狀態(tài)下應(yīng)該以貼壁細(xì)胞的形式生長(zhǎng)但已適合在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞。
如下所示，這些細(xì)胞也能用于病毒的無(wú)血清擴(kuò)增，這些病毒有可能被用作疫苗。
預(yù)料不到的是，以貼壁細(xì)胞的形式自然生長(zhǎng)的原代細(xì)胞(I)能有效地附著于細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面，而不形成不能接受的量的聚集物，和(II)能在無(wú)血清時(shí)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)，因?yàn)橐话阏J(rèn)為原代細(xì)胞依賴(lài)于血清中包含的大量不同因子和成分。此外，當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，貼壁細(xì)胞被認(rèn)為形成不附著于細(xì)胞培養(yǎng)容器表面的不能生活的聚集物。因此，預(yù)料不到的是，為達(dá)到貼壁原代細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)，在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入選自由生長(zhǎng)因子和粘附因子中組成的組中的一種因子就足夠了。此外，也是預(yù)料不到的是，原代細(xì)胞可用根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的培養(yǎng)基在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。而且，令人驚訝的是，在包含選自由生長(zhǎng)因子和粘附因子組成的組中的一種因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中，原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞，例如雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)能被加以培養(yǎng)以附著于細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面，而不形成無(wú)法接受的量的聚集物，因?yàn)橐阎B(niǎo)類(lèi)細(xì)胞在不包含生長(zhǎng)因子或粘附因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)非常差，即，預(yù)料不到的是，通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入選自生長(zhǎng)因子和附著因子中的一種因子，原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞的不良生長(zhǎng)特性可被顯著改善。
本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“原代細(xì)胞”對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。不限于以下定義，術(shù)語(yǔ)“原代細(xì)胞”是指剛分離自動(dòng)物或人的組織、器官或有機(jī)體的細(xì)胞，其中細(xì)胞不能持續(xù)地且無(wú)限期地復(fù)制和分裂。通常，原代細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中分裂少于100次，經(jīng)常少于50次，經(jīng)常少于25次。因此，原代細(xì)胞沒(méi)有經(jīng)歷無(wú)限增殖化過(guò)程。原代細(xì)胞的例子是臍帶血淋巴細(xì)胞和人或動(dòng)物成纖維細(xì)胞。動(dòng)物成纖維細(xì)胞的優(yōu)選例子是鳥(niǎo)類(lèi)成纖維細(xì)胞，最優(yōu)選的是雞胚成纖維細(xì)胞(CEF細(xì)胞)。對(duì)于原代人成纖維細(xì)胞，一個(gè)優(yōu)選的例子是人包皮成纖維細(xì)胞。
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，如何分離原代細(xì)胞的方法是熟知的。一般地，原代細(xì)胞培養(yǎng)物直接來(lái)源于組織、器官或胚胎。組織、器官或胚胎經(jīng)過(guò)蛋白酶處理而獲得單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞然后按照根據(jù)本發(fā)明的方法在體外培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。
更特別地，CEF細(xì)胞獲自用蛋白酶消化的雞胚。根據(jù)本發(fā)明，CEF細(xì)胞以附著于固體細(xì)胞支持物表面的貼壁細(xì)胞的形式生長(zhǎng)得最好。這些細(xì)胞開(kāi)始復(fù)制并建立單細(xì)胞層。如果CEF細(xì)胞(胚胎消化后)在體外用不含動(dòng)物血清的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)，則細(xì)胞偶爾會(huì)附著于固體細(xì)胞支持物表面，但不會(huì)復(fù)制以形成細(xì)胞的匯合單細(xì)胞層，且隨時(shí)間會(huì)慢慢地從固體培養(yǎng)支持物表面分離。相反，如果CEF細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明的方法加以培養(yǎng)，則細(xì)胞附著于固體支持物，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中生長(zhǎng)直到形成單細(xì)胞層，且能在穩(wěn)定期中維持幾天。
在關(guān)于貼壁原代細(xì)胞的上下文中，術(shù)語(yǔ)在無(wú)血清培養(yǎng)基中“培養(yǎng)細(xì)胞”是指在無(wú)血清培養(yǎng)基中將細(xì)胞接種到培養(yǎng)容器中，是指細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)直到形成單細(xì)胞層，和/或是指一旦形成單細(xì)胞層后在無(wú)血清培養(yǎng)基中維持細(xì)胞。更優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)在無(wú)血清培養(yǎng)基中“培養(yǎng)細(xì)胞”是指一種方法，其中上面提到的所有步驟在無(wú)血清培養(yǎng)基中加以完成，以至于在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間不出現(xiàn)任何動(dòng)物血清產(chǎn)物。因此，在更一般的意思上，術(shù)語(yǔ)“在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞”是指導(dǎo)致單細(xì)胞層形成的所有培養(yǎng)基都是無(wú)血清培養(yǎng)基這一事實(shí)。所有上面步驟中使用的培養(yǎng)基可以包含選自生長(zhǎng)因子和粘附因子中的一種因子。然而，僅僅將這樣一種因子加入到用于細(xì)胞的附著和/或在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中可能就足夠了。
在關(guān)于在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞的上下文中，術(shù)語(yǔ)在無(wú)血清培養(yǎng)基中“培養(yǎng)細(xì)胞”是指在無(wú)血清培養(yǎng)基中將細(xì)胞接種到培養(yǎng)容器中，細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)，和/或一旦得到無(wú)進(jìn)一步復(fù)制發(fā)生時(shí)的飽和密度，細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中維持。更優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)在無(wú)血清培養(yǎng)基中“培養(yǎng)細(xì)胞”是指一種方法，其中用無(wú)血清培養(yǎng)基實(shí)施上面提到的所有步驟，以至于在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)期間不出現(xiàn)任何動(dòng)物血清產(chǎn)物。所有上面步驟中使用的培養(yǎng)基可以?xún)?yōu)選包含選自生長(zhǎng)因子的組中的一種因子。然而，僅僅將這樣一種因子加入到用于細(xì)胞接種和/或在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中可能就足夠了。正如下面所更詳細(xì)地解釋的，如果選擇合適的孵育條件(例如通過(guò)運(yùn)用“波浪”(wave)孵育)，通常以附著細(xì)胞的形式生長(zhǎng)的細(xì)胞也有可能以懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的形式培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的方法也適用于這種類(lèi)型的孵育。
術(shù)語(yǔ)“無(wú)血清”培養(yǎng)基是指任何不包含動(dòng)物或人來(lái)源的血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。合適的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。這些培養(yǎng)基包含鹽、維生素、緩沖液、能源、氨基酸和其它物質(zhì)。適用于CEF細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)的培養(yǎng)基的一個(gè)例子是培養(yǎng)基199(Morgan，Morton和Parker；Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1950，73，1；和其它東西一起獲自L(fǎng)ife Technologies)。
根據(jù)本發(fā)明的方法使用的培養(yǎng)基，特別是用于貼壁細(xì)胞如CEF細(xì)胞的培養(yǎng)基，包含選自生長(zhǎng)因子和粘附因子中的一種因子。粘附因子的一個(gè)例子是纖連蛋白。
然而，對(duì)于那些自然狀態(tài)下以貼壁細(xì)胞的形式生長(zhǎng)、然而卻培養(yǎng)在懸浮培養(yǎng)物中(這是可能的，例如對(duì)于CEF細(xì)胞)的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，特別優(yōu)選使用選自生長(zhǎng)因子的組中的一種因子。對(duì)此類(lèi)培養(yǎng)有用的生長(zhǎng)因子的例子是重組牛、小鼠、小雞或人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。最優(yōu)選的是重組人EGF(rh-EGF)(Chemicon Int.，目錄號(hào)GF001)。
對(duì)于在懸浮培養(yǎng)物中自然生長(zhǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)基可以?xún)?yōu)選包含選自包括EGF的生長(zhǎng)因子的組中的一種因子。最優(yōu)選地，用于此類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)因子是特異于非貼壁細(xì)胞的因子。那些生長(zhǎng)因子的例子是白介素、GM-CSF、G-CSF和其它。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易地確定哪一類(lèi)因子適合于哪一類(lèi)細(xì)胞。
如果加入無(wú)血清培養(yǎng)基的因子是EGF，特別是rh-EGF，則優(yōu)選以1-50ng/ml的濃度加入培養(yǎng)基，更優(yōu)選5-20ng/ml。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到這一事實(shí)，即為了獲得最佳結(jié)果，不同的細(xì)胞類(lèi)型可能在血清中需要稍微不同的EGF濃度。
如果加入無(wú)血清培養(yǎng)基的粘附因子是纖連蛋白(例如Chemicon Int.；人血漿纖連蛋白；目錄號(hào)FC010)，則優(yōu)選以1-50的濃度加入培養(yǎng)基，更優(yōu)選1-10μg/cm2細(xì)胞培養(yǎng)容器表面。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到這一事實(shí)，即為了獲得最佳結(jié)果，不同的細(xì)胞類(lèi)型可能在血清中需要稍微不同的EGF濃度。
根據(jù)本發(fā)明，僅將選自生長(zhǎng)因子和粘附因子中的一種因子加入到培養(yǎng)基中就足夠了，特別是如果細(xì)胞是貼壁細(xì)胞的話(huà)。然而，將選自生長(zhǎng)因子和粘附因子中的兩種或更多因子加入到培養(yǎng)基中也是可能的。培養(yǎng)基可以?xún)?yōu)選包含EGF和纖連蛋白，優(yōu)選在上面所定義的濃度范圍，特別是如果原代細(xì)胞是貼壁細(xì)胞如CEF細(xì)胞的話(huà)。
培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含一種或更多添加物，該添加物選自微生物提取物、植物提取物和源自非哺乳類(lèi)動(dòng)物的提取物。微生物提取物優(yōu)選為酵母提取物或酵母提取液(yeastolate)超濾液。植物提取物優(yōu)選為水稻提取物或大豆提取物。源自非哺乳類(lèi)動(dòng)物的提取物優(yōu)選為魚(yú)類(lèi)提取物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，可將天冬酰胺加入到商業(yè)上可獲得的無(wú)血清培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基已加入了選自生長(zhǎng)因子和粘附因子中的一種因子。更優(yōu)選地，將天冬酰胺加入到用病毒感染期間使用的培養(yǎng)基中(見(jiàn)下面)。商業(yè)上的無(wú)血清培養(yǎng)基通常包含0.3-1.0mM濃度范圍的天冬酰胺。用來(lái)補(bǔ)充到培養(yǎng)基中的天冬酰胺的優(yōu)選量為0.5-1.5mM的范圍。最優(yōu)選的是1mM天冬酰胺補(bǔ)充物。培養(yǎng)基中天冬酰胺的總濃度優(yōu)選小于2mM，更優(yōu)選為0.8-1.8mM范圍。培養(yǎng)基中天冬酰胺的最優(yōu)選濃度為1.3mM。
此外，谷氨酰胺可優(yōu)選加入到培養(yǎng)基中。更優(yōu)選地，將谷氨酰胺加入到用病毒感染期間使用的培養(yǎng)基中(見(jiàn)下面)。用于對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充的谷氨酰胺的優(yōu)選量在1-5mM范圍，更優(yōu)選在2-4mM范圍。由于大多數(shù)商業(yè)性可獲得的培養(yǎng)基不包含谷氨酰胺，所指示的范圍也相當(dāng)于培養(yǎng)基中的優(yōu)選總濃度。
根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方式，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增病毒的方法，包含以下步驟在第一步中，根據(jù)上述方法培養(yǎng)原代細(xì)胞，即，將原代細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，該無(wú)血清培養(yǎng)基依據(jù)細(xì)胞類(lèi)型包含選自由生長(zhǎng)因子和粘附因子組成的組中的一種因子。根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方式，所有的條件、定義、優(yōu)選的實(shí)施方式和對(duì)于培養(yǎng)上述原代細(xì)胞的方法的描述所給出的從優(yōu)選到最優(yōu)選實(shí)施方式的順序，也適用于根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方式的病毒擴(kuò)增方法的第一步的定義。在第二步中，原代細(xì)胞用病毒感染。在第三步中，感染的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中孵育，直到子代病毒產(chǎn)生。
術(shù)語(yǔ)“病毒擴(kuò)增”是用來(lái)解釋?zhuān)鶕?jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選用來(lái)由于病毒在感染細(xì)胞中的生產(chǎn)性病毒復(fù)制而增加病毒數(shù)量。換句話(huà)說(shuō)，輸出病毒與輸入病毒的比率應(yīng)優(yōu)選高于1。因此，根據(jù)本發(fā)明，針對(duì)特定病毒選擇那些原代細(xì)胞，在這些原代細(xì)胞中病毒能生產(chǎn)性地復(fù)制。術(shù)語(yǔ)“繁殖性復(fù)制”是指這一的事實(shí)，即特定病毒在特定原代細(xì)胞中復(fù)制到產(chǎn)生感染性子代病毒的程度，其中輸出病毒與輸入病毒的比率高于1。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，哪些病毒能在哪類(lèi)原代細(xì)胞中生產(chǎn)性地復(fù)制。舉例來(lái)說(shuō)，如果要擴(kuò)增的病毒是人巨細(xì)胞病毒，則原代細(xì)胞可以是人包皮成纖維細(xì)胞；如果要擴(kuò)增的病毒是麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、狂犬病病毒、日本腦炎病毒、黃熱病病毒、流感病毒或痘病毒如牛痘病毒，特別是改良的安卡拉牛痘病毒(MVA)，則原代細(xì)胞可以是CEF細(xì)胞。
根據(jù)本實(shí)施方式的第二步感染原代細(xì)胞的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。舉例來(lái)說(shuō)，可以簡(jiǎn)單地將病毒加入到培養(yǎng)基中。或者，可以除去培養(yǎng)基且可以將病毒加入到新鮮培養(yǎng)基中，隨后將培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中。為獲得有效感染，病毒/培養(yǎng)基懸液的量應(yīng)盡可能低，以獲得高病毒濃度。病毒附著后，可以加入額外的培養(yǎng)基。
在第三步中，將細(xì)胞接種在無(wú)血清培養(yǎng)基中，直到產(chǎn)生子代病毒。
病毒擴(kuò)增方法中第二步和第三步中使用的無(wú)血清培養(yǎng)基可以是前面已經(jīng)使用的同一培養(yǎng)基，即依據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，包含選自生長(zhǎng)因子和粘附因子中的一種因子的無(wú)血清培養(yǎng)基。然而，為節(jié)約成本，也可能在第二步和第三步中的一步或兩步中使用這樣的無(wú)血清培養(yǎng)基，該無(wú)血清培養(yǎng)基不含選自生長(zhǎng)因子和粘附因子中的一種因子。
在所有階段，可以用如上面概述的天冬酰胺和/或谷氨酰胺補(bǔ)充培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基中天冬酰胺的總濃度優(yōu)選如上面所定義的。
子代病毒可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法濃縮和純化。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，擴(kuò)增病毒的方法被用來(lái)擴(kuò)增痘病毒。因此，根據(jù)這一優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明涉及擴(kuò)增痘病毒的方法，包含以下步驟(I)根據(jù)上述方法培養(yǎng)原代細(xì)胞，即一種方法，其中將原代細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，所述無(wú)血清培養(yǎng)基依據(jù)細(xì)胞類(lèi)型包含選自由生長(zhǎng)因子和粘附因子組成的組中的一種因子，(II)用痘病毒感染原代細(xì)胞，和(III)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)被感染的細(xì)胞直到產(chǎn)生子代病毒。
預(yù)料不到的是，痘病毒能在在無(wú)血清條件下培養(yǎng)的細(xì)胞上擴(kuò)增，因?yàn)橛靡阎臒o(wú)血清培養(yǎng)基細(xì)胞生長(zhǎng)得非常差。因此，預(yù)期在痘病毒顯著擴(kuò)增發(fā)生之前，與痘病毒感染相關(guān)的額外應(yīng)激會(huì)殺死已經(jīng)受應(yīng)激的細(xì)胞。
痘病毒優(yōu)選為正痘病毒。正痘病毒的例子是禽痘病毒和牛痘病毒。
術(shù)語(yǔ)“禽痘病毒”(avipoxvirus)是指任何禽痘病毒，如禽痘病毒、金絲雀痘病毒、Uncopoxvirus、八哥痘病毒、鴿痘病毒、鸚鵡痘病毒、鵪鶉痘病毒、孔雀痘病毒、企鵝痘病毒、麻雀痘病毒、椋鳥(niǎo)痘病毒和火雞痘病毒。優(yōu)選的禽痘病毒是金絲雀痘病毒和禽痘病毒。
金絲雀痘病毒的一個(gè)例子是Rentschler株。一種被稱(chēng)為ALVAC(US5,766,598)的噬菌斑純化的金絲雀痘株根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條件被保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)(ATCC)，入藏號(hào)為VR-2547。另一種金絲雀痘株是叫做LF2 CEP 524 24 10 75的商業(yè)性金絲雀痘疫苗株，獲自InstituteMerieux，Inc.。
禽痘病毒的例子是FP-1、FP-5和TROVAC株(US 5,766,598)。FP-1是一個(gè)Duvette毒株，被改良以便在1天齡小雞中用作疫苗。該株是商業(yè)性禽痘病毒疫苗株，叫做O DCEP 25/CEP67/23091980年10月，可獲自InstituteMerieux，Inc.。FP-5是雞胚來(lái)源的一種商業(yè)性的禽痘病毒疫苗株，可獲自American Scientific Laboratories(Division of Schering Corp.)Madison，Wisconsin，美國(guó)獸醫(yī)許可號(hào)165，序列號(hào)30321。
牛痘病毒株的例子是天壇(Temple of Heaven)、哥本哈根(Copenhagen)、巴黎(Paris)、布達(dá)佩斯(Budapest)、Dairen、Gam、MRIVP、Per、塔什干(Tashkent)、TBK、Tom、伯爾尼(Bern)、Patwadangar、BIEM、B-15、Lister、EM-63、紐約市衛(wèi)生局(New YorkCity Board of Health)、Elstree、Ikeda和WR株。本發(fā)明優(yōu)選用改良的安卡拉牛痘病毒(MVA)(Sutter，G.et al. ，Vaccine 121032-40)完成。一種典型的MVA株是MVA575，其已被保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)，保藏號(hào)為ECACC V00120707。最優(yōu)選的是MVA-BN或其衍生物，其已在PCT申請(qǐng)PCT/EP01/13628中被描述，該申請(qǐng)于2001年11月22日在歐洲專(zhuān)利局提交，名稱(chēng)為“改良的安卡拉牛痘病毒變種”。MVA-BN已被保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)，保藏號(hào)為ECACC V00083008。上面所引用的PCT申請(qǐng)中公開(kāi)了MVA-BN的特征、對(duì)使評(píng)價(jià)一種MVA是否是MVA-BN或其衍生物成為可能的生物學(xué)測(cè)定的描述、和使獲得MVA-BN或其衍生物成為可能的方法，此PCT申請(qǐng)包含在本文中作為參考。要根據(jù)本發(fā)明的方法加以擴(kuò)增的病毒可以是野生型病毒、減毒病毒或重組病毒。
術(shù)語(yǔ)“重組病毒”是指任何病毒，該病毒具有插入到病毒基因組中的異源基因，該異源基因在自然狀態(tài)下不是病毒基因組的一部分。異源基因可以是治療基因、編碼包含至少一個(gè)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的表位的肽的基因、反義表達(dá)盒或核酶基因。構(gòu)建重組病毒的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。最優(yōu)選的痘病毒載體是MVA，特別是MVA575和MVA-BN(見(jiàn)上面)。
“減毒病毒”是一種病毒，其來(lái)源于致病性病毒，但相比于非減毒的親本病毒其在對(duì)宿主有機(jī)體的感染上導(dǎo)致較低的死亡率和/或發(fā)病率。減毒痘病毒的例子對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。減毒牛痘病毒的一個(gè)例子是MVA株，特別是已以保藏號(hào)V00083008保藏在ECACC的毒株(見(jiàn)上面)。
正如上面指出的，對(duì)于痘病毒，原代細(xì)胞可以?xún)?yōu)選為原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞，例如CEF細(xì)胞，或原代鴨胚成纖維細(xì)胞。同樣，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道哪些原代細(xì)胞適合哪些痘病毒的擴(kuò)增。CEF細(xì)胞特別優(yōu)選用于MVA的擴(kuò)增。對(duì)于CEF細(xì)胞中MVA的擴(kuò)增，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式是選擇一種或兩種選自EGF和纖連蛋白中的因子。
如果根據(jù)本發(fā)明的方法被用來(lái)在CEF細(xì)胞中擴(kuò)增MVA，則優(yōu)選培養(yǎng)基的起始pH在大約7.0至大約8.5的范圍。特別優(yōu)選的是起始pH為7.0。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及病毒，特別是通過(guò)上述方法獲得的痘病毒。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，痘病毒是牛痘病毒，最優(yōu)選的是MVA株，例如MVA-BN。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含病毒的組合物，特別是用根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的痘病毒。正如上面指出的，痘病毒優(yōu)選為牛痘病毒，最優(yōu)選為MVA株，例如MVA-BN。由于擴(kuò)增病毒所使用的方法，該組合物不含任何動(dòng)物血清中包含的產(chǎn)物和/或有傳染性的介質(zhì)。相反，包含根據(jù)常規(guī)方法生產(chǎn)的病毒的組合物包含源自動(dòng)物血清的殘余化合物。對(duì)于包含痘病毒，例如牛痘病毒株，特別是MVA株例如MVA-BN的組合物來(lái)說(shuō)，尤其是這樣。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種病毒，特別是如上面所定義的作為藥物或疫苗的病毒。如果病毒是野生型病毒或減毒病毒，則該病毒能被用于針對(duì)這樣的病毒的接種。為此目的，特別優(yōu)選減毒病毒。如果病毒是表達(dá)蛋白質(zhì)的重組病毒，該蛋白質(zhì)表達(dá)自對(duì)病毒基因組來(lái)說(shuō)異源的基因，，則可能針對(duì)這樣的病毒和/或針對(duì)所表達(dá)的異源蛋白質(zhì)接種。如果重組病毒表達(dá)治療性基因例如反義RNA或核酶，病毒可被用作藥物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上面所定義的病毒或如上面所定義的組合物用于制造疫苗的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種對(duì)有需要的動(dòng)物，包括人，進(jìn)行治療或接種的方法，包含將上面所定義的病毒或上面所定義的組合物投藥給動(dòng)物或人體。
具體實(shí)施例方式
如果沒(méi)有另外指出，在以下實(shí)施例中無(wú)血清培養(yǎng)基是培養(yǎng)基199(LifeTechnologies)。加入的EGF通常為獲自Chemicon的重組人EGF。纖連蛋白(FN)獲自Chemicon。
實(shí)施例1雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的制備無(wú)特定病原體的(SPF)受精雞蛋在4℃下貯存不超過(guò)12天。將雞蛋放入培養(yǎng)箱中，并在37.8℃±8℃下孵育10-12天。每最多11個(gè)雞蛋一個(gè)培養(yǎng)皿用10-20ml PBS制備。將雞蛋放入專(zhuān)用的雞蛋紙盒中，并用Bacillol廣泛處理以對(duì)雞蛋殼外部消毒。干燥后，在蛋上造洞，并小心地除去殼。儲(chǔ)存尿囊絨膜以被用。拎起胚胎的腳以將其提起，然后將頭砍去。然后將胚胎轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中。除去腳后，軀干再次用PBS清洗。將最多11個(gè)軀干放入一個(gè)20ml的塑料注射器中并擠入錐形瓶中。每個(gè)軀干加入5ml預(yù)熱的(37℃)胰蛋白酶/EDTA溶液，且溶液用磁攪拌器在室溫下用無(wú)血清培養(yǎng)基攪拌15分鐘。將胰蛋白酶消化的細(xì)胞通過(guò)一層篩眼注入燒杯中。將所有細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)225ml離心管中，并在臺(tái)式離心機(jī)中在20℃、470×g下離心7分鐘以離心下來(lái)。在棄去上清液后，通過(guò)充分地上下移液，將沉淀重懸浮于1ml包含每個(gè)軀干10ng/ml EGF的剛剛預(yù)熱的(37℃)無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。加入剛剛預(yù)熱的(37℃)包含10ng/ml EGF的無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基至總體積為150ml。重復(fù)離心步驟。如上所述除去上清液并重懸沉淀。加入包含10ng/ml EGF的剛剛預(yù)熱的(37℃)無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基至總體積為100ml。如以下部分中描述地計(jì)數(shù)細(xì)胞。將所需數(shù)量的細(xì)胞接種在盛有包含10ng/ml EGF的無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基的滾瓶中并在37℃下孵育。接種后第四天細(xì)胞可用于病毒感染。
實(shí)施例2計(jì)算細(xì)胞密度取細(xì)胞懸液的一個(gè)樣品(見(jiàn)CEF制備部分)，并與1體積臺(tái)盼藍(lán)混合，致使最終細(xì)胞數(shù)為血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的每16個(gè)小方格內(nèi)20-100個(gè)細(xì)胞，該血細(xì)胞計(jì)數(shù)器由Fuchs-Rosenthal提供，名稱(chēng)為血細(xì)胞計(jì)數(shù)快速閱讀102的(1∶2-1∶10稀釋)。為了防止細(xì)胞重新聚合/沉降，重懸細(xì)胞后立即取樣。用臺(tái)盼藍(lán)孵育幾分鐘以使染料完全進(jìn)入死細(xì)胞后，將10μl細(xì)胞懸液加入到血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中。只有白色的、活細(xì)胞才在光學(xué)顯微鏡下被計(jì)數(shù)，該光學(xué)顯微鏡使用10×物鏡。總體上，計(jì)算3個(gè)具代表性的大方格，該大方格由3×16個(gè)小方格組成。從每個(gè)大方格中，只有呈L形的兩個(gè)邊界被包括在計(jì)數(shù)內(nèi)。取計(jì)數(shù)細(xì)胞的平均數(shù)，且用以下公式計(jì)算最終細(xì)胞濃度平均細(xì)胞數(shù)目×稀釋×104＝細(xì)胞/ml。最后將細(xì)胞懸液稀釋至所需的工作濃度。
實(shí)施例3將選自生長(zhǎng)因子和纖連蛋白中的一種因子加入到無(wú)血清培養(yǎng)基中對(duì)于CEF-單細(xì)胞層形成的影響在預(yù)先的試驗(yàn)中，發(fā)明人已顯示了，如果使用不包含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基199，則CEF細(xì)胞不附著于細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面。而且，沒(méi)有單細(xì)胞層形成。如果使用含有7％FCS的培養(yǎng)基199，則觀(guān)察到正常的單細(xì)胞層形成。我們進(jìn)行了分析，如果將添加物加入到培養(yǎng)基中，CEF細(xì)胞能否在無(wú)血清培養(yǎng)基199中附著和生長(zhǎng)。
所測(cè)試的添加物包含重組表皮生長(zhǎng)因子(r-hEGF)和纖連蛋白(FN)。
為了這一實(shí)驗(yàn)，將CEF細(xì)胞生長(zhǎng)在培養(yǎng)基199中，其中單獨(dú)添加或聯(lián)合添加不同的添加物。在不含任何添加物的培養(yǎng)基199中生長(zhǎng)的細(xì)胞用作陰性對(duì)照。在包含7％FCS的培養(yǎng)基199中培養(yǎng)的細(xì)胞用作陽(yáng)性對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)平板上用3ml培養(yǎng)基進(jìn)行。在用于細(xì)胞培養(yǎng)之前，根據(jù)供應(yīng)商的數(shù)據(jù)單處理添加物。讓纖連蛋白在使用前吸附于細(xì)胞培養(yǎng)板表面上25分鐘。纖連蛋白以3μg/cm2的濃度使用，而EGF以10ng/ml的濃度使用。在加入任何細(xì)胞之前，將細(xì)胞培養(yǎng)平板與含有纖連蛋白的培養(yǎng)基接觸25分鐘。
每種培養(yǎng)基加上要被測(cè)試的添加物都一式雙份進(jìn)行培養(yǎng)。將6孔細(xì)胞培養(yǎng)平板在37℃下孵育4天。從第1至第4天，用顯微鏡評(píng)價(jià)細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)。
對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，觀(guān)察到CEF細(xì)胞的正常附著和生長(zhǎng)。對(duì)于不含添加物的培養(yǎng)基199，幾乎不能觀(guān)察到CEF細(xì)胞的附著。
相比于不含添加物的培養(yǎng)基199，通過(guò)使用加入到培養(yǎng)基199中的EGF，可以看到單細(xì)胞層形成中至關(guān)重要的改善。人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞附著并形成典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。此外，在整個(gè)4天期間能觀(guān)察到連續(xù)生長(zhǎng)。
通過(guò)將纖連蛋白加入到培養(yǎng)基中，也可達(dá)到細(xì)胞附著的改善。與僅添加EGF和僅添加纖連蛋白相比，EGF和纖連蛋白兩者都添加導(dǎo)致輕微的改善。
總之，必須要作出結(jié)論說(shuō)，通過(guò)使用添加物EGF和纖連蛋白，無(wú)血清培養(yǎng)基199中CEF細(xì)胞的單細(xì)胞層形成可以被支持。
此外，在平行實(shí)驗(yàn)中，將1×107CEF細(xì)胞接種在包含10％FCS的培養(yǎng)基、不包含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基和不包含F(xiàn)CS但包含EGF的培養(yǎng)基中。接種后2天計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞數(shù)目分別達(dá)到用于接種的細(xì)胞數(shù)目的42％、6％和44％。因此，接種在包含EGS的無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞的結(jié)果與獲得包含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基的結(jié)果一樣好，且顯著好于既不含血清也不含EGF的培養(yǎng)基。
另外，包含EGF的培養(yǎng)基與各種標(biāo)準(zhǔn)無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行比較，如DMEM、Opti-Mem或293-SFM。為這一目的，將1×107個(gè)CEF細(xì)胞接種在各種無(wú)血清培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)4天。在包含EGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的數(shù)目分別比在無(wú)血清DMEM、Opti-Mem和293-SFM中培養(yǎng)的細(xì)胞的數(shù)目高24倍、5倍和12倍。
實(shí)施例4用MVA感染CEF細(xì)胞接種在滾瓶中4天后對(duì)CEF細(xì)胞進(jìn)行感染。在那個(gè)時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞已經(jīng)生長(zhǎng)成一個(gè)足夠的單細(xì)胞層。用MOI為1或0.1的MVA感染細(xì)胞。為了進(jìn)行感染，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基從燒瓶中除去。將所需量的每滾瓶病毒稀釋在20ml的適當(dāng)無(wú)血清感染培養(yǎng)基中。在這個(gè)階段，無(wú)血清培養(yǎng)基可以或不可以包含選自生長(zhǎng)因子和纖連蛋白的一種因子。將細(xì)胞在37℃在滾瓶培養(yǎng)箱中以0.3-0.5rpm與病毒一起孵育1小時(shí)。1小時(shí)后滾瓶用適當(dāng)?shù)臒o(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基填充至總體積為每個(gè)滾瓶200ml。在這個(gè)階段，無(wú)血清培養(yǎng)基可以或不可以包含選自生長(zhǎng)因子和纖連蛋白中的一種因子。在48或72小時(shí)后，通過(guò)將滾瓶冰凍至-20℃來(lái)停止病毒復(fù)制。
實(shí)施例5從感染的CEF細(xì)胞中制備病毒提取物和MVA的滴定將冰凍的滾瓶在室溫下解凍。在解凍過(guò)程中，細(xì)胞從滾瓶表面上分離，且可通過(guò)搖動(dòng)燒瓶機(jī)械地除去。收獲病毒/細(xì)胞懸液并等分成較小的體積。為了從感染的細(xì)胞中釋放病毒，將病毒/細(xì)胞懸液冷凍/解凍3次。冷凍/解凍的病毒樣品用于滴定。
在96孔平板中在第1次傳代的CEF細(xì)胞上進(jìn)行滴定，使用10倍稀釋的病毒懸液和每次稀釋8次平行測(cè)定。在感染后，用抗牛痘病毒抗體和合適的染色溶液顯現(xiàn)感染的細(xì)胞。
詳細(xì)地說(shuō)，在試驗(yàn)的第0天，將原代CEF細(xì)胞(見(jiàn)“雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞的制備”部分)用胰蛋白酶消化，且如“計(jì)算細(xì)胞密度”部分中描述的進(jìn)行計(jì)數(shù)。用含7％FCS的RPMI培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1×105細(xì)胞/ml。該稀釋之后，用多道移液管在96孔平板的每個(gè)孔中接種100μl。細(xì)胞在37℃和5％CO2下孵育過(guò)夜。將要滴定的病毒樣品(見(jiàn)“從感染的CEF細(xì)胞中制備病毒提取物”部分)用不含血清的RPMI從10-1至10-12以10倍的步驟連續(xù)稀釋。這一連續(xù)稀釋是通過(guò)將900μl RPMI加入到96孔深孔板的所有孔中而進(jìn)行的。將100μl病毒樣品加入到第一排的所有孔中并混合。其后，將100μl的每個(gè)樣品用多道移液管轉(zhuǎn)移到下一排孔中。當(dāng)進(jìn)行稀釋時(shí)，將96孔深孔板放置在冰上。將平板在37℃和5％CO2下孵育5天以使得感染進(jìn)行。5天后，用牛痘病毒特異性抗體將細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。為了進(jìn)行染色，通過(guò)將96孔平板倒扣在容器上以除去培養(yǎng)基。用100μl/孔甲醇/丙酮(1∶1)混合物在室溫下固定細(xì)胞10分鐘。除去固定液并風(fēng)干平板。干燥后，用PBS清洗細(xì)胞一次，并在室溫下用抗牛痘病毒抗體(抗牛痘病毒抗體，兔多克隆，IgG組份(Quartett，柏林，德國(guó)#9503-2057))孵育1小時(shí)，該抗牛痘病毒抗體用含3％FCS的PBS稀釋至1∶1000。除去抗體后，用PBS清洗細(xì)胞兩次，并在室溫下用HRP偶聯(lián)的(辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的)抗兔抗體(抗兔IgG抗體，HRP偶聯(lián)的山羊多克隆的(Promega，曼海姆，德國(guó)#W4011))孵育1小時(shí)，該HRP偶聯(lián)的抗兔抗體用含3％FCS的PBS稀釋至1∶1000。再次用PBS清洗細(xì)胞，并用鄰聯(lián)[二]茴香胺(o-Dianisidine)或TMB染色。對(duì)于使用鄰聯(lián)[二]茴香胺的染色方法，用100μl/孔染色溶液孵育細(xì)胞，該染色溶液由每60ml的50mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中含5mg鄰聯(lián)[二]茴香胺和180μl30％H2O2組成。在室溫下孵育細(xì)胞直到它們?nèi)境珊稚?-3小時(shí)后，感染的細(xì)胞清晰可見(jiàn)。使用TMB染色方法時(shí)，用30μl/孔1.2mM TMB(Seramun Diagnostica GmbH)孵育細(xì)胞。孵育15分鐘后，除去TMB溶液并用PBS清洗細(xì)胞一次。感染的細(xì)胞呈現(xiàn)暗藍(lán)色。計(jì)數(shù)平板上感染的細(xì)胞。用Spearman和Kaerber公式計(jì)算病毒效價(jià)。計(jì)算TCID50時(shí)，將每個(gè)顯示褐色或藍(lán)色細(xì)胞的孔標(biāo)記為陽(yáng)性。因?yàn)樵囼?yàn)參數(shù)保持恒定，故使用以下簡(jiǎn)化公式病毒效價(jià)[TCID50/ml]＝10[a+1.5+xa/8+xb/8+xc/8]a＝最后一列的稀釋因子，其中所有8個(gè)孔都是陽(yáng)性Xa＝在第a+1列中陽(yáng)性孔的數(shù)目Xb＝在第a+2列中陽(yáng)性孔的數(shù)目Xc＝在第a+3列中陽(yáng)性孔的數(shù)目實(shí)施例6在無(wú)血清培養(yǎng)基中CEF細(xì)胞的最佳接種密度和感染CEF細(xì)胞的最佳MVA數(shù)量對(duì)于無(wú)血清CEF生長(zhǎng)，測(cè)定了最佳的接種細(xì)胞密度為7.5×107細(xì)胞/850cm2(一個(gè)滾瓶的表面)。在接種后第4天細(xì)胞能夠建立一個(gè)好的單細(xì)胞層而不形成大的團(tuán)塊，且可在該時(shí)間點(diǎn)被感染。
進(jìn)行試驗(yàn)，以測(cè)定對(duì)于從無(wú)血清方法培養(yǎng)的CEF細(xì)胞中最大量生產(chǎn)MVA，病毒接種的最好水平和感染的長(zhǎng)短。根據(jù)本發(fā)明，在培養(yǎng)基中以7.5×107細(xì)胞/850cm2的密度接種CEF細(xì)胞。接種后第4天，用不同數(shù)量的MVA感染細(xì)胞，MVA的范圍為0.05至1.0TCID50/細(xì)胞。最好的結(jié)果獲自0.1TCID50/細(xì)胞的MVA。
實(shí)施例7培養(yǎng)和用MVA感染的無(wú)血清培養(yǎng)基的最佳pHMVA和其它痘病毒感染對(duì)低于7.0的pH是敏感的。痘病毒在酸性pH時(shí)不穩(wěn)定，，建議將純化的痘病毒貯存在pH高于7.0的緩沖液中以保證在作為液體病毒制劑貯存時(shí)的穩(wěn)定性和病毒完整性。進(jìn)行試驗(yàn)以測(cè)定在不同的起始pH下進(jìn)行感染時(shí)對(duì)病毒產(chǎn)量的影響。以通常方法將CEF細(xì)胞接種在含無(wú)血清培養(yǎng)基的滾瓶中，該無(wú)血清培養(yǎng)基包含10ng/ml EGF加4mM L-谷氨酰胺，并培養(yǎng)4天。用MVA以0.1TCID50/細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中在不同pH下感染細(xì)胞，該無(wú)血清培養(yǎng)基包含10ng/ml EGF加L-谷氨酰胺和1mM天冬酰胺，該不同pH范圍為6.5至9.0。在感染后72小時(shí)，測(cè)定培養(yǎng)基的pH，并通過(guò)用通常方式滴定細(xì)胞提取物而測(cè)定病毒的產(chǎn)量。結(jié)果呈現(xiàn)在下表中，其顯示了在感染開(kāi)始時(shí)培養(yǎng)基的初始pH對(duì)病毒產(chǎn)量的影響。

對(duì)于在包含10ng/ml EGF、并補(bǔ)充有L-谷氨酰胺和天冬酰胺的無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的感染，在起始pH從7.0至8.5時(shí)病毒生產(chǎn)是相對(duì)恒定的，但在起始pH為6.5和9.0時(shí)病毒生產(chǎn)是低的。在起始pH為7.0時(shí)獲得了最佳產(chǎn)量。商業(yè)上可獲得的標(biāo)準(zhǔn)無(wú)血清培養(yǎng)基通常具有7.4的pH值。因此將無(wú)血清培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至7.0能幫助改善病毒產(chǎn)量。
實(shí)施例8加入天冬酰胺對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的影響預(yù)先的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示了，在培養(yǎng)CEF細(xì)胞和用MVA感染CEF細(xì)胞期間，天冬酰胺的量可以是受限制的。為克服天冬酰胺在培養(yǎng)和感染過(guò)程中在無(wú)血清培養(yǎng)基中的耗盡，將額外的天冬酰胺在感染CEF細(xì)胞之前以補(bǔ)充物的形式加入到培養(yǎng)基中。為測(cè)定用來(lái)補(bǔ)充培養(yǎng)基的天冬酰胺的最佳量，用無(wú)血清培養(yǎng)基中的CEF細(xì)胞(7.5×107細(xì)胞/850cm2)接種滾瓶，該無(wú)血清培養(yǎng)基包含10ng/ml EGF加4mM L-谷氨酰胺。接種后4天，用無(wú)血清培養(yǎng)基中的MVA，以0.1TCID50/細(xì)胞感染細(xì)胞，該無(wú)血清培養(yǎng)基包含10ng/mlEGF加4mM L-谷氨酰胺，并用不同天冬酰胺濃度加以補(bǔ)充(0.5，1.0和1.5mM)。在感染后72小時(shí)停止病毒復(fù)制，并測(cè)定病毒效價(jià)。結(jié)果示于下表中，下表顯示了CEF細(xì)胞中MVA的生產(chǎn)，該CEF細(xì)胞為感染階段補(bǔ)充有不同水平的天冬酰胺。效價(jià)代表每種天冬酰胺補(bǔ)充物的3滾瓶的均值。
結(jié)果證明，用天冬酰胺補(bǔ)充包含10ng/ml EGF的無(wú)血清培養(yǎng)基能改善病毒的生產(chǎn)，并且為感染過(guò)程而補(bǔ)充至1mM是最佳的。

權(quán)利要求
1.培養(yǎng)原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞的方法，其特征在于將細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，所述無(wú)血清培養(yǎng)基包含選自由生長(zhǎng)因子和粘附因子組成的組中的一種因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞是雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)的方法，其中生長(zhǎng)因子是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，特別是重組人EGF。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中EGF的濃度在5-20ng/ml培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)的方法，其中粘附因子是纖連蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中纖連蛋白的濃度在1-10μg/cm2細(xì)胞培養(yǎng)容器表面的范圍內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)基包含選自生長(zhǎng)因子和粘附因子中的兩種或更多種因子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中培養(yǎng)基包含在如權(quán)利要求4和6中所定義的濃度范圍內(nèi)的EGF和纖連蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步包含一種或更多添加物，該添加物選自微生物提取物、植物提取物和來(lái)自非哺乳類(lèi)動(dòng)物的提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中微生物提取物是酵母提取物或酵母提取液超濾液。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中植物提取物是水稻提取物或大豆提取物。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中來(lái)自非哺乳類(lèi)動(dòng)物的提取物是魚(yú)類(lèi)提取物。
13.擴(kuò)增病毒的方法，包含以下步驟(i)根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所定義的方法培養(yǎng)原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞(ii)用病毒感染原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞(iii)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)感染的細(xì)胞直到子代病毒產(chǎn)生，其中原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞是允許所述病毒生產(chǎn)性復(fù)制的細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中原代鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞是雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13至14中任一項(xiàng)的方法，其中病毒選自流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、日本腦炎病毒、黃熱病病毒、流感病毒和痘病毒。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中痘病毒是正痘病毒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中正痘病毒是牛痘病毒。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中牛痘病毒是改良的安卡拉牛痘病毒。
19.根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)的方法，其中痘病毒是減毒病毒或重組病毒。
20.根據(jù)權(quán)利要求13至19中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(ii)和(iii)中的一個(gè)或兩個(gè)步驟的無(wú)血清培養(yǎng)基缺少選自生長(zhǎng)因子和粘附因子中的因子。
21.根據(jù)權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)的方法，其中繼步驟(iii)之后進(jìn)行一個(gè)或更多的純化步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求13至21中任一項(xiàng)的方法獲得的痘病毒。
23.包含根據(jù)權(quán)利要求13至21中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的痘病毒的組合物。
24.作為藥物或疫苗的根據(jù)權(quán)利要求22的痘病毒或根據(jù)權(quán)利要求23的組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的痘病毒或根據(jù)權(quán)利要求23的組合物用于制造疫苗的用途。
26.在其需要時(shí)治療或接種動(dòng)物，包括人，的方法，包含將如權(quán)利要求22中所定義的痘病毒或如權(quán)利要求23中所定義的組合物投藥給動(dòng)物或人。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于培養(yǎng)原代細(xì)胞的方法。將原代細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，該無(wú)血清培養(yǎng)基包含選自由生長(zhǎng)因子和粘附因子組成的組中的一種因子。培養(yǎng)原代細(xì)胞的方法可以是擴(kuò)增病毒如痘病毒的方法中的一個(gè)步驟。根據(jù)該后者方法，將原代細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，該無(wú)血清培養(yǎng)基包含選自由生長(zhǎng)因子和粘附因子組成的組中的一種因子。細(xì)胞然后用病毒感染，并將感染的細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，直到子代病毒產(chǎn)生。
文檔編號(hào)C12N7/02GK1692156SQ03818869
公開(kāi)日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2003年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月5日
發(fā)明者英格馬·拉思, 伊娃·費(fèi)爾德, 卡爾·赫勒 申請(qǐng)人:巴法里安諾迪克有限公司