專利名稱：用于治療疾病的新細菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該本發(fā)明涉及一種新的細菌和該新細菌及其屬的其它成員、其活性部分和/或來自其的蛋白質(zhì)用于治療多種疾病的用途。更具體地說，本發(fā)明涉及迪茨氏菌屬(Dietzia)(包括迪茨氏菌種C79793-74)，以及通過分離迪茨氏菌所使用的體外抑制方法分離的其它細菌、來自其的部分和/或蛋白質(zhì)用于治療反芻類動物的副結(jié)核和由分枝桿菌導致人類疾病，例如局限性回腸炎、麻風、結(jié)節(jié)病和結(jié)核病(TB)的用途。
背景技術(shù)：
反芻動物中的副結(jié)核(或副結(jié)核病)是胃腸道的慢性感染。副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium paratuberculosis)(MpT)已知是副結(jié)核病的病原體。接觸副結(jié)核病的大多數(shù)動物在出生后不久即被感染，在成年之前并不表現(xiàn)臨床癥狀。感染是永久性的，目前無有效的治療方法，若不被屠宰，大多數(shù)臨床患病的動物最終將消耗而死。
目前的估計顯示出在美國21.6％的牧群中3.4％的乳牛的和7.9％的牧群中0.9％的肉牛被MpT感染。基本上所有其它國家都報道了類似的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果證明副結(jié)核病是一個非常嚴重的全世界性問題。確實，據(jù)估計，由于乳品收入的損失，屠宰增加、屠宰動物體重低、產(chǎn)犢間隔延長以及育種家畜無法售出而給美國帶來的經(jīng)濟影響為2-15億美元。同樣，養(yǎng)羊業(yè)也遭受到由副結(jié)核病帶來的巨大經(jīng)濟損失。
普遍認為，對于副結(jié)核臨床表現(xiàn)的出現(xiàn)來說，年幼時必須發(fā)生MpT的感染。迄今為止，尚未報道對感染動物的有效治療。而且，尚未報道防止感染的預防方法。生物安全性及其它管理實踐方法已被建議用作控制副結(jié)核病傳播的方法。人們認為MpT的傳播可通過如下方式得以減小a)對細節(jié)的持久關(guān)注；b)避免接觸感染動物的排泄物；和c)屠宰所有感染牛和感染牛產(chǎn)下的所有子代。然而，從實際的前景來看，單獨的管理措施可能無法控制傳染。因此，需要預防和控制副結(jié)核的可行方法。
分枝桿菌是人類，以及動物的主要病原體。在世界范圍內(nèi)大約有一千萬肺結(jié)核病例，年死亡率為三百萬。麻風(由麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)導致)折磨著一千萬人，其主要發(fā)生于發(fā)展中國家。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和鳥胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium avium-intracellulare)型的分枝桿菌是免疫受損性患者例如愛滋病患者的主要機會病原體。局限性回腸炎和結(jié)節(jié)病被假定是被MpT感染的結(jié)果。治療這些疾病的大多數(shù)方法需要強烈且冗長的聯(lián)合藥物療法。所述治療不但會產(chǎn)生抗性菌株，而且對局限性回腸炎患者來說尚未建立疾病的持久分辨率。因此，需要對人類的分枝桿菌所引發(fā)的疾病的更有效的治療方法。
局限性回腸炎一種慢性、消耗性和可能致死的疾病，其具有與副結(jié)核病廣泛的臨床、病理和全身的相似性。在美國，每年新診斷的局限性回腸炎患者的數(shù)量估計為20,000。局限性回腸炎為病因不明的不形成粒細胞性回腸結(jié)腸炎。對局限性回腸炎免疫發(fā)病機理的假說是該疾病起因于對內(nèi)臟相關(guān)淋巴組織(GALT)的抗原性攻擊。一經(jīng)觸發(fā)，釋放的細胞因子及其它炎癥介質(zhì)將導致慢性和持續(xù)性炎癥。該炎性反應被假定是GALT對腸細胞內(nèi)呈遞的抗原的高應答性的結(jié)果。該高反應性可以是免疫調(diào)節(jié)缺陷的結(jié)果或來自于持續(xù)的刺激，例如MpT抗原。確定遺傳傾向性的最近的證據(jù)與該理論一致。因此，尤其需要對靶向MpT的局限性回腸炎的治療方法。
罹患副結(jié)核病的動物可以是導致人類局限性回腸炎的MpT的來源。例如，MpT可經(jīng)污染的肉和/或巴氏滅菌牛奶而被傳播至人類。MpT是在移居至血液和其它組織中存在的吞噬細胞中并在其中繁殖的細胞內(nèi)病原體。因為吞噬細胞是乳的天然組分，故在感染母牛的乳中發(fā)現(xiàn)MpT是不令人驚奇的。而且，MpT對目前商業(yè)上使用的巴氏滅菌法具有部分抗性。此外，嚴重感染MpT的動物通常被屠宰而可能用于制備牛肉粉。不充分的烹調(diào)會再次導致食物中出現(xiàn)存活的MpT。因此，副結(jié)核的任何有效治療均可能降低MpT到人的傳播，隨后其可導致局限性回腸炎發(fā)生率較低。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及迪茨氏菌屬細菌用于治療多種疾病的用途。本發(fā)明包括鑒定為迪茨氏菌菌種C79793-74的并保藏于美國典型培養(yǎng)物中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，保藏號為PTA-4125的分離的細菌用于治療多種疾病的用途。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種適于施用于動物的組合物，其包括載體和一種或多種細菌，即選自迪茨氏菌屬(包括ATCC保藏號PTA-4125)的細菌種類，其在本文中統(tǒng)稱為“細菌”。
本發(fā)明還包括適于施用于動物的組合物，其包括載體和藥理學上有效(或重組DNA來源的)劑量的細菌、細菌的活性片段，包括由細菌或含有細菌來源的DNA的生物體所分泌的酶、活性分子的活性片段，以及上述的組合?；钚苑肿影ǖ鞍踪|(zhì)、DNA分子、RNA分子、糖類和細胞膜組分，例如脂多糖。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括適于將細菌施用于罹患副結(jié)核病的動物的組合物。例如，本發(fā)明包含其中含有細菌組分的飼料組合物和飼料添加劑。
而在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種適于施用于人的組合物，其包括載體和細菌。
本發(fā)明還包括適于施用于人的組合物，其包括載體和藥理學上有效(或重組DNA來源的)劑量的細菌、細菌的活性片段，包括由細菌或含有細菌來源的DNA的生物體所分泌的酶、活性分子的活性片段，以及上述的組合。通過重組技術(shù)制備細菌的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
此外，本發(fā)明涉及通過施用包含細菌的組合物來治療副結(jié)核病、局限性回腸炎和其它分枝桿菌所導致的疾病的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明包括治療副結(jié)核病的方法，該方法包括對感染MpT的任何哺乳動物經(jīng)口施用包含細菌的組合物。
用于本發(fā)明的細菌是從動物樣品中分離的，所述動物樣品可以是牛的排泄物，將細菌與MpT共培養(yǎng)，然后選擇抑制MpT生長的細菌。在其它實施方案中，細菌是從土壤、海水或甚至昆蟲中分離的。
該方法還涉及在含有胰蛋白 大豆培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)迪茨氏菌屬細菌的方法。
發(fā)明詳述本文所述的所有范圍包括全部組合和包含于該范圍中的次級組合；因此，范圍“約15～約60”將包括約15～約45，約30～約47等等的范圍。范圍“最高達85”將包括最高達80、最高達50、最高達24等等的范圍。
本發(fā)明涉及新的細菌例如迪茨氏菌屬中的那些種類(″該細菌″)，其(當與病原分枝桿菌共培養(yǎng)時)能抑制共培養(yǎng)的分枝桿菌的生長，由此證明可用于控制所述分枝桿菌的生長。
所述細菌還令人驚訝地且出乎意料地被證明能有效治療被MpT感染的具有和不具有臨床疾病的牛。
具體來說，對反芻動物施用細菌解決了一個長期存在的問題，因為其被證明能有效治療被MpT感染的反芻動物。已經(jīng)令人驚訝地且出乎意料地發(fā)現(xiàn)將藥理學上有效劑量的細菌經(jīng)口施用于牛能夠治療副結(jié)核病的癥狀并導致對該給藥反芻動物有益的長期健康。
所述細菌能有效治療任何反芻動物(包括但不限于，牛、綿羊、山羊和鹿)中的副結(jié)核病。將所述細菌施用于臨床上無癥狀的被MpT感染的反芻動物也能用于防止副結(jié)核病臨床癥狀的發(fā)作。在一個實施方案中，反芻動物包括牛，例如乳犢牛和成年泌乳及無泌乳母牛。在另一實施方案中，反芻動物包括山羊或綿羊。
在一個實施方案中將所述細菌經(jīng)口施用于反芻動物。所述細菌可以在與飼料混合的和/或與飼料添加劑混合的溶液中進行施用。所述口服施用可以用一系列每日施用的劑量實施至少3個月的一段時期。當反芻動物是牛時，治療可以至少1011cfu的劑量施用至少6個月。這包括將所述細菌以至少1012cfu的劑量進行施用的治療方法并進一步包括將所述細菌以至少1013cfu的劑量進行施用的治療方法。在一個實施方案中，將所述細菌經(jīng)口以每日為基礎(chǔ)施用于成年臨床患病的或無癥狀的乳牛大約3～10月。但是，只要能夠施用藥理學上的有效劑量從而有效防止和/或治愈副結(jié)核，可是采用任何可接受的周期。例如，如果將所述細菌與飼料和/或飼料添加劑混合，可對反芻動物飼喂將包含藥理學上有效劑量的所述細菌的飼料的日常飲食直至總劑量導致治愈和/或防止疾病。
在一個實施方案中，以單劑量經(jīng)口施用2×1011cfu的所述細菌。如果將所述細菌摻入飼料中，飼料中所述細菌的濃度范圍應適于實施本發(fā)明的方法，在一個實施方案中約為1011～1013cfu/日。在一個實施方案中，將所述細菌以某種濃度摻入飼料中，以便在每日消耗的一定量飼料中能夠施用2×1011cfu的所述細菌。任何適宜量的所述細菌，或其活性部分和蛋白質(zhì)的均可以摻入飼料中，只要能在每日飼料中將藥理學上有效量的物質(zhì)飼喂給動物即可。如果將所述細菌摻入飼料添加劑中，飼料添加劑中所述細菌的濃度范圍應適于實施本發(fā)明的方法，在一個實施方案中約為1011cfu/日。在一個實施方案中，將所述細菌以某種濃度摻入飼料添加劑中，以便在每日消耗的一定量飼料中能夠施用2×1011cfu的所述細菌。
本發(fā)明并非有意受到治療性制劑的特性的限制。所述細菌可在任何類型的用于施用的適宜介質(zhì)中制備。例如，所述細菌可與生理上容許的液體(例如鹽水)、凝膠或固體載體、稀釋劑、佐劑、賦形劑一起被提供并作為瘤胃保護(rumen-protected)膠囊的成分。適宜的稀釋劑和賦形劑包括藥物級生理鹽水、葡萄糖、甘油、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等及其組合。此外，如有需要，組合物可包括少量的輔助物質(zhì)例如濕潤劑或乳化劑、穩(wěn)定劑或pH值緩沖劑。這些組合物典型地包括1％～95％的活性成分，優(yōu)選2％～70％。所述細菌可被摻入片劑、大丸劑或膠囊中而給予患者。所述細菌還可被摻入鹽塊等中。所述細菌可以冷干粉或作為裝入膠囊的細菌(給保護其不在瘤胃中降解)而被加至飼料中。在一個實施方案中，所述細菌在生理磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或在培養(yǎng)基，胰蛋白 大豆液體培養(yǎng)基(TSB)中準備而用于經(jīng)口施用于反芻動物。
該細菌可被摻入片劑、獸用頓服料、大丸劑、膠囊或預混合料中。可以通過藥物制劑領(lǐng)域眾所周知的方法將這些活性成分配制為所述劑型。參見，例如美國專利號4,394,377。(該專利，及本文所引用的其它參考文獻由此引入作為參考。)實心膠囊和任意期望形式的該活性成分可很容易地生產(chǎn)膠囊。如有需要，這些材料可用惰性粉狀稀釋劑，例如糖、淀粉、乳粉、純化結(jié)晶纖維素等進行稀釋以增加體積以便填充膠囊。
可采用常規(guī)的制劑方法來制備包含所述細菌的片劑。除活性成分外，片劑可包含基質(zhì)、崩解劑、吸收劑、粘合劑和潤滑劑。典型的基質(zhì)包括乳糖、蔗糖、氯化鈉、淀粉和甘露糖醇。與藻酸一樣，淀粉也是一種良好的崩解劑。某些時候還會使用表面活性劑例如十二烷基硫酸鈉和二辛基磺基琥珀酸鈉。通常使用的吸收劑包括淀粉和乳糖。碳酸鎂也可用于含油物質(zhì)?？梢允褂茫缑髂z、樹膠、淀粉、糊精、聚乙烯吡咯烷酮和多種纖維素衍生物作為粘合劑。通常使用的潤滑劑包括硬脂酸鎂、滑石、固體石蠟、多種金屬皂和聚乙二醇。
通過選擇所述細菌、其片段或其分泌的活性分子在大多數(shù)情況下易于制備獸用頓服藥。通過制備一種組分與另一種組分的水溶液的懸液可以將水溶性形式的組分與不溶于水形式的其它組分聯(lián)合使用。不溶于水形式的活性成分可通過懸浮液或在生理上可接受的溶劑比如聚乙二醇中制備。不溶于水形式的各活性成分的懸浮液可在油例如花生油、玉米油、芝麻油等；二醇例如丙二醇或聚乙二醇；或者水中(取決于特定活性成分的溶解度)中制備?？赡苄枰m宜的生理上可接受的佐劑以便使活性成分保持懸浮。佐劑可選自增稠劑，例如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽。表面活性劑通常用來懸浮活性成分，特別是脂溶性丙酸鹽-增強化合物。最適于在液態(tài)非溶劑中制備懸浮液的是烷基酚聚環(huán)氧乙烷加合物、苯磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽和聚氧化乙烯山梨聚糖酯。此外許多物質(zhì)(受親水性、密度和液體的表面張力的影響)可輔助制備各實施方案中的懸浮液。例如，適用的懸浮劑可以是硅酮消泡劑、二醇、山梨糖醇和蔗糖。
此外，本發(fā)明的主題組合物可被單獨施用(例如通過將其直接加入飼料中)和作為大丸劑、獸用頓服藥或膠囊而與第二物質(zhì)共同施用?；蛘呖蓡为氈苽涓鹘M合物并將其以適宜量并在適宜的時間單獨加至飼料中。例如，如硬脂酸膽堿、脂肪酸復合體的物質(zhì)可以用于實施本發(fā)明，由于其物理性質(zhì)而不適于摻入飼料預混料。在此情況下，硬脂酸膽堿組合物可在適宜的稀釋液中單獨地提供，所述稀釋液例如是，玉米粉、玉米芯粉、玉米粥、玉米蛋白粉、小麥粉、豆粕、大豆磨料、米粉副產(chǎn)品等，及其混合物。美國專利號4,394,377中描述了所述適宜的稀釋劑。
所述細菌可在組合物、預混料(其隨后混合至動物飼料供應中)中被施用于動物。所述組合物可包括單獨的所述細菌或可與載體和/或其它藥物、維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)濃縮物和類似的飼料添加劑混合的所述細菌。
這些組合物可被制為干粒粉末形式(如團粒)、膏狀形式(包封以便提供瘤胃保護)、或可制為液態(tài)飼料添加劑等。任何類型的飼料均可加入所述組合物，包括通常的干燥飼料、液態(tài)飼料和顆粒飼料。將補充材料配制于動物飼料中的方法是眾所周知的。有必要僅計算各化合物(需要施用于各動物的)的量，考慮動物每日進食飼料的量，然后混入適宜量的所述細菌。參見美國專利號4,394,377。
本發(fā)明的組合物可用作飼料添加劑預混料、飼料添加劑濃縮物或飼料添加劑補充物，其中活性成分均勻地分布于整個濃縮形式的標準有機的或無機的動物飼料載體，其便于包裝和送至飼料拌和機。然后用培養(yǎng)器或飼料混合機均勻混合該預混料，濃縮物或補充物，按需為動物提供正常的飲食。用于預混料組合物的載體的實例是豆粕、玉米油、玉米粉、大麥、小麥、包含例如蛭石或硅藻土的礦物混合物，玉米谷蛋白粉、豆粉或其它價格低廉的可食用組分。
所述細菌還可與適宜的載體例如可食用的飼料或飼料添加劑補充物形式的飼料組分混合。所述可食用的飼料組分的實例是美國專利號6,156,333中所公開的任何類型的用于反芻前階段的牛犢的飼料強化劑和增強劑。如果被單獨選擇或作為補充物用于飼喂，根據(jù)補充物的預計每日消耗量提供所述細菌以便在一個特定范圍內(nèi)提供這些組分的各個每日劑量。
此外，所述細菌可通過研磨機或其它飼料供應器而被直接摻入飼料中以便為培育者提供最終的飼料產(chǎn)品。最終飼料產(chǎn)品可以由任意下述物質(zhì)制成多種谷物、苜蓿、草、礦物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)補充物等，其形成營養(yǎng)上完整的反芻動物飼料。所述細菌可直接與家畜飼料混合，所述家畜飼料由多種組分例如干草、稻草、青貯飼料、玉米桿、棉籽殼、谷物、燕麥、大麥和谷糠(尤其用于反芻動物的)；抗氧化劑、礦物質(zhì)、維生素、驅(qū)蟲劑和其他適宜的藥物。參見美國專利號4,394,377?？蛇x地，所述細菌可被摻入美國專利號6,156,333中所公開的任何類型的用于反芻前階段的牛犢的液體飼料。
可通過任何適于將細菌混合至動物飼料的方法將所述細菌混合至適宜的動物飼料中。所述方法的實例包括但不限于下述將所述細菌噴霧于干燥飼料上然后機械式送料和用機械將所述細菌混合至干燥或液態(tài)飼料中；上鋪谷物或濃縮混和。
本發(fā)明的細菌還可用于治療由多種分枝桿菌感染導致的人類的醫(yī)學病癥。這些醫(yī)學病癥包括局限性回腸炎、麻風、結(jié)核病、結(jié)節(jié)病和免疫受損(AIDS)患者中的腹瀉。通過本領(lǐng)域已知的方法將所述細菌或其活性片段、蛋白質(zhì)、分泌物等施用于人類患者可顯示出減輕了由分枝桿菌導致的疾病或綜合癥的癥狀。
迪茨氏菌種79793-74，ATCC保藏號PTA-4125在培養(yǎng)來自MpT血清陽性和陰性的牛的排泄物期間被鑒定為獨特的細菌污染物。隨后將該細菌污染物分離、培養(yǎng)并鑒定為于迪茨氏菌屬。在其它試驗中發(fā)現(xiàn)迪茨氏菌種79793-74當與MpT共培養(yǎng)時能完全抑制MpT的生長。使用從適宜的動物宿主中分離樣品的該方法可用于分離抑制MpT生長并因此可用于治療MpT導致的疾病的其它細菌(除迪茨氏菌屬以外的)。
通過相似方法可以分離抑制多種分枝桿菌生長的其它微生物。其它可被抑制的分枝桿菌包括結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、鳥胞內(nèi)分枝桿菌、牛分枝桿菌(M.bovis)、龜分枝桿菌(M.chelonei)(也稱為borstelense分枝桿菌和膿腫分枝桿菌)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、海分枝桿菌(M.marinium)(也稱為巴氏分枝桿菌和熱帶扁平魚分枝桿菌，其是“游泳池肉芽腫”的致病因子)，潰瘍分枝桿菌(M.buruli)(也稱為潰瘍分枝桿菌)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)(也稱為蓋氏、minetti和蛙分枝桿菌)、嗜血分枝桿菌(M.haemophilum)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)(也稱為luciflavum分枝桿菌)、蟾分枝桿菌(M.littorale)(也稱為蟾蜍分枝桿菌)、瑪爾摩分枝桿菌(M.malmoense)、瘰癘分枝桿菌(M.marianum)(也稱為scrofulaceum分枝桿菌和paraffinicum分枝桿菌)、猿分枝桿菌(M.simiae)，斯塞格分枝桿菌(M.szulgai)和潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)(導致Buruli潰瘍的因素)、鳥分枝桿菌(M.avium)(也稱為深褐色分枝桿菌)、微黃分枝桿菌(M.flavascens)、鼠麻風分枝桿菌(M.lepraemurium)和田鼠分枝桿菌(M.microci)。
可通過在胰蛋白 大豆液體培養(yǎng)基中瓊脂斜面上于35℃生長細菌來培養(yǎng)迪茨氏菌屬細菌。迪茨氏菌屬細菌的大規(guī)模生產(chǎn)可通過在大型生物發(fā)酵罐中的懸浮液中生長而得以實現(xiàn)。通過保存于-20℃，所述細菌的存活力不會改變。此外，迪茨氏菌屬細菌可以凍干物質(zhì)于室溫下保存?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的保持細菌存活力的其它保存方法。
可通過用于制備/鑒定細菌活性片段和細菌分泌的蛋白質(zhì)的方法制備來自迪茨氏菌屬的細菌的活性片段和從所述細菌中分離的活性分子。所述方法包括但不限于聲裂法、滲壓震擾、洗滌劑裂解、高壓、將脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)至其它生物體，例如然后要用作上述飼料添加劑的細菌、植物或動物。
發(fā)明的組合物和方法產(chǎn)生如下重要的有利點提供了副結(jié)核病的有效治療方法，其將增加農(nóng)民的收益；通過消除潛在的MpT污染使得產(chǎn)品例如乳和肉更安全；對于局限性回腸炎以及由分枝桿菌導致的其它疾病例如結(jié)核病和麻風的可能有效的非抗生素治療方法。該方法還教導了一種鑒定抑制多種分枝桿菌的方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員僅通過常規(guī)試驗即可認識到(或能夠確定)本文所描述的具體實施方案的大量等效形式。所述等效形式包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實施例本發(fā)明通過下述、非限制性的實施例進行進一步的說明。
實施例1.通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)確定來自迪茨氏菌屬致敏的母牛的血清以及初乳/乳中的抗體與MpT發(fā)生交叉反應對經(jīng)檢測對MpT感染陰性的健康母牛注射需要劑量的迪茨氏菌屬菌種C79793-74，其保藏號為PTA-4125。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員認識或能夠確定的標準ELISA測定法確定取自注射的母牛的乳和血清中與MpT交叉反應的抗體的滴度。
表1
圖示-表示陰性；+表示陽性；ND表示未完成；IM表示經(jīng)肌內(nèi)途徑表1中的結(jié)果表明用迪茨氏菌屬細菌ATCC保藏號PTA-4125免疫的母牛能產(chǎn)生與MpT交叉反應的抗體。而且，在血清和乳中均發(fā)現(xiàn)了這些抗體。該結(jié)果是重要的，因為其為迪茨氏菌屬細菌的作用機制提供了可能的解釋感染了MpT的吞噬細胞可更易于攝取被覆了與MpT交叉反應的抗體的迪茨氏菌屬細菌。因此，該交叉反應的抗體可用作將迪茨氏菌屬細菌遞送給被MpT感染的細胞。
實施例2.對副結(jié)核病血漿陽性的母牛的治療根據(jù)本發(fā)明的方法通過施用迪茨氏菌屬細菌ATCC保藏號PTA-4125治療罹患副結(jié)核病的母牛。下面表2中顯示了7頭所述母牛的臨床結(jié)果。
對各母牛施用口服單劑量2×1011cfu(以每日為基礎(chǔ)，單劑量)的迪茨氏菌種C79793-74，ATCC保藏號PTA-4125。
表2
表2中的結(jié)果顯示了用迪茨氏菌種C79793-74，ATCC保藏號PTA-4125對MpT血清陽性的動物的治療是有效的(而對于H-83，是治愈性的)。例如，母牛H-83(用迪茨氏菌種C79793-74，ATCC保藏號PTA-4125治療9個月)在治療接受后38個月，于5/01/02仍存留于牧群中，其ELISA陰性，培養(yǎng)陰性且無臨床癥狀。結(jié)果還顯示出最好的試驗對象是患有早期疾病的那些動物。任何結(jié)果(例如表2所示的那些結(jié)果，或根據(jù)要治療的動物而與之相似的結(jié)果)均與本申請所述的定義“降低或防止疾病或綜合癥的癥狀”相適應。
概言之，實施如下臨床研究，其中對表現(xiàn)出副結(jié)核病癥狀的成年奶牛施用迪茨氏菌種C79793-74，ATCC保藏號PTA-4125。在該研究中，每日給予所述細菌3～10個月。在治療的7只臨床患病的動物中，6只康復。而且，MpT血清陽性，但臨床無癥狀的4只經(jīng)治療的動物再無疾病的發(fā)展。相反，未治療的10只臨床患病的動物死于明顯的臨床疾病。
實施例3.BC對牛犢和小鼠施用迪茨氏菌屬細菌的安全性除施用了活的或死的迪茨氏菌種C79793-74，ATCC保藏號PTA-4125的母牛外，還對大量牛犢和小鼠施用了相同的活細菌。使用兩類小鼠。對8只免疫學具有活性的，2～3個月齡的A/J雄性和8只雌性(每籠各兩只)IP注射108cfu的活迪茨氏菌種C79793-74，ATCC保藏號PTA-4125。隨后對其監(jiān)測10個月，以檢測任何疾病的癥狀(體重減輕、腹瀉)和生殖問題。所有監(jiān)測到的活動均與未治療的(對照)動物無區(qū)別。此外，108cfu的迪茨氏菌種C79793-74，ATCC保藏號PTA-4125經(jīng)腹膜內(nèi)注射至(IP)小鼠CB.17，重度-聯(lián)合-免疫缺陷小鼠(SCID)小鼠。正如采用常規(guī)小鼠所發(fā)現(xiàn)的，盡管這些小鼠(遺傳上)不具有免疫能力(它們?nèi)狈δ苄訲和B細胞)，注射的細菌未顯示出明顯的有害反應。
將7頭肯定將用作閹牛的雄性牛犢用于確定經(jīng)口給予的，以單劑量的，以每日為基礎(chǔ)的，自出生至15日的109cfu的迪茨氏菌種C79793-74，ATCC保藏號PTA-4125的安全性。將2頭雄性牛犢作為對照，不接受任何細菌。將所有動物閹割，飼養(yǎng)而用于屠宰。在其存活的15-18個月期間，未出現(xiàn)明顯的疾病或病癥的癥狀。屠宰時，它們的體重相似。大約4月齡時，從全部9頭牛犢中取血樣，從其中制備血清，將該血清用于ELISA測定以檢測針對MpT的抗體。除了1頭牛犢出現(xiàn)陽性的ELISA結(jié)果外，所有動物均為陰性。這是預計到的，因為該牛犢接受的初乳來自迪茨氏菌種C79793-74高度免疫的母牛(表1中的H-51)，該母牛的乳中存在抗體。
上述結(jié)果顯示出活迪茨氏菌種C79793-74在經(jīng)口或經(jīng)注射施用時不具有病原性。
實施例4.臨床患病的和/或無癥狀的母牛的治療已經(jīng)開始了一個大樣本研究，其中將液體或凍干的迪茨氏菌種C79793-74的液體給予臨床患病的和/或無癥狀的母牛，所述母牛是如下一種a)血清-ELISIA陽性，血清-AGID陰性，排泄物陰性b)血清-ELISIA陽性，血清-AGID陽性，排泄物陰性c)血清-ELISIA陽性，血清-AGID陰性，排泄物陽性d)血清-ELISIA陽性，血清-AGID陽性，排泄物陽性e)血清-ELISIA陰性，血清-AGID陰性，排泄物陽性。
7個月后，初步結(jié)果顯示出防止副結(jié)核病陽性的母牛死亡的細菌劑量取決于治療動物的體重。例如體重超過澤西種乳牛(Jerseys)高達兩倍的好斯坦種乳牛(Holsteins)需要至少兩倍高的細菌劑量。
ELISA陽性和瓊脂凝膠免疫擴散(AGID)陽性的動物比僅ELISA陽性的那些動物更難于保持存活。存活并未顯示出需要依賴動物是否排泄出或不排泄出MpT。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在排泄物中排泄出MpT的19只動物(36只動物中的)在治療6周后，僅發(fā)現(xiàn)1只仍排泄出MpT。在治療中產(chǎn)下牛犢的8只動物中，在其初乳中無一發(fā)現(xiàn)MpT。這與已經(jīng)發(fā)表的相反。這些結(jié)果顯示出防止在初乳中傳播的治療是可能的。
在治療期間大量動物死亡(12只)，大多數(shù)是由于并發(fā)癥例如皺胃移位。只有4只死于副結(jié)核病且其在治療開始時均為AGID陽性。
在無痛處死并進行尸檢的2只動物的組織中，未發(fā)現(xiàn)迪茨氏菌屬細菌。
下面表3中顯示了處于或變得臨床嚴重患病的2只動物的治療后的體重改變。
表3
治療前稱重，*產(chǎn)牛犢治療顯示出能同時減少MpT在排泄物和乳中的散布。嚴重患病的動物體重增加。在尸檢的母牛中未全身發(fā)現(xiàn)沒有迪茨氏菌屬細菌。
實施例5.抗體陽性的母牛的長期治療根據(jù)本發(fā)明的方法通過施用迪茨氏菌屬細菌ATCC保藏號PTA-4125治療檢測為副結(jié)核病血清陽性的母牛。對各母牛施用口服單劑量1012cfu(以每日為基礎(chǔ)，單劑量)的迪茨氏菌種C79793-74，ATCC保藏號PTA-4125。在治療期間定期地檢測對3頭母牛的ELISA測定中確定的特異性針對MpT的血清抗體滴度。下面表4顯示了這些檢測的結(jié)果。零值表示檢測血清沒有針對MpT的抗體，而大于1的值表示血清來自感染/已經(jīng)感染MpT的動物。
表4
13頭母牛死于分娩并發(fā)癥，對其進行了尸檢。尸檢顯示沒有副結(jié)核病的征象且沒有來自母牛組織的MpT的生長。治療后，母牛的免疫系統(tǒng)健康，因此，母牛血清中抗體的消失提示MpT不再存在于該動物中。
權(quán)利要求
1.一種包含分離的細菌的組合物，所述細菌屬于迪茨氏菌屬并保藏于美國典型培養(yǎng)物中心，其保藏號為PTA-4125。
2.權(quán)利要求1的組合物，其還包含動物飼料。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述動物飼料選自谷物、干草、稻草、青貯飼料、玉米桿、玉米、玉米粉、玉米谷蛋白粉、豆粕、豆粉、大豆磨料、棉籽殼、燕麥、大麥、玉米粥、谷糠、米粉副產(chǎn)品及其混合物。
4.權(quán)利要求1的組合物，其還包含飼料添加劑。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述飼料添加劑選自維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)補充物、藥物及其混合物。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物摻入選自片劑、獸用頓服藥、丸劑和膠囊的劑型中。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物被摻入片劑中且所述片劑中還包含基質(zhì)、崩解劑、吸收劑、粘合劑和潤滑劑。
8.一種治療副結(jié)核病的方法，其包括對哺乳動物施用權(quán)利要求1的飼料組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中哺乳動物是牛。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述方法包括經(jīng)口施用所述飼料組合物。
11.一種組合物，其包含藥理學上有效劑量的屬于迪茨氏菌屬并保藏于美國典型培養(yǎng)物中心，保藏號為PTA-4125的分離的細菌、其活性片段、其分泌的蛋白質(zhì)，或其組合。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述組合物摻入選自片劑、獸用頓服藥、丸劑和膠囊的劑型中。
13.一種治療副結(jié)核病的方法，其包括對哺乳動物施用權(quán)利要求11的飼料組合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中哺乳動物是牛。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述方法包括經(jīng)口施用所述組合物。
16.一種飼料組合物，其包含迪茨氏菌屬的細菌和動物飼料。
17.權(quán)利要求16的飼料組合物，其中所述動物飼料選自谷物、干草、稻草、青貯飼料、玉米桿、玉米、玉米粉、玉米谷蛋白粉、豆粕、豆粉、大豆磨料、棉籽殼、燕麥、大麥、玉米粥、谷糠、米粉副產(chǎn)品及其混合物。
18.一種治療副結(jié)核病的方法，其包括對哺乳動物施用權(quán)利要求16的飼料組合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中哺乳動物是牛。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述方法包括經(jīng)口施用所述組合物。
21.一種飼料添加劑，其包含迪茨氏茵屬細菌和飼料添加劑。
22.權(quán)利要求21的飼料添加劑，其中所述飼料添加劑選自維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)補充物、藥物，及其混合物。
23.一種治療副結(jié)核病的方法，其包括對哺乳動物施用權(quán)利要求21的飼料添加劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中哺乳動物是牛。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述方法包括經(jīng)口施用所述組合物。
26.一種組合物，其包含藥理學上有效劑量的迪茨氏菌屬細菌、其活性片段、其分泌的蛋白質(zhì)、或其組合，從而所述藥理學上的有效劑量能夠降低或預防病原體是分枝桿菌的疾病或綜合征的癥狀。
27.通過對哺乳動物施用權(quán)利要求26的組合物來治療病原體是分枝桿菌的疾病或綜合征的方法。
28.權(quán)利要求27的方法，其中哺乳動物是牛。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述方法包括經(jīng)口施用所述組合物。
30.一種培養(yǎng)屬于迪茨氏菌屬的細菌的方法，包括在含有胰蛋白 大豆培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含用于治療反芻動物的副結(jié)核的迪茨氏菌屬細菌的組合物以及培養(yǎng)所述細菌的方法。本發(fā)明還涉及通過對哺乳動物施用本發(fā)明的組合物來治療副結(jié)核病的方法。
文檔編號C12N1/20GK1674932SQ03818675
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月3日
發(fā)明者羅伯特·E·克利克 申請人:羅伯特·E·克利克