本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有技術(shù)表明，成熟的肝臟中存在肝干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的再生能力。肝干細(xì)胞是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，可以通過(guò)自身對(duì)稱(chēng)性和不對(duì)稱(chēng)性分裂產(chǎn)生表現(xiàn)型和基因型與自身完全相同的干細(xì)胞，也能產(chǎn)生肝臟組織中不同發(fā)育階段和不同分化方向的細(xì)胞，如肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和胰腺上皮細(xì)胞等，可以代替肝細(xì)胞移植和肝臟移植成為治療器官衰竭的一種重要細(xì)胞來(lái)源，在肝細(xì)胞移植、體外人工肝、基因治療方面均有著巨大的潛力。現(xiàn)有技術(shù)中已有利用流產(chǎn)胎兒的肝臟組織培養(yǎng)肝臟干細(xì)胞用于治療糖尿病的先例，并取得了良好的療效；由肝干細(xì)胞制備的干細(xì)胞注射液在臨床上也可以用于治療肝硬化或糖尿病等。為滿(mǎn)足醫(yī)學(xué)研究和治療的需求，大量培養(yǎng)肝干細(xì)胞成為重要的研究課題。如果試驗(yàn)人員選擇的用于培養(yǎng)和保存肝干細(xì)胞的試劑和方法不夠妥當(dāng)，往往會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)的肝干細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量無(wú)法達(dá)到要求，浪費(fèi)了人力和其他資源，因此研究一種專(zhuān)門(mén)用于穩(wěn)定的大量擴(kuò)增培養(yǎng)肝干細(xì)胞的試劑盒具有十分重要的意義。目前專(zhuān)門(mén)用于培養(yǎng)肝干細(xì)胞的試劑盒較少，現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)了一些用于培養(yǎng)其他干細(xì)胞的試劑盒，例如CN104928238A公布了一種用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，包括脂肪保存液、脂肪洗滌液、脂肪分解液、細(xì)胞洗滌液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞消化液、細(xì)胞凍存液，但此試劑盒培養(yǎng)擴(kuò)增干細(xì)胞的效果不夠理想，存在試劑安全性、穩(wěn)定性不高，細(xì)胞存活率和增殖率低等問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，其內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液、培養(yǎng)基添加劑、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量份數(shù)的各成分：本發(fā)明提供的試劑盒內(nèi)的培養(yǎng)基添加劑可以有效提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的增殖能力和增殖效率。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)基溶液，所述DMEM/F12培養(yǎng)基溶液由DMEM/F12干粉培養(yǎng)基用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基45-60g。優(yōu)選的，所述生長(zhǎng)因子I為bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)溶液，所述bFGF溶液由bFGF凍干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述bFGF凍干粉0.1-0.2mg。優(yōu)選的，所述生長(zhǎng)因子II為EGF(表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)溶液，所述EGF溶液由EGF凍干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述EGF凍干粉0.1-0.2mg。優(yōu)選的，所述消化液為胰酶。優(yōu)選的，所述清洗液為PBS緩沖液。上述PBS緩沖液均為含0.05％吐溫-20，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選的，所述細(xì)胞種子為L(zhǎng)SC原代細(xì)胞。優(yōu)選的，所述LSC原代細(xì)胞分離自流產(chǎn)胚胎。進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量份數(shù)的各成分：辛弗林0.3-1甘氨酸0.1-0.7。辛弗林:分子式為C9H13NO2，CAS號(hào)為94-07-5；在培養(yǎng)基添加劑中加入辛弗林和甘氨酸有利于進(jìn)一步提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的增殖能力和增殖效率。進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量份數(shù)的各成分：羥丙基環(huán)糊精0.3-0.8淀粉甘醇酸鈉0.1-0.5。在培養(yǎng)基添加劑中加入羥丙基環(huán)糊精和淀粉甘醇酸鈉可以顯著提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，避免完全培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀、分層和變色等問(wèn)題，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，完全培養(yǎng)基的穩(wěn)定性下降。進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量份數(shù)的各成分：對(duì)氨基苯甲酸0.2-0.5枸櫞酸鈉0.1-0.2。在培養(yǎng)基添加劑中加入對(duì)氨基苯甲酸和枸櫞酸鈉可以有效提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的抗菌能力，有效抑制完全培養(yǎng)基中細(xì)菌的滋生和繁殖，保障完全培養(yǎng)基的使用安全，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，都會(huì)導(dǎo)致全培養(yǎng)基抗菌能力減弱。進(jìn)一步的，所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、二甲基亞砜、殼寡糖、苯扎氯銨用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基30-50g、所述二甲基亞砜3-8g、所述殼寡糖3-6g、所述苯扎氯銨0.2-0.5g。將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、二甲基亞砜、殼寡糖、苯扎氯銨用注射用水溶解配制而成的凍存液的凍存性能較好，采用其凍存的肝源性干細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率較高，而且更利于肝源性干細(xì)胞凍存前后細(xì)胞形態(tài)的維持和穩(wěn)定。進(jìn)一步的，所述凍存液中還含有甲基纖維素和甘油磷酸鈣，每L所述注射用水溶解所述甲基纖維素2-5g、所述甘油磷酸鈣0.2-0.8g。在凍存液中加入甲基纖維素和甘油磷酸鈣可以顯著提高凍存液的穩(wěn)定性，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，凍存液的穩(wěn)定性下降。進(jìn)一步的，所述凍存液中還含有硬脂酸乳酸鈉和山梨酸鉀，每L所述注射用水溶解所述硬脂酸乳酸鈉0.2-0.4g、所述山梨酸鉀0.1-0.3g。在凍存液中加入硬脂酸乳酸鈉和山梨酸鉀可以提高凍存液的抗菌能力，有效抑制凍存液中細(xì)菌的滋生和繁殖，保障凍存液的使用安全。進(jìn)一步的，所述細(xì)胞種子的制備方法包括：無(wú)菌采集流產(chǎn)胚胎上的肝臟組織，用清洗液沖洗1-3min，再用眼科剪剪成1-2mm3大小的組織碎塊，將組織碎塊加入含1％膠原酶I型的PBS緩沖液中，水浴震蕩20-30min，加入完全培養(yǎng)基終止分解，用300目的細(xì)胞篩過(guò)濾后收集懸液，置入離心機(jī)中，2000r/min離心5min，棄去上清液，即可獲得細(xì)胞種子。進(jìn)一步的，所述水浴震蕩的具體條件為34-37℃、260-300r/min。本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：S1.將培養(yǎng)液、培養(yǎng)基添加劑、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II按照重量份數(shù)比為3：0.01：1：1的比例混合均勻，配置成為完全培養(yǎng)基放置在4℃的冰箱中保存；S2.將細(xì)胞種子加入清洗液中，在4℃、1000rpm的條件下離心5min，然后收集細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基重懸，再按照1-2×106個(gè)/mL的密度接種在培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％C02的環(huán)境中，用標(biāo)準(zhǔn)的孵化器孵化細(xì)胞，孵化過(guò)程中每間隔24h更換一次完全培養(yǎng)基；S3.當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到85-95％時(shí)，先用清洗液清洗2次，然后加入5％的消化液，適當(dāng)震蕩搖晃培養(yǎng)瓶，使消化液與細(xì)胞充分接觸，再放入培養(yǎng)箱中消化1-2min，最后加入預(yù)熱至37℃的完全培養(yǎng)基終止消化，然后將獲得的細(xì)胞按照1:3的比例傳代；S4.重復(fù)S3步驟1次，然后在4℃、1000rpm的條件下離心5min，重復(fù)離心2遍，然后收集細(xì)胞放入凍存液中進(jìn)行凍存，凍存密度為1-2×107個(gè)/mL凍存液。本發(fā)明提供的試劑盒可以對(duì)肝源性干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增和冷凍保存，解決了肝源性干細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)效率低、培養(yǎng)批次間差別大、凍存保存后復(fù)活率不理想等問(wèn)題，使肝源性干細(xì)胞在理想營(yíng)養(yǎng)平衡狀態(tài)下進(jìn)行高效擴(kuò)增，大大節(jié)約了培養(yǎng)擴(kuò)增的時(shí)間，非常適用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞，為利用肝源性干細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和醫(yī)學(xué)治療提供了豐富的來(lái)源。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液、培養(yǎng)基添加劑、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量的各成分：實(shí)施例2一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液、培養(yǎng)基添加劑、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量的各成分：實(shí)施例3一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液、培養(yǎng)基添加劑、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量的各成分：實(shí)施例4一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例1不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：辛弗林0.3g甘氨酸0.1g。實(shí)施例5一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：辛弗林0.5g甘氨酸0.5g。實(shí)施例6一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例4不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：羥丙基環(huán)糊精0.3g淀粉甘醇酸鈉0.1g。實(shí)施例7一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：羥丙基環(huán)糊精0.6g淀粉甘醇酸鈉0.2g。實(shí)施例8一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例6不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：對(duì)氨基苯甲酸0.2g枸櫞酸鈉0.1g。實(shí)施例9一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：對(duì)氨基苯甲酸0.3g枸櫞酸鈉0.15g。實(shí)施例10一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例8不同的是：所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、二甲基亞砜、殼寡糖、苯扎氯銨用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基30g、所述二甲基亞砜3g、所述殼寡糖3g、所述苯扎氯銨0.2g。實(shí)施例11一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、二甲基亞砜、殼寡糖、苯扎氯銨用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基40g、所述二甲基亞砜5g、所述殼寡糖5g、所述苯扎氯銨0.3g。實(shí)施例12一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例10不同的是：所述凍存液中還含有甲基纖維素和甘油磷酸鈣，每L所述注射用水溶解所述甲基纖維素2g、所述甘油磷酸鈣0.2g。實(shí)施例13一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例11不同的是：所述凍存液中還含有甲基纖維素和甘油磷酸鈣，每L所述注射用水溶解所述甲基纖維素4g、所述甘油磷酸鈣0.5g。實(shí)施例14一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例12不同的是：所述凍存液中還含有硬脂酸乳酸鈉和山梨酸鉀，每L所述注射用水溶解所述硬脂酸乳酸鈉0.2g、所述山梨酸鉀0.1g。實(shí)施例15一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例11不同的是：所述凍存液中還含有硬脂酸乳酸鈉和山梨酸鉀，每L所述注射用水溶解所述硬脂酸乳酸鈉0.3g、所述山梨酸鉀0.2g。實(shí)施例16一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述細(xì)胞種子的制備方法包括：無(wú)菌采集流產(chǎn)胚胎上的肝臟組織，用清洗液沖洗1min，再用眼科剪剪成1mm3大小的組織碎塊，將組織碎塊加入含1％膠原酶I型的PBS緩沖液中，水浴震蕩20min，加入完全培養(yǎng)基終止分解，用300目的細(xì)胞篩過(guò)濾后收集懸液，置入離心機(jī)中，2000r/min離心5min，棄去上清液，即可獲得細(xì)胞種子。實(shí)施例17一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述細(xì)胞種子的制備方法包括：無(wú)菌采集流產(chǎn)胚胎上的肝臟組織，用清洗液沖洗2min，再用眼科剪剪成1.5mm3大小的組織碎塊，將組織碎塊加入含1％膠原酶I型的PBS緩沖液中，在37℃、300r/min的條件下水浴震蕩25min，加入完全培養(yǎng)基終止分解，用300目的細(xì)胞篩過(guò)濾后收集懸液，置入離心機(jī)中，2000r/min離心5min，棄去上清液，即可獲得細(xì)胞種子。實(shí)施例18一種培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：S1.將培養(yǎng)液、培養(yǎng)基添加劑、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II按照重量份數(shù)比為3：0.01：1：1的比例混合均勻，配置成為完全培養(yǎng)基放置在4℃的冰箱中保存；S2.將細(xì)胞種子加入清洗液中，在4℃、1000rpm的條件下離心5min，然后收集細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基重懸，再按照1×106個(gè)/mL的密度接種在培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％C02的環(huán)境中，用標(biāo)準(zhǔn)的孵化器孵化細(xì)胞，孵化過(guò)程中每間隔24h更換一次完全培養(yǎng)基；S3.當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到85％時(shí)，先用清洗液清洗2次，然后加入5％的消化液，適當(dāng)震蕩搖晃培養(yǎng)瓶，使消化液與細(xì)胞充分接觸，再放入培養(yǎng)箱中消化1min，最后加入預(yù)熱至37℃的完全培養(yǎng)基終止消化，然后將獲得的細(xì)胞按照1:3的比例傳代；S4.重復(fù)S3步驟1次，然后在4℃、1000rpm的條件下離心5min，重復(fù)離心2遍，然后收集細(xì)胞放入凍存液中進(jìn)行凍存，凍存密度為1×107個(gè)/mL凍存液。對(duì)照例1一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液、培養(yǎng)基添加劑、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量的各成分：葡聚糖5g泛酸鈣0.6g磷酸淀粉鈉。0.6g。對(duì)照例2一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液、培養(yǎng)基添加劑、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量的各成分：對(duì)照例3一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：甘氨酸0.5g。對(duì)照例4一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：辛弗林0.5g木糖醇0.5g。對(duì)照例5一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：羥丙基環(huán)糊精0.6g。對(duì)照例6一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：羧甲基纖維素鈉0.6g淀粉甘醇酸鈉0.2g。對(duì)照例7一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：枸櫞酸鈉0.15g。對(duì)照例8一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑還包括如下重量的各成分：對(duì)氨基苯甲酸0.3g山梨酸鉀0.15g。對(duì)照例9一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、二甲基亞砜、殼寡糖用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基40g、所述二甲基亞砜5g、所述殼寡糖5g。對(duì)照例10一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、二甲基亞砜、乳聚糖、苯扎氯銨用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基40g、所述二甲基亞砜5g、所述乳聚糖5g、所述苯扎氯銨0.3g。對(duì)照例11一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例11不同的是：所述凍存液中還含有4g的甲基纖維素。對(duì)照例12一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例11不同的是：所述凍存液中還含有聚乙烯醇和甘油磷酸鈣，每L所述注射用水溶解所述聚乙烯醇4g、所述甘油磷酸鈣0.5g。對(duì)照例13一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例11不同的是：所述凍存液中還含有0.3g的硬脂酸乳酸鈉。對(duì)照例14一種用于培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例11不同的是：所述凍存液中還含有硬脂酸乳酸鈉和丙酸鈉，每L所述注射用水溶解所述硬脂酸乳酸鈉0.3g、所述丙酸鈉0.2g。培養(yǎng)基添加劑對(duì)完全培養(yǎng)基增殖能力的影響分析將實(shí)施例3、實(shí)施例5、對(duì)照例1-4提供的培養(yǎng)基添加劑分別按照實(shí)施例18的方法配置全培養(yǎng)基，再將上述全培養(yǎng)基分別按照實(shí)施例22的方法培養(yǎng)擴(kuò)增肝源性干細(xì)胞，采用臺(tái)盼藍(lán)經(jīng)典染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)原代和第3代活肝源性干細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)表1。表1肝源性干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增效果評(píng)價(jià)由上述結(jié)果可以得出，采用實(shí)施例3提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的增殖速度明顯高于CN104928238A的細(xì)胞培養(yǎng)液，也優(yōu)于采用對(duì)照例1和對(duì)照例2的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基，說(shuō)明本發(fā)明提供的培養(yǎng)基添加劑可以提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的增殖能力。采用實(shí)施例5提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的增殖速度比采用實(shí)施例3、對(duì)照例3、對(duì)照例4提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)肝源性干細(xì)胞的增殖速度更佳，說(shuō)明在培養(yǎng)基添加劑中加入辛弗林和甘氨酸有利于提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的增殖能力。培養(yǎng)基添加劑對(duì)完全培養(yǎng)基穩(wěn)定性的影響分析取實(shí)施例3、實(shí)施例7、對(duì)照例5、對(duì)照例6的培養(yǎng)基添加劑分別按照實(shí)施例18的方法在無(wú)菌條件下配置完全培養(yǎng)基，對(duì)上述完全培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)定性的加速試驗(yàn)和常溫試驗(yàn)：1.加速試驗(yàn)將上述完全培養(yǎng)基均在溫度40℃±2℃下，相對(duì)濕度為75％±5％的條件下放置6個(gè)月，在試驗(yàn)期間1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月末分別取樣一次，檢測(cè)完全培養(yǎng)基的性狀、色澤和氣味，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采取實(shí)施例7提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化；而采取實(shí)施例3、對(duì)照例5和對(duì)照例6提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基出現(xiàn)顏色變深的現(xiàn)象。2.長(zhǎng)期試驗(yàn)將上述完全培養(yǎng)基均在溫度25℃±2℃下，相對(duì)濕度為60％±10％的條件下放置12個(gè)月，在試驗(yàn)期間0個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月末分別取樣一次，檢測(cè)完全培養(yǎng)基的性狀、色澤和氣味，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采取實(shí)施例7提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化；而采取實(shí)施例3、對(duì)照例5和對(duì)照例6提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀和顏色變深的現(xiàn)象。從上述加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)的結(jié)果可知，在培養(yǎng)基添加劑中加入羥丙基環(huán)糊精和淀粉甘醇酸鈉可以顯著提高完全培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，避免完全培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀、分層和變色等問(wèn)題，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，完全培養(yǎng)基的穩(wěn)定性下降。培養(yǎng)基添加劑對(duì)完全培養(yǎng)基安全性的影響分析取實(shí)施例3、實(shí)施例9、對(duì)照例7、對(duì)照例8的培養(yǎng)基添加劑分別按照實(shí)施例18的方法在無(wú)菌條件下配置完全培養(yǎng)基，將上述完全培養(yǎng)基均在溫度為25℃±2℃，相對(duì)濕度為60％±10％的條件下密閉保存12個(gè)月，然后檢測(cè)完全培養(yǎng)基中的細(xì)菌總數(shù)，結(jié)果如表2所示。表2完全培養(yǎng)基中細(xì)菌總數(shù)統(tǒng)計(jì)實(shí)施例3實(shí)施例9對(duì)照例7對(duì)照例8細(xì)菌總數(shù)(cfu/mL)89753863838由上述結(jié)果可知，在培養(yǎng)基添加劑中加入對(duì)氨基苯甲酸和枸櫞酸鈉可以有效提高完全培養(yǎng)基防止細(xì)菌感染的能力，有效抑制完全培養(yǎng)基中細(xì)菌的滋生和繁殖，保障完全培養(yǎng)基的使用安全，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，都會(huì)導(dǎo)致全培養(yǎng)基抗菌能力減弱。凍存液對(duì)肝源性干細(xì)胞凍存性能的影響評(píng)價(jià)將肝源性干細(xì)胞分別加入1.5mL實(shí)施例11、對(duì)照例9和對(duì)照例10提供的的凍存液和CN104928238A提供的的細(xì)胞凍存液重懸后加入2mL細(xì)胞凍存管中，并控制細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)/mL；迅速將細(xì)胞凍存管轉(zhuǎn)移至已加好異丙醇的細(xì)胞程序降溫盒中，放入-80℃超低溫冰箱2～3天后，將細(xì)胞凍存管轉(zhuǎn)移至液氮保存；一個(gè)月后進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，將保存于液氮中的細(xì)胞凍存管取出，轉(zhuǎn)移至37℃水浴鍋中迅速解凍，用移液管將細(xì)胞轉(zhuǎn)入之前預(yù)溫好的10mL按照實(shí)施例18的方法配置的完全培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻后，取0.5mL細(xì)胞懸液檢測(cè)細(xì)胞存活率和細(xì)胞形態(tài)變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。表3凍存液對(duì)肝源性干細(xì)胞凍存性能的影響組別細(xì)胞存活率(％)細(xì)胞形態(tài)變化實(shí)施例1198.1幾乎不變對(duì)照例977.9輕微形態(tài)變化對(duì)照例1084.0輕微形態(tài)變化CN104928238A67.6輕微形態(tài)變化將實(shí)施例11提供的凍存液的凍存性能與對(duì)照例9、對(duì)照例10提供的的凍存液和CN104928238A提供的細(xì)胞凍存液的凍存性能相比，可以得出本發(fā)明提供的凍存液的凍存性能相對(duì)更好，肝源性干細(xì)胞復(fù)蘇后存活率較高，而且更利于肝源性干細(xì)胞凍存前后細(xì)胞形態(tài)的維持和穩(wěn)定。凍存液穩(wěn)定性評(píng)價(jià)1.加速試驗(yàn)取實(shí)施例11、實(shí)施例13、對(duì)照例11和對(duì)照例12提供的凍存液，均在溫度40℃±2℃下，相對(duì)濕度為75％±5％的條件下放置6個(gè)月，在試驗(yàn)期間1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月末分別取樣一次，檢測(cè)凍存液的性狀、色澤和氣味，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例13提供的凍存液的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化；而實(shí)施例11、對(duì)照例11和對(duì)照例12提供的凍存液出現(xiàn)少量沉淀，并且顏色變深。2.長(zhǎng)期試驗(yàn)取實(shí)施例11、實(shí)施例13、對(duì)照例11和對(duì)照例12提供的凍存液，均在溫度25℃±2℃下，相對(duì)濕度為60％±10％的條件下放置12個(gè)月，在試驗(yàn)期間0個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月末分別取樣一次，檢測(cè)凍存液的性狀、色澤和氣味，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例13提供的凍存液的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化；而實(shí)施例11、對(duì)照例11和對(duì)照例12提供的凍存液出現(xiàn)沉淀和顏色變深的現(xiàn)象。從上述加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)的結(jié)果可知，在凍存液中加入甲基纖維素和甘油磷酸鈣可以顯著提高凍存液的穩(wěn)定性，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，凍存液的穩(wěn)定性下降。凍存液安全性評(píng)價(jià)分別取實(shí)施例11、實(shí)施例15、對(duì)照例13和對(duì)照例14提供的凍存液，均在溫度為25℃±2℃，相對(duì)濕度為60％±10％的條件下密閉保存12個(gè)月，檢測(cè)凍存液中的細(xì)菌總數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。表4凍存液中細(xì)菌總數(shù)統(tǒng)計(jì)實(shí)施例11實(shí)施例15對(duì)照例13對(duì)照例14細(xì)菌總數(shù)(cfu/mL)899162871843由上述結(jié)果可知，在凍存液中加入硬脂酸乳酸鈉和山梨酸鉀可以提高凍存液的抗菌能力，有效抑制凍存液中細(xì)菌的滋生和繁殖，保障凍存液的使用安全。最后應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3