本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的殺蟲(chóng)活性。

背景技術(shù)：

幾丁質(zhì)(Chitin)是以N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(GlcNAc)為基本單元，通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接的天然線(xiàn)性直鏈多糖。作為重要的結(jié)構(gòu)組成部分，幾丁質(zhì)大量存在于真菌和硅藻的細(xì)胞壁、軟體動(dòng)物的外殼、線(xiàn)蟲(chóng)的卵殼以及甲殼類(lèi)生物和昆蟲(chóng)的外骨骼中，其合成和水解的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于這些生物的生長(zhǎng)發(fā)育具有極其重要的作用。目前已知有兩類(lèi)糖基水解酶參與了幾丁質(zhì)的水解，分別是來(lái)自糖基水解酶18家族的幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)和來(lái)自糖基水解酶20家族的具有幾丁質(zhì)水解活性的β-N-乙酰-D-己糖胺酶(EC 3.2.1.52)，前者將多聚幾丁質(zhì)降解成為幾丁寡糖，后者將幾丁寡糖進(jìn)一步水解成為GlcNAc。針對(duì)家蠶蛻皮液的蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶Chi-h、ChtI和ChtII以及己糖胺酶Hex1參與了家蠶的蛻皮過(guò)程，同時(shí)對(duì)不同生物的RNA干擾實(shí)驗(yàn)也表明，當(dāng)上訴糖基水解酶的表達(dá)被干擾后，昆蟲(chóng)會(huì)因?yàn)橥懫げ徽６劳?。因此，?8家族幾丁質(zhì)酶和20家族己糖胺酶作為農(nóng)藥設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)高效的糖基水解酶抑制劑對(duì)于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治具有非常重要的意義。

目前已知的抑制劑往往只能專(zhuān)一性地抑制某一家族的糖基水解酶，而同時(shí)針對(duì)18家族幾丁質(zhì)酶和20家族己糖胺酶的抑制劑報(bào)道較少，TGM-(GlcNAc)_2-4和NGT衍生物是目前發(fā)現(xiàn)的同時(shí)對(duì)幾丁質(zhì)酶和己糖胺酶都具有抑制效果的抑制劑。前者對(duì)來(lái)源于亞洲玉米螟的己糖胺酶OfHex1和幾丁質(zhì)酶OfChi-h均具有較高的抑制活性，后者是在己糖胺酶抑制劑NGT的基礎(chǔ)上通過(guò)進(jìn)一步的衍生化獲得的。這些抑制劑雖然對(duì)幾丁質(zhì)酶和己糖胺酶都表現(xiàn)出較高的抑制活性，但是復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)使得其合成困難，生產(chǎn)成本很高，這限制了抑制劑的進(jìn)一步衍生化和應(yīng)用，所以有必要進(jìn)行新的抑制劑的篩選和開(kāi)發(fā)。微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物是微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的對(duì)該生物無(wú)明顯生理功能的一類(lèi)小分子，這些天然小分子在后續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)以及進(jìn)一步的衍生化和應(yīng)用上較之復(fù)雜的化學(xué)合成化合物有較大的優(yōu)勢(shì)，因此在抑制劑的篩選過(guò)程中往往是非常重要的篩選對(duì)象。化合物phlegmacin B1，是傘菌Cortinarius odorifer分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，與傘菌的顏色形成密切相關(guān)，然而到目前為止，針對(duì)化合物phlegmacin B1的生物活性的報(bào)道很少，特別是針對(duì)糖基水解酶的生物活性還沒(méi)有報(bào)導(dǎo)。因此，研究發(fā)現(xiàn)化合物phlegmacin B1的生物活性對(duì)于擴(kuò)展其應(yīng)用有非常積極的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的研究中，為了找到高效的糖基水解酶抑制劑，尤其是尋找到一種同時(shí)對(duì)幾丁質(zhì)酶和己糖胺酶都具有抑制效果的抑制劑，本發(fā)明篩選了大量的化合物，通過(guò)圓二色譜鑒定，抑制效果、選擇性和殺蟲(chóng)活性評(píng)價(jià)對(duì)多種化合物的結(jié)構(gòu)和抑制活性進(jìn)行了抑制效果評(píng)價(jià)研究，最終篩選到了一種多靶點(diǎn)抑制劑，并且驗(yàn)證了其是對(duì)亞洲玉米螟具有顯著殺蟲(chóng)效果的多靶點(diǎn)抑制劑。

首先，本發(fā)明公開(kāi)一種抑制幾丁質(zhì)酶和己糖胺酶活性的多靶點(diǎn)抑制劑，其結(jié)構(gòu)式如圖1B所示，即phlegmacin B1。

另外，本發(fā)明公開(kāi)所述的抑制劑的衍生物，其結(jié)構(gòu)式如下所示：

本發(fā)明還公開(kāi)所述的抑制劑和/或其衍生物在抑制幾丁質(zhì)酶和己糖胺酶活性中的應(yīng)用。具體的，所述抑制劑和/或其衍生物在抑制幾丁質(zhì)酶和己糖胺酶活性中使用的終濃度為不低于13ppm。

本發(fā)明還公開(kāi)所述的抑制劑在防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)方面的應(yīng)用。

具體的所述的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)是鱗翅目昆蟲(chóng)，包括麥蛾、棉紅鈴蟲(chóng)、馬鈴薯塊莖蛾、甘薯麥蛾、棉褐帶卷蛾、大豆食心蟲(chóng)、梨大食心蟲(chóng)、亞洲玉米螟、大造橋蟲(chóng)、菜粉蝶、棉鈴蟲(chóng)、舞毒蛾、玉帶風(fēng)蝶、金鳳蝶、舟形毛蟲(chóng)、黃腹燈蛾、紅腹燈蛾、美國(guó)白蛾、葡萄天蛾和稻苞蟲(chóng)等。

本發(fā)明提供了評(píng)價(jià)化合物phlegmacin B1抑制活性所獲得的數(shù)據(jù)，包括抑制劑篩選、抑制常數(shù)測(cè)定和選擇性測(cè)定所獲得的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，在篩選的所有556個(gè)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中，化合物phlegmacin B1(終濃度13ppm)對(duì)幾丁質(zhì)酶OfChi-h和己糖胺酶OfHex1的抑制率分別為90.4％和71.4％，抑制常數(shù)K_i分別為5.5μM和26μM。對(duì)化合物的適用對(duì)象測(cè)定表明，在20μM終濃度下，化合物phlegmacin B1對(duì)幾丁質(zhì)酶OfChi-h和己糖胺酶OfHex1表現(xiàn)出較高的抑制活性，對(duì)于其他來(lái)源的幾丁質(zhì)酶和己糖胺酶(除了粘質(zhì)沙雷氏菌來(lái)源的SmChiC之外)也同樣表現(xiàn)出一定的抑制活性。綜上，化合物phlegmacin B1針對(duì)不同物種來(lái)源的幾丁質(zhì)酶和己糖胺酶均能表現(xiàn)出抑制活性，同時(shí)根據(jù)抑制常數(shù)可以推斷，當(dāng)化合物phlegmacin B1的濃度≥5μM時(shí)，對(duì)幾丁質(zhì)酶OfChi-h有較強(qiáng)抑制活性，當(dāng)其濃度≥30μM時(shí)，對(duì)己糖胺酶OfHex1表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制活性。

本發(fā)明還公開(kāi)一種評(píng)價(jià)化合物殺蟲(chóng)活性的方法，具體是用二甲基亞砜作為溶劑溶解化合物，采用注射方式直接將化合物導(dǎo)入研究對(duì)象體內(nèi)。對(duì)于本申請(qǐng)而言，所述評(píng)價(jià)化合物殺蟲(chóng)活性的方法中所述化合物為上文所述的抑制劑phlegmacin B1及其衍生物。

傳統(tǒng)的研究化合物殺蟲(chóng)活性的手段往往是將化合物與飼喂的食物混合，通過(guò)蟲(chóng)子本身的攝食將化合物導(dǎo)入體內(nèi)，但這樣的方式往往存在很多問(wèn)題。因?yàn)榛衔锉旧淼念伾馕兜鹊挠绊?，蟲(chóng)子會(huì)對(duì)混合有化合物的食物產(chǎn)生拒食反應(yīng)，此外，通過(guò)攝食進(jìn)入蟲(chóng)子體內(nèi)的化合物需要經(jīng)過(guò)消化系統(tǒng)，在這一過(guò)程中化合物的結(jié)構(gòu)往往會(huì)遭到破壞，而且因?yàn)榛衔锉旧淼乃苄?、親脂性等的性質(zhì)，往往不能很好地被蟲(chóng)子吸收進(jìn)入血淋巴到達(dá)作用靶點(diǎn)。上述種種因素均會(huì)對(duì)殺蟲(chóng)活性的評(píng)價(jià)產(chǎn)生影響。本發(fā)明提出的評(píng)價(jià)化合物殺蟲(chóng)活性的方法的創(chuàng)新點(diǎn)之一在于采用注射方式代替?zhèn)鹘y(tǒng)的喂食方式直接將化合物導(dǎo)入研究對(duì)象亞洲玉米螟體內(nèi)，這樣就避免了拒食、化合物結(jié)構(gòu)被破壞等的影響。此外，該方法的另一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)在于用二甲基亞砜DMSO代替水作為溶劑溶解化合物，這保證了化合物的高溶解性，從而更好的被蟲(chóng)子吸收，到達(dá)作用靶點(diǎn)。事實(shí)上，對(duì)蟲(chóng)子表型的分類(lèi)統(tǒng)計(jì)也不同于以往只針對(duì)死亡率的統(tǒng)計(jì)方式，在該統(tǒng)計(jì)方式下可以較好地觀(guān)察到蟲(chóng)子各個(gè)表型的死亡率，從而更好地研究化合物的作用方式。經(jīng)過(guò)研究化合物phlegmacin B1在0.5μM濃度下對(duì)亞洲玉米螟的殺蟲(chóng)活性可以發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組有34.15％的幼蟲(chóng)在注射0.5μM化合物的10天內(nèi)陸續(xù)死亡，有31.7％的幼蟲(chóng)則因?yàn)橥懫げ徽o(wú)法形成正常的蛹。

附圖說(shuō)明

圖1是化合物phlegmacin B1的圓二色譜圖(圖A)及結(jié)構(gòu)式(圖B)。其中圖A的橫坐標(biāo)表示平面偏振光的波長(zhǎng)λ，單位為nm；縱坐標(biāo)表示吸收系數(shù)之差Δε，單位為cm²/mol；圖中曲線(xiàn)反映在不同的波長(zhǎng)下，化合物phlegmacin B1對(duì)組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸收系數(shù)的差異，其中276nm處的吸收系數(shù)之差為化合物phlegmacin B1的特征吸收峰，對(duì)應(yīng)圖B的結(jié)構(gòu)式。

圖2為化合物phlegmacin B1對(duì)OfChi-h(圖A)和OfHex1(圖B)的抑制常數(shù)K_i測(cè)定示意圖。其中橫坐標(biāo)[I]表示化合物phlegmacin B1的濃度，單位為μM；縱坐標(biāo)1/v表示反應(yīng)速率的倒數(shù)；圖中3條直線(xiàn)對(duì)應(yīng)不同的底物濃度下，1/v隨化合物phlegmacin B1濃度的變化而變化的趨勢(shì)，從上到下底物濃度依次為50μM、30μM和15μM，3條直線(xiàn)的交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)數(shù)值既為化合物phlegmacin B1對(duì)OfChi-h和OfHex1的抑制常數(shù)K_i，分別為5.5μM和26μM。

圖3是20μM終濃度下化合物phlegmacin B1對(duì)不同物種來(lái)源的18家族幾丁質(zhì)酶(GH18)和20家族己糖胺酶(GH20)的抑制活性示意圖。圖中橫坐標(biāo)表示抑制活性，縱坐標(biāo)表示不同來(lái)源的糖基水解酶。

圖4為0.5μM化合物phlegmacin B1對(duì)亞洲玉米螟的殺蟲(chóng)活性示意圖，其中A為對(duì)照組，B為實(shí)驗(yàn)組，C為表型示意圖。A、B圖橫坐標(biāo)表示統(tǒng)計(jì)時(shí)間，縱坐標(biāo)表示相應(yīng)表型的亞洲玉米螟所占的百分比；C圖為注射化合物后出現(xiàn)的各表型示意圖，表型圖片下方A對(duì)應(yīng)對(duì)照組，B對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組；■代表正常幼蟲(chóng)，▲代表死亡幼蟲(chóng)，●代表正常蛹，◆代表不正常蛹。

圖5為化合物phlegmacin B1及其衍生物與幾丁質(zhì)酶OfChi-h(圖A)和己糖胺酶OfHex1(圖B)的結(jié)合模式示意圖。其中化合物phlegmacin B1為圖中1所示，化合物phlegmacin A1為圖中2所示，化合物sinapiquinone 144為圖中3所示，化合物phlegmacinquinones 140為圖中4所示，化合物phlegmacinquinones 141為圖中5所示。幾丁質(zhì)酶OfChi-h參與化合物結(jié)合的氨基酸分別為W251、W143、W515以及催化氨基酸E291；己糖胺酶OfHex1參與化合物結(jié)合的氨基酸分別為V327、W490以及催化氨基酸E328。

具體實(shí)施方式

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行等同替換或改變均屬于本發(fā)明保護(hù)范疇。

實(shí)施例1

將幾丁質(zhì)酶OfChi-h和己糖胺酶OfHex1作為靶標(biāo)，對(duì)556個(gè)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑制劑篩選。具體步驟如下：

正對(duì)照：設(shè)置2組平行正對(duì)照。在30℃反應(yīng)溫度，100μL反應(yīng)體系的條件下，2nmol/L糖基水解酶和50μmol/L底物(OfChi-h：MU-(GlcNAc)₂；OfHex1：MU-GlcNAc)在20mmol/L的pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中孵育30min，之后加入100μL 0.5mol/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)液用360nm波長(zhǎng)的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)后測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的吸光度值。

實(shí)驗(yàn)組：設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)組。在30℃反應(yīng)溫度，100μL反應(yīng)體系的條件下，2nmol/L糖基水解酶和50μmol/L底物(OfChi-h：MU-(GlcNAc)₂；OfHex1：MU-GlcNAc)以及13ppm化合物在20mmol/L的pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中孵育30min，之后加入100μL 0.5mol/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)液用360nm波長(zhǎng)的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)后測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的吸光度值。

根據(jù)以下公式計(jì)算抑制活性

抑制百分?jǐn)?shù)＝(正對(duì)照-實(shí)驗(yàn)組)/正對(duì)照*100

篩選來(lái)源的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物經(jīng)由各類(lèi)真菌發(fā)酵產(chǎn)生，數(shù)目較大(556個(gè))，種類(lèi)豐富，結(jié)構(gòu)差異明顯，主要有抗生素、激素、生物堿、各類(lèi)毒素及維生素等，其中化合物phlegmacin B1屬于二聚化的蒽醌類(lèi)化合物。對(duì)抑制劑進(jìn)行篩選時(shí)，先進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的初篩，在初篩的基礎(chǔ)上對(duì)初篩獲得的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的復(fù)篩(具體步驟同上)確認(rèn)后獲得最終數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，有8個(gè)化合物對(duì)OfChi-h和OfHex1均具有抑制效果，其中化合物phlegmacin B1的抑制效果最好，在13ppm終濃度下對(duì)OfChi-h和OfHex1抑制率分別為90.4％和71.4％。

實(shí)施例2

1)化合物phlegmacin B1的絕對(duì)構(gòu)型鑒定

取500μL100％甲醇加入比色皿內(nèi)進(jìn)行圓二色掃描，結(jié)果作為負(fù)對(duì)照。將化合物phlegmacin B1溶解在100％甲醇中，使終濃度為0.7μM，取500μL加入比色皿，并于圓二色譜儀中測(cè)定其圓二色譜，結(jié)果如圖1A所示。將實(shí)驗(yàn)測(cè)得的圓二色譜圖與文獻(xiàn)《Biosynthesis and Stereochemistry of Phlegmacin-Type Fungal Pigments》中的圓二色譜圖進(jìn)行比對(duì)得到化合物phlegmacin B1的絕對(duì)構(gòu)型，如圖1B。實(shí)驗(yàn)參數(shù)：光程2mm；掃描波長(zhǎng)190-350nm；速度1nm/s；重復(fù)次數(shù)3次。

2)抑制常數(shù)K_i測(cè)定

OfChi-h：MU-(GlcNAc)₂作為底物，反應(yīng)設(shè)置三組底物濃度梯度，終濃度分別為15μM、30μM和50μM。在每組底物濃度下取終濃度分別為25、12.5、6.25、3.125、0μM五組化合物濃度梯度進(jìn)行抑制活性測(cè)定。反應(yīng)體系為100μL，緩沖環(huán)境為20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.0，酶終濃度為2nM，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間30min，之后加入100μL濃度為0.5M的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，釋放的MU經(jīng)由360nm激發(fā)光激發(fā)后于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。數(shù)據(jù)采用Dixon法繪圖，求得K_i＝5.5μM，結(jié)果如圖2A所示。

OfHex1：MU-GlcNAc作為底物，反應(yīng)設(shè)置三組底物濃度梯度，終濃度分別為15μM、30μM和50μM。在每組底物濃度下取終濃度分別為25、12.5、6.25、3.125、0μM五組化合物濃度梯度進(jìn)行抑制活性測(cè)定。反應(yīng)體系為100μL，緩沖環(huán)境為20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.0，酶終濃度為2nM，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間30min，之后加入100μL濃度為0.5M的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，釋放的MU經(jīng)由360nm激發(fā)光激發(fā)后于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。數(shù)據(jù)采用Dixon法繪圖，求的K_i＝26μM，結(jié)果如圖2B所示。

3)化合物的適用對(duì)象測(cè)定

GH18：選擇7個(gè)不同物種來(lái)源的18家族幾丁質(zhì)酶對(duì)化合物phlegmacin B1的抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，7個(gè)幾丁質(zhì)酶分別為來(lái)源于亞洲玉米螟的OfChi-h和OfChtI，來(lái)源于人的殼三糖酶HsCht，來(lái)源于煙曲霉的AfChiB1以及來(lái)源于粘質(zhì)沙雷氏菌的SmChiA、SmChiB和SmChiC。反應(yīng)設(shè)置2組平行正照組和3組平行實(shí)驗(yàn)組。MU-(GlcNAc)₂作為底物，終濃度為50μM，化合物phlegmacin B1終濃度為20μM。反應(yīng)體系為100μL，緩沖環(huán)境為20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.0，各幾丁質(zhì)酶終濃度為2nM，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間30min，之后加入100μL濃度為0.5M的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，釋放的MU經(jīng)由360nm激發(fā)光激發(fā)后于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。根據(jù)實(shí)施例1(3)中公式計(jì)算抑制活性。

GH20：選擇5個(gè)不同來(lái)源的20家族己糖胺酶對(duì)化合物phlegmacin B1的抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，5個(gè)己糖胺酶分別為來(lái)源于亞洲玉米螟的OfHex1和OfHex2，來(lái)源于人的HsHexB，來(lái)源于植物刀豆的CeHex以及來(lái)源于粘質(zhì)沙雷氏菌的SmChb。反應(yīng)設(shè)置2組平行正照組和3組平行實(shí)驗(yàn)組。MU-GlcNAc作為底物，終濃度為50μM，化合物phlegmacin B1終濃度為20μM。反應(yīng)體系為100μL，緩沖環(huán)境為20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.0，各己糖胺酶終濃度為2nM，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間30min，之后加入100μL濃度為0.5M的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，釋放的MU經(jīng)由360nm激發(fā)光激發(fā)后于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。根據(jù)實(shí)施例1(3)中公式計(jì)算抑制活性。

抑制活性如圖3所示，結(jié)果表明化合物phlegmacin B1在20μM濃度下對(duì)OfChi-h和OfHex1均具有較高抑制活性，抑制率分別為81％和70％，對(duì)于其他來(lái)源的18家族(除了SmChiC)和20家族糖基水解酶也同樣表現(xiàn)出一定的抑制活性，這說(shuō)明化合物phlegmacin B1對(duì)幾丁質(zhì)酶和己糖胺酶的抑制活性有一定的廣譜性。

實(shí)施例3

化合物phlegmacin B1的殺蟲(chóng)活性評(píng)價(jià)具體步驟如下：

實(shí)驗(yàn)選取五齡第四天的健康幼蟲(chóng)作為實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。化合物phlegmacin B1用5％DMSO溶解，濃度為0.5μM。對(duì)照組幼蟲(chóng)注射2μL 5％的DMSO，實(shí)驗(yàn)組幼蟲(chóng)注射2μL濃度為0.5μM的化合物phlegmacin B1。注射后的幼蟲(chóng)于26℃，相對(duì)濕度70％-90％，每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)至全部化蛹為止，期間每天對(duì)正常幼蟲(chóng)、死亡幼蟲(chóng)、正常蛹和不正常蛹的數(shù)量和表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果繪制成圖4，其中A為對(duì)照組，B為實(shí)驗(yàn)組，C為表型。結(jié)果表明，10天后對(duì)照組只有10％的幼蟲(chóng)死亡，其余90％的幼蟲(chóng)全部蛻皮成為正常的蛹，而實(shí)驗(yàn)組在10天后有高達(dá)34.15％的幼蟲(chóng)死亡，有31.7％的幼蟲(chóng)則因?yàn)橥懫げ徽o(wú)法形成正常的蛹，之后也陸續(xù)死亡，只有34.15％的幼蟲(chóng)蛻皮成為正常的蛹，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明化合物phlegmacin B1對(duì)亞洲玉米螟有顯著的殺蟲(chóng)效果，致死率為65.85％。

實(shí)施例4

化合物phlegmacin B1及其衍生物與幾丁質(zhì)酶OfChi-h和己糖胺酶OfHex1的結(jié)合模式采用分子對(duì)接進(jìn)行探究，具體步驟如下：先用PRODRG軟件將化合物phlegmacin B1及其衍生物的立體構(gòu)型轉(zhuǎn)換成PDB格式保存。幾丁質(zhì)酶OfChi-h和己糖胺酶OfHex1的PDB格式文件則使用PyMOL軟件從復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中獲得(OfChi-h從蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫(kù)中序列號(hào)為5GQB的OfChi-h-(GlcN)₇復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中獲得，OfHex1從序列號(hào)為3NSN的OfHex1-TMG復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中獲得)?；衔锱c蛋白質(zhì)的PDBQT文件則使用MGLTools軟件對(duì)前述的PDB文件轉(zhuǎn)換而來(lái)。對(duì)接時(shí)設(shè)定OfChi-h和OfHex1的對(duì)接區(qū)域大小分別為和準(zhǔn)備好對(duì)接文件并設(shè)定好對(duì)接參數(shù)后，在AutoDock4軟件中采用拉馬克遺傳算法對(duì)化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合能量進(jìn)行評(píng)價(jià)。最低結(jié)合能所對(duì)應(yīng)的結(jié)合構(gòu)象既為化合物與蛋白質(zhì)的最優(yōu)結(jié)合模式。從圖5的對(duì)接結(jié)果可以看出，化合物phlegmacin B1及其衍生物與幾丁質(zhì)酶OfChi-h的結(jié)合模式基本一致(圖A)，氨基酸W251、W143、W515與化合物形成疏水相互作用，催化氨基酸E291則與化合物形成氫鍵相互作用。對(duì)于己糖胺酶OfHex1而言，化合物phlegmacin B1及其衍生物的結(jié)合模式也基本一致(圖B)，化合物與OfHex1的結(jié)合主要依靠與W490的疏水相互作用以及與V327和催化氨基酸E328之間的氫鍵實(shí)現(xiàn)?；衔锱c酶活性口袋的結(jié)合模式?jīng)Q定了化合物的抑制活性，鑒于衍生物phlegmacin A1、phlegmacinquinones 140、phlegmacinquinones 141和sinapiquinone 144擁有與化合物phlegmacin B1一致的結(jié)合模式，可以判斷這些衍生物同樣對(duì)OfChi-h和OfHex1表現(xiàn)出抑制效果。