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出芽短梗霉alb1基因敲除突變株及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:12248238閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一株出芽短梗霉alb1基因敲除突變株,其特征在于,是將出芽短梗霉菌株中的alb1基因的全部或部分編碼基因敲除,替換為潮霉素B抗性基因盒;

優(yōu)選的,是將alb1基因從第1位至1911位之間的編碼基因敲除,替換為潮霉素B抗性基因盒。

2.如權(quán)利要求1所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株,其特征在于,所述潮霉素B抗性基因盒包含:出芽短梗霉轉(zhuǎn)錄延長因子啟動(dòng)子PTEF和潮霉素B抗性基因HygR;

所述出芽短梗霉轉(zhuǎn)錄延長因子啟動(dòng)子PTEF的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示;

所述潮霉素B抗性基因序列hygR序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

3.如權(quán)利要求1或2所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株,其特征在于,所述出芽短梗霉菌株為菌株As3.3984。

4.如權(quán)利要求3所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株,已于2016年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,簡稱CGMCC,地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號,中國科學(xué)院微生物研究所,菌種保藏號為CGMCC NO.12509。

5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株的構(gòu)建方法,其特征在于,包括如下步驟:

(1)合成含alb1左同源臂-潮霉素B抗性基因盒-alb1右同源臂的重組片段,重組片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;

(2)將步驟(1)的重組片段連接到pUC18質(zhì)粒上的EcoRI位點(diǎn),得到alb1基因敲除質(zhì)粒;

(3)將alb1基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到出芽短梗霉感受態(tài)細(xì)胞中,通過潮霉素B抗性篩選得到抗性菌株;對抗性菌株進(jìn)行鑒定,篩選得到敲除alb1基因的突變株。

6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法,其特征在于,步驟(3)中,敲除alb1基因的突變株的篩選方法為:根據(jù)SEQ ID NO.4序列合成可以擴(kuò)增潮霉素B抗性基因的引物hyg-1和hyg-2,如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示;根據(jù)出芽短梗霉As3.3984基因組中alb1左同源臂左側(cè)序列設(shè)計(jì)引物out-1,如SEQ ID NO.7所示,根據(jù)alb1右同源臂右側(cè)序列的反向互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物out-2,如SEQ ID NO.8所示。用hyg-1/hyg-2和out1-1/out-2兩對引物通過PCR的方法對抗性菌株進(jìn)行鑒定。

7.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株在制備微生物多糖中的應(yīng)用。

8.一種制備微生物多糖的方法,其特征在于,包括如下步驟:在多糖發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)上述的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株,發(fā)酵液離心,收集上清液,向上清液中加入工業(yè)乙醇沉淀多糖,離心,收集沉淀,干燥,純化,即得微生物多糖。

9.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,所述多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:蔗糖100.0g/L,酵母膏2.0g/L,NaCl 1.0g/L,MgSO4.7H2O 0.2g/L,K2HPO4 5.0g/L,(NH4)2SO4 0.6g/L,pH6.5。

10.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:28℃震蕩培養(yǎng)72小時(shí)。

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