專利名稱：酶法輔助提取蒺藜多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用酶法從可用于保健食品的中草藥--蒺藜中提取多糖的方 法。
背景技術(shù)：
蒺藜(Fructus Tribuli)為蒺藜科(Zygophyllaceae)蒺藜屬草本植物，又 名刺蒺藜，硬蒺藜或白蒺藜，為一年或多年生的草本植物，為蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestrisL.的干燥成熟果實(shí)，為國(guó)家2005版藥典收錄和國(guó)家衛(wèi)生部規(guī)定可用于保健食 品的藥物，具有平肝解郁、活血祛風(fēng)、明目、止癢的功效，主治頭痛眩暈、胸脅脹痛、乳閉乳 癰、目赤翳障、風(fēng)疹瘙癢等癥。蒺藜的化學(xué)成分主要有留體皂甙類、黃酮類化合物、多糖類、生物堿、醌類化合物、 氨基酸等。但目前對(duì)蒺藜的研究主要集中在蒺藜皂苷的提取及利用，如國(guó)內(nèi)以蒺藜的莖葉 為原料開發(fā)的“心腦舒通”以及國(guó)外以刺蒺藜為原料開發(fā)的用于增強(qiáng)性功能的“Tribustan” 和“Vitanone”以及軟化血管的“Tribusaponin”，這些藥物都是以蒺藜皂苷為主要藥效成 分。研究表明蒺藜多糖有抗遺傳損傷的作用(劉啟福，陳裕明，王健梅，等.刺蒺藜多 糖對(duì)遺傳損傷防護(hù)作用的研究.中國(guó)中藥雜志，1995，20(7) :427-429)，還有較強(qiáng)的免疫抑 制作用(師勤，馬果玉，徐珞珊，等.比色法測(cè)定蒺藜中多糖的含量.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 1997，28 (5) 291-293)，但關(guān)于蒺藜多糖提取方面的研究未見報(bào)道，多糖因具有多種生物活性而成為當(dāng)今生物醫(yī)藥研究和開發(fā)的一大熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的多 糖提取方法主要是采用熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法提取。熱水浸提法時(shí)間長(zhǎng)、耗能高、 雜質(zhì)含量高、收率低；酸或堿浸提法雖能提高提取率，但酸能破壞多糖的苷鍵而形成較多的 單糖和低聚糖，降低多糖含量，稀堿提取也會(huì)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)造成破壞。此外，酸、堿浸提對(duì)設(shè)備 有一定的影響，且需經(jīng)中和反應(yīng)，操作程序較為繁瑣，難以在工業(yè)化生產(chǎn)中得以廣泛應(yīng)用。中國(guó)專利CN1144847A “酶處理提取中藥材中皂苷成分的方法”中提及了酶法提取 人參皂武，CN02158188. 6 “酶處理提取黃芪多糖”中提及了使用纖維素酶、半纖維素酶及蛋 白酶提取黃芪多糖，但尚未見到酶法輔助處理提取蒺藜多糖的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用酶法輔助提取蒺藜多糖的方法，該方法可提高蒺 藜多糖提取率和所得多糖的純度，而不破壞蒺藜多糖結(jié)構(gòu)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是1)粉碎過篩將干燥的蒺藜粉碎后過40目篩；2)酶處理按質(zhì)量份數(shù)取5份過篩后的蒺藜粉末浸泡于100-150份的蒸餾水中并 調(diào)節(jié)PH值至4. 6-7. 0，然后水浴鍋升至50-55°C，再添加蒺藜粉末質(zhì)量0. 5-3. 3%的單一或 復(fù)合酶，并50-55 °C保溫酶解2. 0-4. 5h ；
3)滅酶過濾將浸泡液加熱至95°C，并保溫10-20min，使加入的酶制劑變性失活， 然后過濾，收集濾液為蒺藜多糖提取液；4)濃縮及醇沉將步驟3)得到的蒺藜多糖提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原蒺藜粉 末相同的質(zhì)量體積，然后再加入3-4倍濃縮液體積的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置10-20h ；5)抽濾及洗滌將步驟4)靜置的乙醇沉淀物抽濾后得到粗多糖，并用75-85%的 乙醇液進(jìn)行洗滌，再用氯仿及正丁醇進(jìn)行洗滌；6)干燥及粉碎將步驟5)得到的沉淀在45-60°C烘干至恒重，然后粉碎，即獲得蒺 藜多糖。本發(fā)明的酶采用活性為8000U/g的纖維素酶、活性為10000U/g的木聚糖酶(購(gòu)自 肇東國(guó)科北方酶制劑有限公司)、活性為30000U/g的果膠酶(購(gòu)自肇東國(guó)科北方酶制劑有 限公司)中的一種或幾種。所述的纖維素酶采用綠色木霉(編號(hào)30048購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)固態(tài) 發(fā)酵后經(jīng)PEG4000/(NH4)2SO4雙水相萃取制備而成，纖維素酶的添加量為0. 5-2. 5%。所述的木聚糖酶的添加量為0. 75-3. 0%。所述的果膠酶的添加量為0. 5-2. 0%。本發(fā)明采用酶法(纖維素酶、木聚糖酶及果膠酶的一種或多種)輔助提取蒺藜多 糖，選用的酶不破壞蒺藜多糖的結(jié)構(gòu)而能破壞蒺藜原料中的纖維素、半纖維素及果膠等多 糖的結(jié)構(gòu)，從而多糖的得率比傳統(tǒng)的水提醇沉法有較大的提高，獲得的樣品中多糖的含量 也大大高于水提醇沉法的樣品，這既提高了多糖的得率，又提高了多糖的純度，為蒺藜多糖 產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供高質(zhì)量的原料。本發(fā)明添加酶可提高蒺藜多糖的提取率及純度，可使多糖的提取率比不加酶處理 的提高18-40. 67%，純度提高15-42% 0與熱水浸提法、酸浸提法及堿浸提法提取相比，酶法提取條件溫和，易除去雜質(zhì)， 且能保持蒺藜多糖的活性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 1)粉碎過篩將干燥的蒺藜粉碎后過40目篩；2)酶處理按質(zhì)量份數(shù)取5g過篩后的蒺藜粉末浸泡于120ml的蒸餾水中，用 1. Omol/L的NaOH或1. 0mol/L的HCl將添加蒺藜粉末的蒸餾水的pH值調(diào)至4. 6，然后在 50°C水浴保溫5分鐘再添加蒺藜粉末質(zhì)量2. 0%的纖維素酶保溫酶解4. Oh ；3)滅酶過濾將浸泡液加熱至95°C，并保溫15min，使加入的酶制劑變性失活，然 后用布氏漏斗抽濾，收集濾液為蒺藜多糖提取液；4)濃縮及醇沉將步驟3)得到的蒺藜多糖提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5ml，然后 再濃縮液中加入15ml的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置16h ；5)抽濾及洗滌將步驟4)靜置的乙醇沉淀物經(jīng)抽濾后得到粗多糖，并用80%的乙 醇液進(jìn)行洗滌，再用氯仿及正丁醇進(jìn)行洗滌；
6)干燥及粉碎將步驟5)得到的沉淀在45-60°C烘干至恒重，然后粉碎，獲得蒺藜 多糖0.3148，多糖含量為61.73%，而對(duì)照(熱水浸提法)獲得的蒺藜多糖為0. 256g，多糖 含量為43. 51%。實(shí)施例2 1)粉碎過篩將干燥的蒺藜粉碎后過40目篩；2)酶處理按質(zhì)量份數(shù)取5g過篩后的蒺藜粉末浸泡于IOOml的蒸餾水中，用 1. Omol/L的NaOH或1. Omol/L的HCl將添加蒺藜粉末的蒸餾水的pH值調(diào)至7. 0，然后在 50°C水浴保溫5分鐘再添加蒺藜粉末質(zhì)量2. 5%的木聚糖酶保溫酶解3. Oh ；3)滅酶過濾將浸泡液加熱至95°C，并保溫12min，使加入的酶制劑變性失活，然 后用布氏漏斗抽濾，收集濾液為蒺藜多糖提取液；4)濃縮及醇沉將步驟3)得到的蒺藜多糖提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5ml，然后 再向濃縮液中加入20ml的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置12h ；5)抽濾及洗滌將步驟4)靜置的乙醇沉淀物經(jīng)抽濾后得到粗多糖，并用80%的乙 醇液進(jìn)行洗滌，再用氯仿及正丁醇進(jìn)行洗滌；6)干燥及粉碎將步驟5)得到的沉淀在45-60°C烘干至恒重，然后粉碎，獲得蒺藜 多糖0. 298g，多糖含量為61. 21%，而對(duì)照(熱水浸提法)獲得的蒺藜多糖為0. 248g，多糖 含量為42. 71%。實(shí)施例3 1)粉碎過篩將干燥的蒺藜粉碎后過40目篩；2)酶處理按質(zhì)量份數(shù)取5g過篩后的蒺藜粉末浸泡于150ml的蒸餾水中，用 1. Omol/L的NaOH或1. 0mol/L的HCl將添加蒺藜粉末的蒸餾水的pH值調(diào)至5. 6，然后在 55°C水浴保溫5min再添加蒺藜粉末質(zhì)量1. 5%的果膠酶保溫酶解3. 5h ；3)滅酶過濾將浸泡液加熱至95°C，并保溫lOmin，使加入的酶制劑變性失活，然 后用布氏漏斗抽濾，收集濾液為蒺藜多糖提取液；4)濃縮及醇沉將步驟3)得到的蒺藜多糖提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5. OmL，然 后再向濃縮液中加入18ml的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置IOh ；5)抽濾及洗滌將步驟4)靜置的乙醇沉淀物經(jīng)抽濾后得到粗多糖，并用80%的乙 醇液進(jìn)行洗滌，再用氯仿及正丁醇進(jìn)行洗滌；6)干燥及粉碎將步驟5)得到的沉淀在45-60°C烘干至恒重，然后粉碎，獲得蒺藜 多糖0. 288g，多糖含量為60. 52%，而對(duì)照(熱水浸提法)獲得的蒺藜多糖為0. 243g，多糖 含量為43. 68%。實(shí)施例4 1)粉碎過篩將干燥的蒺藜粉碎后過40目篩；2)酶處理按質(zhì)量份數(shù)取5g過篩后的蒺藜粉末浸泡于125ml的蒸餾水中，用
1.0mol/L的NaOH或1. 0mol/L的HCl將添加蒺藜粉末的蒸餾水的pH值調(diào)至5. 0，然后在 53°C水浴保溫5分鐘再添加蒺藜粉末質(zhì)量2. 0%的纖維素酶和1. 3%的果膠酶保溫酶解
2.Oh ；3)滅酶過濾將浸泡液加熱至95°C，并保溫lOmin，使加入的酶制劑變性失活，然 后用布氏漏斗抽濾，收集濾液為蒺藜多糖提取液；
4)濃縮及醇沉將步驟3)得到的蒺藜多糖提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5. OmL，然 后再向濃縮液中加入20ml的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置14h ；5)抽濾及洗滌將步驟4)靜置的乙醇沉淀物經(jīng)抽濾后得到粗多糖，并用75%的乙 醇液進(jìn)行洗滌，再用氯仿及正丁醇進(jìn)行洗滌；6)干燥及粉碎將步驟5)得到的沉淀在45-60°C烘干至恒重，然后粉碎，獲得蒺藜 多糖0. 325g，多糖含量為62. 82%，而對(duì)照(熱水浸提法)獲得的蒺藜多糖為0. 251g，多糖 含量為43. 12%。實(shí)施例5:1)粉碎過篩將干燥的蒺藜粉碎后過40目篩；2)酶處理按質(zhì)量份數(shù)取5g過篩后的蒺藜粉末浸泡于140ml的蒸餾水中，用 1. Omol/L的NaOH或1. Omol/L的HCl將添加蒺藜粉末的蒸餾水的pH值調(diào)至6. 5，然后在 51°C水浴保溫5分鐘再添加蒺藜粉末質(zhì)量0. 5%的果膠酶保溫酶解4. 5h ；3)滅酶過濾將浸泡液加熱至95°C，并保溫20min，使加入的酶制劑變性失活，然 后用布氏漏斗抽濾，收集濾液為蒺藜多糖提取液；4)濃縮及醇沉將步驟3)得到的蒺藜多糖提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5. OmL，然 后再向濃縮液中加入16ml的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置20h ；5)抽濾及洗滌將步驟4)靜置的乙醇沉淀物經(jīng)抽濾后得到粗多糖，并用85%的乙 醇液進(jìn)行洗滌，再用氯仿及正丁醇進(jìn)行洗滌；6)干燥及粉碎將步驟5)得到的沉淀在45-60°C烘干至恒重，然后粉碎，即獲得蒺 藜多糖。
權(quán)利要求
酶法輔助提取蒺藜多糖的方法，其特征在于1)粉碎過篩將干燥的蒺藜粉碎后過40目篩；2)酶處理按質(zhì)量份數(shù)取5份過篩后的蒺藜粉末浸泡于100 150份的蒸餾水中并調(diào)節(jié)pH值至4.6 7.0，然后水浴鍋升至50 55℃，再添加蒺藜粉末質(zhì)量0.5 3.3％的單一或復(fù)合酶，并50 55℃保溫酶解2.0 4.5h；3)滅酶過濾將浸泡液加熱至95℃，并保溫10 20min，使加入的酶制劑變性失活，然后過濾，收集濾液為蒺藜多糖提取液；4)濃縮及醇沉將步驟3)得到的蒺藜多糖提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原蒺藜粉末相同的質(zhì)量體積，然后再加入3 4倍濃縮液體積的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置10 20h；5)抽濾及洗滌將步驟4)靜置的乙醇沉淀物抽濾后得到粗多糖，并用75 85％的乙醇液進(jìn)行洗滌，再用氯仿及正丁醇進(jìn)行洗滌；6)干燥及粉碎將步驟5)得到的沉淀在45 60℃烘干至恒重，然后粉碎，即獲得蒺藜多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法輔助提取蒺藜多糖的方法，其特征在于所述的酶采用 活性為8000U/g的纖維素酶、活性為10000U/g的木聚糖酶、活性為30000U/g的果膠酶中的 一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法輔助提取蒺藜多糖的方法，其特征在于所述的纖維素 酶采用綠色木霉固態(tài)發(fā)酵后經(jīng)PEG4000/ (NH4) 2S04雙水相萃取制備而成，纖維素酶的添加量 為 0. 5-2. 5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法輔助提取蒺藜多糖的方法，其特征在于所述的木聚糖 酶的添加量為0. 75-3.0%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法輔助提取蒺藜多糖的方法，其特征在于所述的果膠酶 的添加量為0. 5-2.0%。
全文摘要
酶法輔助提取蒺藜多糖的方法，采用酶法(纖維素酶、木聚糖酶及果膠酶)輔助提取蒺藜多糖，選用的酶不破壞蒺藜多糖的結(jié)構(gòu)而能破壞蒺藜原料中的纖維素、半纖維素及果膠等多糖的結(jié)構(gòu)，從而多糖的得率比傳統(tǒng)的水提醇沉法有較大的提高，獲得的樣品中多糖的含量也大大高于水提醇沉法的樣品，這既提高了多糖的得率，又提高了多糖的純度，為蒺藜多糖產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供高質(zhì)量的原料。本發(fā)明添加酶可提高蒺藜多糖的提取率及純度，可使多糖的提取率比不加酶處理的提高18-40.67％，純度提高15-42％。與熱水浸提法、酸浸提法及堿浸提法提取相比，酶法提取條件溫和，易除去雜質(zhì)，且能保持蒺藜多糖的活性。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101955548SQ201010288609
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者張華 , 王長(zhǎng)鳳, 舒國(guó)偉, 陳合 申請(qǐng)人:陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院