專利名稱：一種出芽短梗霉黑色素的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)提取領(lǐng)域，特別涉及酸沉醇沉工藝提取出芽短梗霉黑色素的方法。
背景技術(shù)：
出芽短梗霉(AureobasidiumpulIulans)又名出芽范霉(Pullulariapullulans)，分類屬于半知菌綱，是一種具有酵母型和菌絲形態(tài)的多形真菌，廣泛存在于植物莖、葉、果實表面及花粉、樹蜜中，耐高滲透壓?？勺鳛閱渭毎鞍住⒓毎诙嗵?、胞外多糖、果膠酶、色素等的生產(chǎn)菌株，其主要產(chǎn)物是短梗霉多糖，另外在多糖的分泌過程中，我們也常常發(fā)現(xiàn)會伴隨著黑色素的產(chǎn)生。黑色素(Malannin)是一類普遍存在于生物界結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的酚類或吲哚類生物大分子色素的總稱，它為生物體提供結(jié)構(gòu)性強度或保護生物免受紫外線、電離輻射、重金污染、低溫和高溫等環(huán)境脅迫的傷害。黑色素不僅是一種光保護劑、抗輻射劑、螯合劑、生物抗氧劑和免疫促進劑，而且還是一類生物半導(dǎo)體材料和光電傳遞材料；近年來的研究還發(fā)現(xiàn)黑色素具有抗蛇毒、抑制艾滋病病毒復(fù)制、治療帕金森癥等作用。由此可見，黑色素在醫(yī)藥、化妝品、食品、電子等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。黑色素的制備方法很多，可以通過化學(xué)方法合成黑色素，如申請?zhí)枮?6117642. 3，名稱為《食用合成黑色素的制造方法》的中國發(fā)明專利，公開了一種食用合成黑色素的制造方法，它以食用合成色素單色亮蘭、檸檬黃或/和日落黃、胭脂紅/和蕨菜紅，以染料含量100%計，各原料配比為單色亮蘭17%-37%、檸檬黃或/和日落黃25-60%、胭脂紅或/和蕨菜紅20-43%，然后加入上述原料總質(zhì)量I 5倍的水攪拌混合均勻，再經(jīng)干燥可制得膏狀、粒狀或粉狀產(chǎn)品。由該方法制成的黑色素具有耐光性強、熱穩(wěn)定好的特點，但長期食用以化學(xué)原料合成的黑色素對身體會有一定的影響。此外，黑色素也可以從動物毛發(fā)、植物等材料中提取，如申請?zhí)枮?00710017344. 3，名稱為《一種杏仁皮中提取和純化黑色素的方法》，公開了一種從杏仁皮中提取和純化黑色素的方法，該方法以杏仁皮為原料，采用堿性水溶液提取，酸水解雜質(zhì)，反復(fù)有機溶劑洗滌和反復(fù)堿溶解后酸化使之沉淀和純化，凍結(jié)-解凍后去離子水反復(fù)洗滌除去Cl—，最后真空干燥得到杏仁皮黑色素成品。由該方法制備的黑色素，溶于堿性水溶液，不溶于水和常見的有機溶齊U，氧化程度低，純度較高。在眾多制備黑色素的方法中，天然黑色素以安全性高，應(yīng)用范圍廣等特點備受消費者的青睞，目前還沒有發(fā)現(xiàn)從出芽短梗霉發(fā)酵液中提取黑色素的相關(guān)報導(dǎo)。黑色素是一種廣泛存在于生物體中的一類天然色素，它是通過多羥基酚(極易結(jié)合蛋白)氧化而形成結(jié)構(gòu)不規(guī)則的非均質(zhì)的類多酚聚合體。黑色素又可分為三類真黑色素、棕黑色素、異黑色素，不同種類來源的黑色素在結(jié)構(gòu)上有著細微的差異。黑色素有很多重要的生物學(xué)功能，它能通過與蛋白質(zhì)的交聯(lián)起到強化結(jié)構(gòu)的作用，同時黑色素還能提供一些機械力，并且保護蛋白質(zhì)不被降解。在黑色素形成過程中，正醌的產(chǎn)生具有進化上的重要性，因為它們是保守的，特別是那些親核性的基團，如巰基、(-SH)和氨基(-NH2)，使其獲得抗生素特性。黑色素具有光吸收和光衍射的特性，也被廣泛利用。黑色素除賦予生物體某些特殊防御作用外，還具有外表修飾、抗輻射、抗氧化等功能。黑色素的光吸收特性，最顯著的是由于其高度的共軛效應(yīng)而產(chǎn)生的廣譜光吸收特性。這種色素顯黑是其吸收多數(shù)可見光的結(jié)果，甚至還包括一些低能量的輻射。黑色素，尤其是真黑色素，表現(xiàn)出顯著的氧化還原性，并且由于在正醌和多聚物鄰苯二酚部分之間的電子離域，使其產(chǎn)生很多半醌自由基。黑色素可以參與一些單價或雙價的氧化還原反應(yīng)，并且光吸收的結(jié)果使這種色素產(chǎn)生光氧化，使其所含羰基數(shù)增加，從而改變黑色素的吸收特性，即所謂即刻色素變黑反應(yīng)(iro)。這種光氧化過程產(chǎn)生超氧化的自由基。螯合效應(yīng)黑色素還具有很強的陽離子螯合特性，主要通過如羧基和去質(zhì)子化羥基這些陰離子起作用。在生物體中，黑色素的生物合成始于L-酪氨酸的氧化。最關(guān)鍵的一步是酪氨酸在酪氨酸酶的催化下氧化為多巴醌，接下來是與多巴醌的歧化相關(guān)聯(lián)的步驟，使其自發(fā)環(huán)化從而產(chǎn)生吲哚-2-羧基酸-5，6-醌(多巴色素)，緊接著在一種與酪氨酸酶相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)催化下產(chǎn)生互變異構(gòu)化，此蛋白質(zhì)(TRP-2)稱為多巴色素異構(gòu)酶。接下來就是產(chǎn)生的5，6- 二羥基吲哚-2-羧基酸的氧化作用(很可能由另一種與酪氨酸酶相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)催 化，TRP-1)。在現(xiàn)有的出芽短梗霉黑色素的提取工藝中，提取得到的黑色素量很少，而通過改進后的工藝其產(chǎn)生的黑色素的量明顯提高，并能使黑色素完全析出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種出芽短梗霉黑色素的提取方法，對出芽短梗霉黑色素發(fā)酵液采用酸沉醇沉的提取方法，使得成本大大降低。本發(fā)明的技術(shù)方案如下出芽短梗霉黑色素提取方法如下發(fā)酵結(jié)束后的出芽短梗霉黑色素發(fā)酵液過濾或者離心除去菌體，取IOOmL發(fā)酵液，用5mol/LHCl調(diào)pH值至2 3，充分振蕩，靜置一段時間，在攪拌的同時加入等體積有機溶劑使其充分沉淀，用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物，于50°C真空干燥至恒重。所述發(fā)酵液離心轉(zhuǎn)速為5000r/min,離心IOmin,除去菌體。所述有機溶劑為無水乙醇、無水甲醇或無水丙酮中任意一種。所述有機溶劑為濃度20% 100%的乙醇。所述有機溶劑乙醇的優(yōu)選濃度為40%。所述黑色素發(fā)酵液取IOOmL進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮比為10% 50%。所述黑色素發(fā)酵液的優(yōu)選濃縮比為30%。所述靜置可以為恒溫水浴中靜置30min，水浴溫度為0°C 100°C。所述水浴溫度優(yōu)選為80 V。所述出芽短梗霉黑色素發(fā)酵方法為裝液量18L，接種量5% (V/V)，溶氧20%，初始攪拌轉(zhuǎn)速400r/min 500r/min,與溶氧聯(lián)動,通風(fēng)比I. 2vvm,培養(yǎng)溫度25°C,pH 6. O,培養(yǎng)時間3 5d。本發(fā)明菌種使用天津科技大學(xué)申請中菌種，申請?zhí)枮镃N200910071018，發(fā)明名稱為一種大量產(chǎn)生β -聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培養(yǎng)方法，
公開日期是2011. 02. 23。該專利中公開了出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans),菌種保藏號為CGMCC3337，2009年10. 14日保藏。該菌株于2009年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所)。有益效果本發(fā)明改變了現(xiàn)有生產(chǎn)工藝步驟，對出芽短梗霉黑色素發(fā)酵液利用酸沉醇沉的提取方法，不僅將出芽短梗霉黑色素的產(chǎn)量提高到每IOOmL黑色素發(fā)酵液產(chǎn)黑色素I. 5g左右，而且避免了原料的浪費，降低了生產(chǎn)成本，提高了原料的利用率，減少了過度加入強酸強堿溶液弓I起的黑色素原有結(jié)構(gòu)的破壞。


圖I為實施例4中醇沉所用乙醇濃度與黑色素得率的關(guān)系。 圖2為實施例5中發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的濃縮比與黑色素得率的關(guān)系。圖3為實施例6中水浴溫度與黑色素得率的關(guān)系。
具體實施例方式下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明中出芽短梗霉黑色素的提取方法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例I :裝液量18L，出芽短梗霉接種量5% (V/V)，溶氧20%，初始攪拌轉(zhuǎn)速400r/min 500r/min(與溶氧聯(lián)動)，通風(fēng)比I. 2vvm,培養(yǎng)溫度25°C,pH6. 0，培養(yǎng)3 5d。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液5000r/min離心IOmin除去菌體，提取方法為取IOOmL發(fā)酵液，用5mol/L HCl調(diào)pH值至2 3左右，充分振蕩，靜置一段時間，在攪拌的同時加入等體積無水乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50°C真空干燥至恒重。菌種使用天津科技大學(xué)申請中菌種，申請?zhí)枮镃N200910071018，發(fā)明名稱為一種大量產(chǎn)生β -聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培養(yǎng)方法，
公開日期是2011.02.23。該專利中公開了出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans),菌種保藏號為CGMCC3337，2009年10. 14日保藏。該菌株于2009年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所)。實施例2:裝液量18L，出芽短梗霉接種量5% (V/V)，溶氧20%，初始攪拌轉(zhuǎn)速400r/min 500r/min(與溶氧聯(lián)動)，通風(fēng)比I. 2vvm,培養(yǎng)溫度25°C,pH6. 0，培養(yǎng)3 5d。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液5000r/min離心IOmin除去菌體，提取方法為取IOOmL發(fā)酵液，用5mol/L HCl調(diào)pH值至2 3左右，充分振蕩，靜置30min，在攪拌的同時加入等體積無水甲醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50°C真空干燥至恒重。實施例3 裝液量18L，出芽短梗霉接種量5% (V/V)，溶氧20%，初始攪拌轉(zhuǎn)速400r/min 500r/min(與溶氧聯(lián)動)，通風(fēng)比I. 2vvm,培養(yǎng)溫度25°C,pH6. 0，培養(yǎng)3 5d。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液5000r/min離心IOmin除去菌體，提取方法為取IOOmL發(fā)酵液，用5mol/L HCl調(diào)pH值至2 3左右，充分振蕩，靜置一段時間，在攪拌的同時加入等體積無水丙酮使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50°C真空干
燥至恒重。表I
實施例出芽短梗霉黑色素得率(g/100mL)
實施例I Λ5
實施例2IToo
實施例3 Γδ 實施例4裝液量18L，出芽短梗霉接種量5% (V/V)，溶氧20%，初始攪拌轉(zhuǎn)速400r/min 500r/min(與溶氧聯(lián)動)，通風(fēng)比I. 2vvm,培養(yǎng)溫度25°C,pH6. 0，培養(yǎng)3 5d。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液5000r/min離心IOmin除去菌體，提取方法為取IOOmL發(fā)酵液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮發(fā)酵液30%，用5mol/L HCl調(diào)pH值至2 3左右，充分振蕩，靜置一段時間，在攪拌的同時加入等體積濃度分別為20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液使其沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50°C真空干燥至恒重。實施例5裝液量18L，出芽短梗霉接種量5% (V/V)，溶氧20%，初始攪拌轉(zhuǎn)速400r/min 500r/min(與溶氧聯(lián)動)，通風(fēng)比I. 2vvm,培養(yǎng)溫度25°C,pH6. 0，培養(yǎng)3 5d。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液5000r/min離心IOmin除去菌體，提取方法為取IOOmL發(fā)酵液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮發(fā)酵液分別為10%、20%、30%、40%、50%，用5mol/LHCl調(diào)pH值至2 3左右，充分振蕩，靜置一段時間，在攪拌的同時加入等體積無水乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50°C真空干燥至恒重。實施例6裝液量18L，除芽短梗霉接種量5% (V/V)，溶氧20%，初始攪拌轉(zhuǎn)速400r/min 500r/min(與溶氧聯(lián)動)，通風(fēng)比I. 2vvm,培養(yǎng)溫度25°C,pH6. 0，培養(yǎng)3 5d。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液5000r/min離心IOmin除去菌體，提取方法為取IOOmL發(fā)酵液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮發(fā)酵液30%，用5mol/L HCl調(diào)pH值至2 3左右，充分振蕩，分別在0°C、20°C、40 V、60°C、80°CU00 V恒溫水浴中靜置30min，在攪拌的同時加入等體積無水乙醇使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50°C真空干燥至恒重。
權(quán)利要求
1.ー種出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，黑色素提取方法如下發(fā)酵結(jié)束后的出芽短梗霉黑色素發(fā)酵液過濾或者離心除去菌體，取IOOmL發(fā)酵液，用5mol/L HCl調(diào)pH值至2 3，充分振蕩，靜置一段時間，在攪拌的同時加入等體積有機溶劑使其充分沉淀，用600目的濾布過濾棄上清，得黒色粗提物，于50°C真空干燥至恒重。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述發(fā)酵液離心轉(zhuǎn)速為5000r/min,離心IOmin,除去菌體。
3.如權(quán)利要求I所述的ー種出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述有機溶劑為無水こ醇、無水甲醇或無水丙酮中任意ー種。
4.如權(quán)利要求I所述的ー種出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述有機溶劑為濃度20% 100%的こ醇。
5.如權(quán)利要求I或4所述的ー種出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述有機 溶劑こ醇的優(yōu)選濃度為40%。
6.如權(quán)利要求I所述的ー種出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述黑色素發(fā)酵液取IOOmL進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮比為10% 50%。
7.如權(quán)利要求I或6所述的ー種出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述黑色素發(fā)酵液的優(yōu)選濃縮比為30%。
8.如權(quán)利要求I所述的ー種出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述靜置可以為恒溫水浴中靜置30min，水浴溫度為0°C 100°C。
9.如權(quán)利要求I或8所述的ー種出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述水浴溫度優(yōu)選為80°C。
10.如權(quán)利要求I所述的ー種出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述出芽短梗霉黑色素發(fā)酵方法為裝液量18L，接種量5%(V/V)，溶氧20%，初始攪拌轉(zhuǎn)速400r/min 500r/min，與溶氧聯(lián)動，通風(fēng)比I. 2vvm,培養(yǎng)溫度25°C, pH 6. 0，培養(yǎng)時間3 5d。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種出芽短梗霉黑色素的提取方法，是利用出芽短梗霉的發(fā)酵生產(chǎn)，將發(fā)酵液除去菌體后進入提取過程，提取方法為取100mL發(fā)酵液，用5mol/LHCl調(diào)pH值至2～3左右，充分振蕩,靜置30min，在攪拌的同時加入等體積有機溶劑使其充分沉淀，利用600目的濾布過濾棄上清，得黑色粗提物于50℃真空干燥至恒重。利用傳統(tǒng)的堿溶酸沉的方法得到的黑色素固體粉末質(zhì)量很少，而利用本發(fā)明酸沉醇沉的方法，固體物質(zhì)析出之后溶液的顏色變?yōu)闊o色狀態(tài)，表明黑色素完全析出而且易于收集，便于后續(xù)的穩(wěn)定性研究和精制工作。
文檔編號C09B67/14GK102732048SQ20121017051
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者喬長晟, 汪建明, 趙博 申請人:天津北洋百川生物技術(shù)有限公司