專利名稱：生產(chǎn)黑色素的誘變菌株出芽短梗霉及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株大量產(chǎn)生黑色素的誘變菌株出芽短梗霉及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
黑色素是一種廣泛存在于動植物和微生物中的色素。黑色素的形成是通過酪氨酸酶催化L-酪氨酸成多巴，再經(jīng)過一系列聚合反應(yīng)合成的。Nicolaus等人提出，可將其分成三類(1)真黑色素(eumelanins)，含氮不含硫原子，主要是黑色和褐色的色素，是酪氨酸在酪氨酸酶的催化下被羥化，接著在一系列的氧化和聚合反應(yīng)中形成；( 棕黑色素 (phaeomelanins)，含氮和硫原子，常呈棕色、紅色甚至黃色，和真黑素的合成途徑類似，但有谷胱甘肽或半胱氨酸等的參與；C3)異黑色素(allomelanins)，不含氮，常呈棕色或黑色，主要存在與植物體內(nèi)，通過多酚氧化酶將多酚氧化聚合而成。2000年Sigma公司多巴黑色素樣品的價格是150. 6美元/克，2003年是197美元/克，總體呈增長趨勢，十分昂貴。黑色素在工農(nóng)業(yè)上，可以作為吸收紫外線的化妝品成分、天然染發(fā)劑的成分、陽離子螯和劑、作為無定形的半導體以及生物殺蟲劑的光保護劑；此外黑色素在醫(yī)學上也具有很廣的應(yīng)用范圍，具有清除自由基、阻止心磷脂脂質(zhì)體的氧化、抗輻射及抗氧化、對病理學和分類學的研究具有重要意義、作為新型的天然藥物載體、用來治療某些與黑色素缺乏相關(guān)的神經(jīng)性疾病、一些可溶性黑色素在體外具有抑制艾滋病病毒感染宿主細胞的作用，因此有可能成為一種有效的藥物。目前黑色素的生產(chǎn)多是通過化學合成或從動、植物體進行提取。化學合成黑色素反應(yīng)過程多，且具有一定的毒害性；從動、植物體提取黑色素存在樣品來源的問題。利用微生物生產(chǎn)黑色素具有反應(yīng)條件溫和、成本低、操作簡單、無需大量的樣品等優(yōu)點。因為黑色素的應(yīng)用價值十分廣泛，目前，研究微生物產(chǎn)黑色素及其應(yīng)用的文獻日益增多。近年來國內(nèi)在微生物發(fā)酵生產(chǎn)黑色素的研究也在不斷增加，其中2004年報道，篩選到一株堅強芽孢桿菌(Bacilis firmus)，產(chǎn)量達到3. 25g/L。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供生產(chǎn)黑色素的誘變菌株出芽短梗霉及其培養(yǎng)方法；出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)，CGMCC No. 3337，能夠生產(chǎn)黑色素。本發(fā)明菌種使用天津科技大學申請中菌種，申請?zhí)枮镃N200910071018，發(fā)明名稱為一種大量產(chǎn)生β -聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培養(yǎng)方法，
公開日期是2011. 02. 23。該專利中公開了出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，菌種保藏號為 CGMCC3337，2009年10. 14日保藏。該菌株于2009年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所)。CGMCC No. 3337 的培養(yǎng)方法為
(1)菌種活化將出芽短梗霉CGMCC No. 3337轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng) 3 5d ；(2)種子培養(yǎng)選取生長良好的斜面種子用無菌生理鹽水洗下孢子，制備孢子濃度約IO7個/mL的孢子懸浮液，按8% (ν/ν)接種量接種裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中，250C，200r/min條件下培養(yǎng)2 3d，制得種子液；(3)液態(tài)發(fā)酵將O)中的種子培養(yǎng)液以5 10% (ν/ν)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24 30°C下，200r/min振蕩培養(yǎng)7 IOd ；出芽短梗霉CGMCC No. 3337所用到的培養(yǎng)基為(1)菌種活化培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 土豆200g/L，葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L, pH 4. 0 4. 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖 8%，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 0.2%,K2CO3 0. 04%,KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 2% (單獨滅菌)，pH 4. 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 10%，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 0.2% ,K2CO3O. 04% ,KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 3% (單獨滅菌)，pH 4. 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果是采用該誘變方法降低了篩選的盲目性，有效簡化了篩選過程，同時優(yōu)化了高產(chǎn)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件，大大提高了誘變育種的工作效率。本發(fā)明的誘變菌株CGMCC No. 3337與常規(guī)短梗霉黑色素生產(chǎn)菌相比，其短梗霉黑色素生產(chǎn)能力更高，且發(fā)酵的時間短，并由此能夠有效提高黑色素的產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。 培養(yǎng)基優(yōu)化提高短梗霉黑色素的產(chǎn)量，有效降低了生產(chǎn)成本，實現(xiàn)了短梗霉黑色素的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限制性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。CGMCC No. 3337 的特性(1)菌體形態(tài)主要為酵母樣形態(tài)，細胞橢圓形，大小均勻，數(shù)個菌體可連成桿狀， 芽分生孢子。(2)菌落形態(tài)最初粘稠，乳白色，很快轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色，最終為黑色。菌落質(zhì)地粘稠濕潤，圓滑，色澤黑亮，菌落邊緣呈些微的根狀。(3)培養(yǎng)特征25°C，180 200r/m下振蕩培養(yǎng)4 6d，發(fā)酵液顏色穩(wěn)定為黑色，
不產(chǎn)普魯蘭多糖和聚蘋果酸。(4)可以利用的碳源葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、琥珀酸、檸檬酸其中之一。(5)可以利用的氮源酵母粉、牛肉膏、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨及玉米浸提液。上述氮源可單獨使用也可復合使用。(6)可以分別以琥珀酸、檸檬酸、酪氨酸為唯一碳源進行生長，并生長良好；實施例1 CGMCC No. 3337 的培養(yǎng)
1.培養(yǎng)基的配制(1)菌種活化培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 土豆200g/L，葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L, ρΗ4· 0 4· 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖 10%，丁二酸銨 1%，丁二酸 0.2%，K2CO3 0. 04%, KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 2% (單獨滅菌)，ρΗ 4. 5，121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基丁二酸銨 0.3%，丁二酸 8 %，K2CO3 0.04 %, KH2PO4O. 01%, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 · 7H20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%, pH6. 0，121°C高壓蒸汽滅菌 20min ；2.菌種活化將出芽短梗霉CGMCC No. 3337轉(zhuǎn)接PDA斜面培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中，25 V培養(yǎng) 2 4d ；3.種子培養(yǎng)選擇生長良好的活化斜面菌種接種于裝有上述1中制得的種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于25°C，200r/m下培養(yǎng)2 3d ；4.液態(tài)發(fā)酵將3中制得的種子培養(yǎng)液以10% (ν/ν)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C， 200r/m下培養(yǎng)4 6d ；檢測結(jié)果實施例1在發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)短梗霉黑色素產(chǎn)量為7士 1. 2g/L.實施例2 CGMCC No. 3337 的培養(yǎng)1.培養(yǎng)基的配制(1)菌種活化培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 土豆200g/L，葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L, ρΗ4· 0 4· 5，121°C高壓蒸汽滅菌20min ；(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖 3%，丁二酸 5%，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0.01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 2% (單獨滅菌)， ρΗ 6. 0，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖 3 %，丁二酸銨 0.3%，丁二酸 5 %，K2CO3 0.04%, KH2PO4 0. 01%, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 · 7H20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%, ρΗ 6. 0，121°C高壓蒸汽滅菌20min ；2.菌種活化將出芽短梗霉CGMCC No. 3337轉(zhuǎn)接PDA斜面培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中，25 V培養(yǎng) 2 4d ；3.種子培養(yǎng)選擇生長良好的活化斜面菌種接種于裝有上述1中制得的種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于25°C，200r/m下培養(yǎng)2 3d ；4.液態(tài)發(fā)酵將3中制得的種子培養(yǎng)液以10% (ν/ν)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C， 200r/m下培養(yǎng)4 6d ；檢測結(jié)果實施例2在發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)短梗霉黑色素產(chǎn)量為8士 1. 3g/L.
實施例3 CGMCC No. 3337 的培養(yǎng)1.培養(yǎng)基的配制(1)菌種活化培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 土豆200g/L，葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L, ρΗ4· 0 4· 5，121°C高壓蒸汽滅菌20min ；(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖 8%，丁二酸 5%，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0. 01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 6X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 2% (單獨滅菌)， ρΗ 6. 0，121°C高壓蒸汽滅菌15min ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基丁二酸銨 0.3%，丁二酸 8 %，K2CO3 0.04 %, KH2PO4O. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 ·7Η20 5 X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 1 %，ρΗ6· 0，121°C 高壓蒸汽滅菌 20min ；2.菌種活化將出芽短梗霉CGMCC No. 3337轉(zhuǎn)接PDA斜面培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中，25 V培養(yǎng) 2 4d ；3.種子培養(yǎng)選擇生長良好的活化斜面菌種接種于裝有上述1中制得的種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于25°C，200r/min下培養(yǎng)2 3d ；4.液態(tài)發(fā)酵將3中制得的種子培養(yǎng)液以10% (ν/ν)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C， 200r/min下培養(yǎng)4 6d ；檢測結(jié)果實施例3在發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)短梗霉黑色素產(chǎn)量為6士 1. lg/L。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)黑色素的出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)，CGMCCNo. 3337。
2.出芽短梗霉CGMCCNo. 3337的培養(yǎng)方法，包括如下步驟菌種活化將出芽短梗霉CGMCC No. 3337轉(zhuǎn)接PDA斜面培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中，25°C培養(yǎng)2 4d ；種子培養(yǎng)選擇生長良好的活化斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，于25°C，200r/min下培養(yǎng)2 3d ；發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)液以10% (ν/ν)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C，200r/ min下培養(yǎng)4 6cL
3.出芽短梗霉CGMCCNo. 3337在生產(chǎn)黑色素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了生產(chǎn)黑色素的誘變菌株出芽短梗霉及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株大量產(chǎn)生黑色素的誘變菌株出芽短梗霉及其培養(yǎng)方法。出芽短梗霉CGMCC No.3337的培養(yǎng)方法，包括如下步驟菌種活化將出芽短梗霉CGMCC No.3337轉(zhuǎn)接PDA斜面培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中，25℃培養(yǎng)2～4d；種子培養(yǎng)選擇生長良好的活化斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，于25℃，200r/min下培養(yǎng)2～3d；發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)液以10％(v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25℃，200r/min下培養(yǎng)4～6d。其短梗霉黑色素生產(chǎn)能力更高，且發(fā)酵的時間短，并由此能夠有效提高黑色素的產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P1/02GK102492630SQ20111042996
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者喬長晟, 盧星達, 敖愛華, 馬正旺 申請人:天津北洋百川生物技術(shù)有限公司