專利名稱：出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)出芽短梗霉TKPM00006，CGMCC3337發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的方法，屬于生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
普魯蘭多糖是出芽短梗霉(Aureobsidium pullulan)產(chǎn)生的胞外多糖，易溶于水， 具有非常優(yōu)良的增稠作用，造膜性強(qiáng)、易形成良好的水溶性的可食薄膜，并且具有無(wú)毒無(wú)害、無(wú)色無(wú)味等優(yōu)良特性，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、輕工、化工和石油等領(lǐng)域，是一種很有前景的工業(yè)用多糖。出芽短梗霉(Aureobsidium pullulan)細(xì)胞形態(tài)多種多樣。在發(fā)酵過(guò)程中由于發(fā)酵條件和底物的不同，一般有酵母狀(Y相)和菌絲體(M相)兩種狀態(tài)相互轉(zhuǎn)變。大量研究表明酵母狀細(xì)胞最有利于普魯蘭多糖的形成。國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究中篩選到了一些多糖產(chǎn)量高色素低的出芽短梗霉菌株，但國(guó)內(nèi)生產(chǎn)技術(shù)與先進(jìn)國(guó)家相比還有差距，原料利用率(50%左右)還不高，并且存在發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題。方宣鈞也通過(guò)紫外照射得到變異株ZY047，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件多糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到 54. 1%，色素水平較低(出芽短梗霉菌株紫外誘變及發(fā)酵條件優(yōu)化)；劉娜研究了普魯蘭多糖生產(chǎn)菌種和發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定了菌種與發(fā)酵條件，雖然其色素水平低，但其普魯蘭多糖產(chǎn)量也不高(茁霉多糖生產(chǎn)菌的復(fù)合誘變篩選及發(fā)酵條件研究)。黑色素是一種廣泛存在于生物體中的一類天然色素，它是通過(guò)多羥基酚(極易結(jié)合蛋白)氧化而形成結(jié)構(gòu)不規(guī)則的非均質(zhì)的類多酚聚合體。出芽短梗霉在發(fā)酵的過(guò)程中， 伴有深綠色和黑色的色素產(chǎn)生，色素的產(chǎn)生對(duì)短梗霉多糖的提取純化造成困難，降低其品質(zhì)；黑色素除賦予出芽短梗霉某些特殊防御作用外，還具有外表修飾、抗輻射、抗氧化等功能，尤其在光吸收方面具有優(yōu)良特性。現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有揭示聯(lián)產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的高產(chǎn)菌株，尚無(wú)文章報(bào)道利用同一出芽短梗霉菌種同時(shí)高效生產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的方法。該方法同時(shí)實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)普魯蘭多糖與黑色素，使普魯蘭多糖與黑色素產(chǎn)量達(dá)到較高水平，從而提高了原料的利用率。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的的實(shí)施步驟如下(1)制備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成(g/L)碳元素50. 0-120. 0，氮元素1. 0-5. 0， K2HPO4 1. 0-5. 0，NaCl 1. 0-4. 0，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5，F(xiàn)eSO4O. 01-0. 02，pH 5. 5-8. 0，121 °C 滅菌20min ；取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入在上述種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級(jí)種子、二級(jí)種子、種子罐逐步擴(kuò)大培養(yǎng)后，作為液體種子；搖瓶于31°C 士 1°C，轉(zhuǎn)速為180-240rpm的搖床上培養(yǎng) 48h，作為一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液以體積比-5% (V/V)的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，搖瓶于31°C 士 1°C，轉(zhuǎn)速為180-240rpm的搖床上培養(yǎng)24h，作為二級(jí)種子液；(2)制備發(fā)酵培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):碳元素80. 0-180.0，氮元素 1. 0-5. 0, K2HPO4 1.0-5.0，NaCl 1. 0—4. 0，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5, FeSO4 0. 01-0. 02, pH 5. 5-8. 0，121°C 滅菌 20min ；(3)將液體種子接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2% -8% (V/V)，發(fā)酵攪拌速度為200-500rpm，初始發(fā)酵溫度為31°C 士 1°C，24小時(shí)后將溫度改為28°C 士 1°C，通氣量為 0. 5-1. 0 (V/V)，罐壓為 0. 01-0. 02Mpa ；發(fā)酵 60-72 小時(shí)；上述的碳元素碳源選擇葡萄糖、蔗糖或麥芽汁，氮元素氮源選擇玉米漿、酵母膏或蛋白胨。本發(fā)明中使用菌種為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulan) TKPM00006, CGMCC3337，見(jiàn)天津科技大學(xué)申請(qǐng)專利，申請(qǐng)?zhí)枮镃N200910071018，發(fā)明名稱為一種大量產(chǎn)生β-聚蘋(píng)果酸的誘變菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培養(yǎng)方法，
公開(kāi)日期是2011. 02. 23。 該專利中公開(kāi)了本發(fā)明用出芽短梗霉(Aureobasidium pul lulan) TKPM00006, CGMCC3337, 2009年10. 14日保藏。有益效果本發(fā)明利用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，同時(shí)通過(guò)控制發(fā)酵條件，先促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，再改變發(fā)酵條件，促進(jìn)產(chǎn)物合成，實(shí)現(xiàn)一次發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素，使培養(yǎng)基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
詳述如下實(shí)施例1(1)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入裝有100毫升培養(yǎng)基的500毫升擋板瓶中。種子培養(yǎng)基的水溶液組成為(g/L)蔗糖50. 0，酵母膏1. 0，K2HPO4L 0，NaCl 1. 0，MgSO4 · 7H20 0. 2，F(xiàn)eSO4 0. 01, pH 5. 5，121°C滅菌 20min ；搖瓶于 30°C，轉(zhuǎn)速為 180rpm 的搖床上培養(yǎng) 48h， 作為一級(jí)種子液；(2)將一級(jí)種子液以體積比5%的接種量接種于種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基成分同步驟一。搖瓶于30°C，轉(zhuǎn)速為ISOrpm的搖床上培養(yǎng)24h，作為二級(jí)種子液；(3)按3% (V/V)的接種量將搖瓶種子接入30升發(fā)酵罐中。在30升發(fā)酵罐中加入20升發(fā)酵培養(yǎng)基并接入二級(jí)種子液600毫升，其水溶液組成為(g/L)蔗糖100. 0，酵母膏 2. 0，Κ2ΗΡ043· 0，NaCl 2. 5，MgSO4 · 7Η200· 2，F(xiàn)eSO4O. 01，pH 5. 5，121°C滅菌 20min ；前 24 小時(shí)發(fā)酵溫度為30°C，攪拌速度為400rpm，通氣量0. 8 (V/V)，罐壓0. OlMpa ；24小時(shí)后將溫度調(diào)整為28°C，其他發(fā)酵條件不變。再持續(xù)發(fā)酵60小時(shí)。(4)將發(fā)酵液處理后獲得53. 3g/L的普魯蘭多糖和2. 4g/L的黑色素粗品。實(shí)施例2(1)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入裝有100毫升培養(yǎng)基的500毫升擋板瓶中。種子培養(yǎng)基的水溶液組成為(g/L)葡萄糖80. 0，蛋白胨2. 0，Κ2ΗΡ042· 0，NaCl 2. 0，MgSO4 · 7Η20 0. 2，F(xiàn)eSO4O. 01，pH 6. 5，121°C 滅菌 20min ；搖瓶于 31°C，轉(zhuǎn)速為 220rpm 的搖床上培養(yǎng) 48h， 作為一級(jí)種子液；
(2)將一級(jí)種子液以體積比3%的接種量接種于種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基成分同步驟一。搖瓶于31°C，轉(zhuǎn)速為220rpm的搖床上培養(yǎng)24h，作為二級(jí)種子液；(3)按5% (V/V)的接種量將搖瓶種子接入30升發(fā)酵罐中。在30升發(fā)酵罐中加入20升發(fā)酵培養(yǎng)基并接入二級(jí)種子液1升，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)蔗糖130. 0，蛋白胨 3. 0，Κ2ΗΡ043· 0，NaCl 3. 0，MgSO4 · 7Η200· 2，F(xiàn)eSO4O. 01，ρΗ 5· 5，121°C 滅菌 20min ；前 24 小時(shí)發(fā)酵溫度為32°C，攪拌速度為500rpm，通氣量0. 7 (V/V)，罐壓0. 015Mpa ；24小時(shí)后將溫度調(diào)整為28°C，其他發(fā)酵條件不變。再持續(xù)發(fā)酵64小時(shí)。(4)將發(fā)酵液處理后獲得56. 6g/L的普魯蘭多糖和3. Og/L的黑色素粗品。實(shí)施例3(1)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入裝有100毫升培養(yǎng)基的500毫升擋板瓶中。種子培養(yǎng)基的水溶液組成為(g/L)葡萄糖100. 0，蛋白胨3. 0，Κ2ΗΡ043· 0，NaCl 3. OjMgSO4 ·7Η20 0. 3，F(xiàn)eSO4O. 02，ρΗ 5. 5，121°C滅菌 20min ；搖瓶于 32°C，轉(zhuǎn)速為 200rpm 的搖床上培養(yǎng) 48h， 作為一級(jí)種子液；(2)將一級(jí)種子液以體積比2%的接種量接種于種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基成分同步驟一。搖瓶于32°C，轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上培養(yǎng)24h，作為二級(jí)種子液；(3)按6% (V/V)的接種量將搖瓶種子接入30升發(fā)酵罐中。在30升發(fā)酵罐中加入20升發(fā)酵培養(yǎng)基并接入二級(jí)種子液1. 2升，其水溶液組成為(g/L)蔗糖150. 0，蛋白胨 3. 0，Κ2ΗΡ043· 0，NaCl 3. 0，MgSO4 · 7Η200· 2，F(xiàn)eSO4O. 01，ρΗ 7.0，121°C 滅菌 20min ；前 24 小時(shí)發(fā)酵溫度為31°C，攪拌速度為300rpm，通氣量0. 9(V/V)，罐壓0. 02Mpa ；24小時(shí)后將溫度調(diào)整為29°C，其他發(fā)酵條件不變。再持續(xù)發(fā)酵66小時(shí)。(4)將發(fā)酵液處理后獲得51. 5g/L的普魯蘭多糖和3. 4g/L的黑色素粗品。實(shí)施例4(1)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入裝有100毫升培養(yǎng)基的500毫升擋板瓶中。種子培養(yǎng)基的水溶液組成為(g/L)葡萄糖120. 0，蛋白胨5. 0，Κ2ΗΡ045· 0，NaCl 5. OjMgSO4 ·7Η20 0. 4，F(xiàn)eSO4O. 01，ρΗ 8. 0，121°C滅菌 20min ；搖瓶于 32°C，轉(zhuǎn)速為 240rpm 的搖床上培養(yǎng) 48h， 作為一級(jí)種子液；(2)將一級(jí)種子液以體積比3%的接種量接種于種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基成分同步驟一。搖瓶于32°C，轉(zhuǎn)速為240rpm的搖床上培養(yǎng)24h，作為二級(jí)種子液；(3)按5% (V/V)的接種量將搖瓶種子接入30升發(fā)酵罐中。在30升發(fā)酵罐中加入20升發(fā)酵培養(yǎng)基并接入二級(jí)種子液1升，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)蔗糖180. 0，蛋白胨 5. 0，Κ2ΗΡ045· 0，NaCl 5. 0，MgSO4 · 7Η200· 5，F(xiàn)eSO4O. 01，ρΗ 8.0，121°C 滅菌 20min ；前 24 小時(shí)發(fā)酵溫度為32°C，攪拌速度為500rpm，通氣量1.0(V/V)，罐壓0. 015Mpa ;24小時(shí)后將溫度調(diào)整為27°C，其他發(fā)酵條件不變，再持續(xù)發(fā)酵72小時(shí)。(4)將發(fā)酵液處理后獲得57. 2g/L的普魯蘭多糖和3. 4g/L的黑色素粗品。
權(quán)利要求
1.一種利用出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的方法，步驟如下將種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2%-8% (V/V)，初始發(fā)酵溫度為31°C 士 1°C，24 小時(shí)后將溫度改為28°C 士 1°C，發(fā)酵60-72小時(shí)。
2.如權(quán)1所述一種利用出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)碳源 80. 0-180. 0，氮源 1. 0-5. 0，K2HPO4L 0-5. 0，NaCl 1. 0-4. 0， MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5，F(xiàn)eSO4O. 01-0. 02，pH 5. 5-8. 0。
3.如權(quán)1或2所述一種利用出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的方法，其特征在于所述碳源為葡萄糖、蔗糖或麥芽汁。
4.如權(quán)1或2所述一種利用出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的方法，其特征在于所述氮源為玉米漿、酵母膏或蛋白胨。
5.如權(quán)1、2或3所述一種利用出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)蔗糖180. 0，蛋白胨5. 0，Κ2ΗΡ045· 0，NaCl 5. 0，MgSO4 ·7Η20 0. 5，F(xiàn)eSO4O. 01，pH 8. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用出芽短梗霉同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。通過(guò)一級(jí)種子、二級(jí)種子、發(fā)酵的過(guò)程，控制發(fā)酵參數(shù)，階段調(diào)溫的方法來(lái)利用出芽短梗霉同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一次發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)普魯蘭多糖和黑色素，使培養(yǎng)基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102492752SQ201110425459
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者喬長(zhǎng)晟, 盧星達(dá), 敖愛(ài)華, 郝華璇 申請(qǐng)人:天津北洋百川生物技術(shù)有限公司