本發(fā)明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種從固體培養(yǎng)基中提取較純凈荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法。

背景技術：

荔枝霜疫霉病(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)是由荔枝霜疫霉菌引起的一種不僅能在田間為害荔枝嫩葉、枝條、花穗及幼果還能在成熟果實采摘后的運輸及貯藏過程中造成爛果的重大病害。該病的病原菌隸屬卵菌，雖有類似真菌的菌絲體但其分類地位距真菌較遠而與藻類更為相近，故一般的殺真菌劑對其防治效果不佳。荔枝霜疫霉菌有著無性生殖與有性生殖兩個階段，該病的傳播與流行主要依靠其無性階段，即菌絲頂端膨大形成孢子囊，孢子囊遇低溫高濕條件則脫離菌絲并釋放游動孢子，游動孢子游動尋找寄主并休止形成休止孢，休止孢定植后萌發(fā)進而形成菌絲進行侵染，菌絲又可繼續(xù)形成孢子囊，這樣持續(xù)循環(huán)著；該病原菌依靠有性生殖形成厚壁而富含營養(yǎng)物質(zhì)的卵孢子幫助其度過逆境，因此，卵孢子作為次年病害發(fā)生的主要初侵染源是荔枝霜疫霉菌生活史中非常重要的一個階段。

荔枝霜疫霉菌是同宗配合的，所以單一的菌株中不同的菌絲便可分別分化形成藏卵器與雄器并進行配合。卵孢子通常在營養(yǎng)貧瘠時或較為老化的菌絲之間形成。在實驗室條件下將荔枝霜疫霉菌培養(yǎng)于胡蘿卜固體培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)7～10天，便可在培養(yǎng)基內(nèi)部鏡檢到大量的卵孢子，且發(fā)現(xiàn)卵孢子大多集中形成在接種點周圍，并以接種點為中心有向外擴張形成的趨勢。目前關于卵孢子的研究比較少，一方面可能是由于其通常為休眠狀態(tài)的過度階段而甚少被關注；另一方面可能是由于其形成周期較長、萌發(fā)條件較苛刻及形成于培養(yǎng)基內(nèi)部提取較困難而不易被研究。

因此，卵孢子作為卵菌病害循環(huán)中重要的中心環(huán)節(jié)之一，應當引起國內(nèi)外研究者的廣泛關注。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種從固體培養(yǎng)基中提取較純凈荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法。本發(fā)明方法有效減少卵孢子的收集過程難度，操作簡單、獲得的卵孢子材料較多且較純凈，大大提高開發(fā)對卵孢子研究的可能性。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：

一種從固體培養(yǎng)基中提取較純凈荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法，其通過在固體培養(yǎng)基表面覆蓋尼龍薄膜后再于尼龍薄膜表面接種荔枝霜疫霉菌，按常規(guī)方法培養(yǎng)后，撕開薄膜，從固體培養(yǎng)基中得到荔枝霜疫霉卵孢子。

所述的常規(guī)方法培養(yǎng)可為在25℃黑暗培養(yǎng)7～10天。

所述的固體培養(yǎng)基可為本領域常規(guī)使用的固體培養(yǎng)基即可，優(yōu)選為胡蘿卜培養(yǎng)基。

所述的尼龍薄膜優(yōu)選為Hybond^TM N⁺膜。

所述的荔枝霜疫霉菌接種前優(yōu)選先進行活化。所述活化采用常規(guī)方法即可，如在固體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)4天。

所述的從固體培養(yǎng)基中得到荔枝霜疫霉卵孢子既可通過利用刀具等刮劃培養(yǎng)基表面使荔枝霜疫霉卵孢子脫落，也可通過將含有荔枝霜疫霉卵孢子的培養(yǎng)基加水后勻漿獲得。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，通過在培養(yǎng)基表面覆蓋尼龍薄膜后再接種荔枝霜疫霉菌進行常規(guī)培養(yǎng)，菌絲基本生長在尼龍薄膜表面，而只有少量透過薄膜生長于培養(yǎng)基表面，且培養(yǎng)基表面菌落生長良好，含有大量卵孢子，撕開薄膜即可基本實現(xiàn)菌絲與荔枝霜疫霉卵孢子的分離，只需用滅菌的刀片輕輕刮劃培養(yǎng)基，即可從固體培養(yǎng)基中獲得大量、純凈且具有活力的荔枝霜疫霉菌卵孢子。本發(fā)明亦可用常規(guī)的方法從培養(yǎng)基中分離卵孢子，即在離接種點10mm的區(qū)域內(nèi)隨機切取3塊大小為10mm×10mm的菌絲塊，置于5mL的離心管中，加入3mL的去離子水，用高速勻漿機(6000rpm)勻漿2min(Flier et al.，2001)。雖然此法也能獲得大量的卵孢子，但固體培養(yǎng)基仍然存在，儀器設備上有所要求且操作不如用刀片刮劃的方法方便，使用者可根據(jù)實驗的需求來確定最終如何收集卵孢子。

而現(xiàn)有技術培養(yǎng)荔枝霜疫霉菌時，由于菌絲與卵孢子同時生長于培養(yǎng)基中，給卵孢子的分離和提取帶來了極大的困難。本發(fā)明方法有效解決了上述問題。本發(fā)明方法能快捷地從胡蘿卜固體培養(yǎng)基中分離出大量、純凈且具有活力的卵孢子，能很好的為研究卵菌尤其是卵孢子生物學特性與分子生物學相關的研究者提供快速大量收集研究材料的方法，大大提高開發(fā)對卵孢子研究的可能性。

附圖說明

圖1為荔枝霜疫霉菌在覆蓋不同膜的胡蘿卜固體培養(yǎng)基平板上的菌落圖。

圖2為荔枝霜疫霉菌在覆蓋不同膜的胡蘿卜固體培養(yǎng)基平板上的菌落直徑統(tǒng)計結果。

圖3為覆蓋Hybond^TM N⁺膜處理與不覆蓋膜對照的胡蘿卜培養(yǎng)基中荔枝霜疫霉菌卵孢子產(chǎn)量的統(tǒng)計結果。

圖4為覆蓋Hybond^TM N⁺膜處理與不覆蓋膜對照的胡蘿卜培養(yǎng)基中荔枝霜疫霉菌卵孢子活力的統(tǒng)計結果。

圖5為覆蓋Hybond^TM N⁺膜處理與不覆蓋膜對照的胡蘿卜培養(yǎng)基中荔枝霜疫霉菌卵孢子分別在顯微鏡物鏡5×、10×、20×與40×下鏡檢染色情況。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

下列實施例中使用的試劑均可從商業(yè)渠道獲得。

實施例1：荔枝霜疫霉菌在不覆蓋膜/覆蓋不同類型膜的胡蘿卜固體培養(yǎng)基上的生長速率

胡蘿卜培養(yǎng)基的制備：稱取200g胡蘿卜，用榨汁機充分榨汁后用16層紗布過濾，濾液補足水分至1000mL，再加15g瓊脂，充分加熱溶解后分裝于錐形瓶(每瓶100mL培養(yǎng)液)，121℃滅菌20min，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

活化荔枝霜疫霉菌SHS-3(NCBI，BioProject ID:PRJNA290406)于胡蘿卜培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)4天后，用打孔器于菌落邊緣打孔，將菌碟分別接種于不覆蓋膜、覆蓋玻璃紙、覆蓋硝酸纖維素膜以及覆蓋Hybond^TM N⁺膜的胡蘿卜固體培養(yǎng)基上，置于25℃黑暗培養(yǎng)10天。以不覆蓋膜為對照，每種膜處理均重復3次。

結果發(fā)現(xiàn)在覆蓋玻璃紙與硝酸纖維素膜的培養(yǎng)基中，荔枝霜疫霉菌生長受到明顯抑制，菌落直徑明顯小于不覆蓋膜對照處理的菌落直徑，且撕下玻璃紙與硝酸纖維素膜后發(fā)現(xiàn)霜疫霉菌僅在接種點附近有少許菌絲；而生長在覆蓋Hybond^TM N⁺膜的胡蘿卜培養(yǎng)基上的荔枝霜疫霉菌株菌落直徑與對照處理相比無明顯差異，且撕下膜后發(fā)現(xiàn)荔枝霜疫霉菌長滿整個培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基表面氣生菌絲明顯少于不覆蓋膜的對照處理(見圖1，圖2)。

實施例2：不同類型的膜覆蓋的胡蘿卜培養(yǎng)基中卵孢子的生長情況

荔枝霜疫霉菌的培養(yǎng)同實施例1。將膜撕下后，分別在對照組與不同膜處理組接種點附近切取0.5cm×0.5cm大小的菌塊，壓片并計數(shù)卵孢子的數(shù)量，實驗重復3次。

結果發(fā)現(xiàn)，與不覆蓋膜的對照相比，覆蓋玻璃紙與覆蓋硝酸纖維素膜處理的胡蘿卜培養(yǎng)基中卵孢子數(shù)量顯著減少，而覆蓋Hybond^TM N⁺膜處理的胡蘿卜培養(yǎng)基中的卵孢子數(shù)量無明顯差異(見圖3)。

實施例3：覆蓋Hybond^TM N⁺膜處理的胡蘿卜培養(yǎng)基中卵孢子活力的測定

荔枝霜疫霉菌的培養(yǎng)同實施例1。用MTT(tetrazolium bromide，噻唑藍)染色法測定卵孢子存活力。用滅菌去離子水配制濃度為0.1％MTT，過濾滅菌后與卵孢子懸浮液等體積混合，于36℃下培養(yǎng)2d，鏡檢結果。被染桃紅色或藍色的是有活力的，沒被染色或呈黑色的則是無活力的(Sutherland et al.，1983)。結果發(fā)現(xiàn)覆蓋Hybond^TM N⁺膜處理的胡蘿卜培養(yǎng)基中的卵孢子有活力的比例與不覆蓋膜的對照相比無明顯差異(見圖4，圖5)。

上述結果表明本發(fā)明方法既可有效、快捷分離提取卵孢子，又不會對其生長、活力等產(chǎn)生不良影響，能很好的為研究卵菌尤其是卵孢子生物學特性與分子生物學相關的研究者提供收集研究材料的方法。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。