本發(fā)明涉及厚垣普可尼亞菌(Pochoniachamydosporia)航天誘變突變株，尤其涉及厚垣普可尼亞菌航天誘變突變株P(guān)c-m-123及由其制備的生防制劑，本發(fā)明進一步涉及該突變株在生物防治根結(jié)線蟲中的應(yīng)用，屬于厚垣普可尼亞菌突變株的篩選及其應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：：厚垣普可尼亞菌(Pochoniachamydosporia＝Verticilliumchlamydosporium)屬半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)，是一種重要的噬植物線蟲真菌(林茂松,沈素文.厚壁輪枝菌防治南方根結(jié)線蟲研究初報[J].生物防治通報,1994,10(1):7-10)，能夠有效防治南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)、花生根結(jié)線蟲(Meloidogynearenaria)、大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)等植物寄生線蟲(汪來發(fā),楊寶君,關(guān)文剛等.淡紫擬青霉和厚壁輪枝霉防治南方根結(jié)線蟲[J],四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,16(2):231-233；劉暢.厚垣輪枝菌V10菌株對南方根結(jié)線蟲的寄生和防治作用.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,35(2)：135-137.)。厚垣普可尼亞菌主要通過內(nèi)寄生的方式寄生于卵及雌蟲體內(nèi)，通過大量繁殖使線蟲死亡，其對植物寄生線蟲卵和雌蟲的寄生，在自然條件下對植物寄生線蟲的控制起著重要的作用，是最具潛在開發(fā)價值的生防真菌之一(裘維蕃,高仁恒,劉杏忠.根結(jié)線蟲的生物防治簡介[J].貴州農(nóng)學(xué)院學(xué)報,1996,15(2):51-55.)，厚垣普可尼亞菌具有較廣的適應(yīng)能力，易于培養(yǎng)，且可以寄生多種植物線蟲，因而有利于田間防治的應(yīng)用。同時，其作為線蟲生防菌替代化學(xué)農(nóng)藥在一些國家已經(jīng)開始推廣應(yīng)用，并取得了一些成績。但由于土壤生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性，特別是土壤抑菌作用，導(dǎo)致生防菌的應(yīng)用受到限制。航天誘變育種技術(shù)作為一種有效的誘變育種新技術(shù)，已經(jīng)在創(chuàng)造特異突變基因資源和培育作物新品種方面顯示出重要的作用。已有報道，中國神舟八號飛船搭載松褐天牛幼蟲上分離的球孢白僵菌，篩選出了殺蟲速度較快，致病力高的誘變菌株，在林間防治松褐天牛具有很大的應(yīng)用潛力(王曦茁,汪來發(fā),馬建偉,郭民偉,劉洪劍,董廣平.松褐天牛球孢白僵菌高毒力航天誘變菌株的篩選[J].昆蟲學(xué)報,2014,(11):1299-1305.)；同時，神舟八號飛船搭載植物線蟲生防菌淡紫擬青霉山東菌株后，也使誘變菌株生物學(xué)特性與原始菌株存在不同程度的分化，篩選出了在生長特性和致病力方面發(fā)生較大幅度正向變異的優(yōu)良菌株(王源,汪來發(fā),王曦茁,朱天輝,.航天搭載淡紫擬青霉的生物學(xué)效應(yīng)[J].核農(nóng)學(xué)報,2014,(11):1933-1940.)。由此說明，航天誘變的變異率高，變異類型豐富，有益變異增多，為選育優(yōu)良菌株提供更多的機會，為選育符合生產(chǎn)需求且抗逆性強的優(yōu)良菌株提供了新的途徑。航天誘變育種技術(shù)作為一種有效的誘變育種新技術(shù)，同其它誘變育種一樣，航天誘變處理后必需通過各種性狀的檢測，以判斷航天誘變的效應(yīng)和篩選得到特定變異的目標品種(農(nóng)向群,張澤華,胡攀,高松,張禮生.航天誘變對昆蟲病原真菌的生物學(xué)效應(yīng)[J].菌物學(xué)報,2006,25(4):674-681.)。作為生物農(nóng)藥，厚垣普可尼亞菌同其它植物線蟲生防菌一樣盡管具有化學(xué)農(nóng)藥不可比擬的諸多優(yōu)點，但同時也存在生長緩慢、且受環(huán)境影響較大，防治效果不穩(wěn)定以及自身抗逆性較差等缺點，因此有必要對線蟲生防真菌厚垣普可尼亞菌進行航天誘變，篩選出產(chǎn)孢子量高、殺線蟲能力強、對農(nóng)藥有很好抗性的的誘變菌株，使其更好地發(fā)揮防治植物線蟲的效果。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的是將厚垣普可尼亞菌(Pochoniachamydosporia)進行航天誘變以期篩選獲得一株產(chǎn)孢子量高以及對根結(jié)線蟲卵的致病能力高的性能優(yōu)異的突變株；本發(fā)明的另一目的是將所獲得的性能優(yōu)異的突變株應(yīng)用于根結(jié)線蟲的生物防治。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：本發(fā)明將培養(yǎng)活化的厚垣普可尼亞菌菌進行航天搭載(神舟八號)，航天誘變完成后，以未搭載的厚垣普可尼亞菌原始菌株作為對照，比較航天誘變菌株在菌落形態(tài)、色素變化、孢子形態(tài)、生長速度、產(chǎn)孢量、致病力、耐鹽性和苯菌靈抗性等方面的變異性。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將厚垣普可尼亞菌經(jīng)航天誘變后，產(chǎn)生了豐富的性狀變異。從總體上看，航天誘變對生長速度、產(chǎn)孢量、致病力、耐鹽性和苯菌靈抗性等很多性狀表現(xiàn)出了不同的的變異趨向和幅度。其中，生長速度、產(chǎn)孢量和致病力等是篩選生物防治菌株的重要指標，航天誘變使這些特性表現(xiàn)出不同變異趨向和幅度，證明了航天誘變是非定點的、廣泛性的、正負雙向性的，且誘變位點多、誘變率高，所導(dǎo)致的生物體變異有生理性變異也可能有遺傳性變異(農(nóng)向群，張澤華，胡攀，高松，張禮生.航天誘變對昆蟲病原真菌的生物學(xué)效應(yīng)[J].菌物學(xué)報，2006，25(4)：674～681)。為篩選得到產(chǎn)孢子量高、對根結(jié)線蟲卵的致病能力有顯著提高以及對苯菌靈有很好抗性的適合于生物防控的突變株，本發(fā)明對篩選得到的29株厚垣普可尼亞菌航天誘變菌株進行了形態(tài)、色素、菌絲及孢子形態(tài)、菌落生長速度、菌絲干重、產(chǎn)孢量和致病力等生物學(xué)檢測并測定了各航天誘變菌株的耐鹽性以及對苯菌靈的抗性：經(jīng)航天誘變后的菌株在產(chǎn)孢量上出現(xiàn)了不同趨向和幅度的變異，其中，Pc-m-123突變株的產(chǎn)孢量相比原始菌株P(guān)c有了非常顯著的提升(P<0.05)。航天誘變后的厚垣普可尼亞菌菌株對南方根結(jié)線蟲的致病力產(chǎn)生了明顯的變異，相較于原始菌株P(guān)c，對南方根結(jié)線蟲卵的寄生率提高的菌株有20株，占突變菌株的69.0％；寄生率降低的菌株有9株，占突變菌株的31.0％；其中，菌株P(guān)c-m-123的寄生率達到了94.28％；方差分析顯示，Pc-m-123對根結(jié)線蟲卵的寄生率與原始菌株之間存在顯著差異(P<0.05)，其較高的寄生率對于田間生防實踐具有重要意義。最終，本發(fā)明從眾多的航天突變體菌株中篩選得到一株性能優(yōu)異的適用于生物防控的突變株P(guān)c-m-123，該突變株生長迅速，產(chǎn)孢量高，具有較高的殺線蟲活力，防治效果穩(wěn)定，因此，該突變株P(guān)c-m-123可作為生防菌劑在根結(jié)線蟲的防治應(yīng)用上具有重要的前景。本發(fā)明將厚垣普可尼亞菌(Pochoniachamydosporia)航體誘變突變株P(guān)c-m-123并將其提交專利認可的機構(gòu)進行保藏，其微生物保藏號是：CGMCCNo.12513；分類命名：厚垣普可尼亞菌Pochoniachamydosporia；保藏時間：2016年6月14日；保藏單位是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明進一步提供了一種防治根結(jié)線蟲的生防制劑，包括：防治上有效量的厚垣普可尼亞菌(Pochoniachamydosporia)突變株P(guān)c-m-123的孢子粉或發(fā)酵液和載體。作為參考，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考下述方法制備得到厚垣普可尼亞菌(Pochoniachamydosporia)突變株P(guān)c-m-123孢子粉：(1)制備厚垣普可尼亞菌突變株P(guān)c-m-123發(fā)酵液；(2)從厚垣普可尼亞菌突變株P(guān)c-m-123發(fā)酵液中回收孢子產(chǎn)物；(3)干燥所回收的厚垣普可尼亞菌突變株P(guān)c-m-123發(fā)酵產(chǎn)物，即得孢子粉。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可按照文獻中所公開的各種方法制備得到厚垣普可尼亞菌發(fā)酵液；例如，采用三級培養(yǎng)方法，即：種子培養(yǎng)、二級液體擴大培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，制備得到厚垣普可尼亞菌航天突變株P(guān)c-m-123發(fā)酵液；其中，在液體發(fā)酵培養(yǎng)時,可以采用發(fā)酵罐發(fā)酵或采用搖瓶培養(yǎng)的方式進行發(fā)酵培養(yǎng)；三級培養(yǎng)所用到的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件均已在文獻中公開，作為參考，其中，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一種或多種。所述的氮源包括但不限于硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨或黃豆粉中的任一種或多種。本發(fā)明進一步提供一種制備防治根結(jié)線蟲的厚垣普可尼亞菌生防制劑的方法，該方法包括以下步驟：將厚垣普可尼亞菌航天誘變突變株的Pc-m-123孢子粉或發(fā)酵液和載體混合在一起，攪拌均勻，粉碎過篩，制備得到相應(yīng)的微生物制劑，例如，可以是顆粒制劑、粉劑、可濕性粉劑或微膠囊菌劑等。其中，所述的載體可以是硅藻土、高嶺土、木屑、活性炭、草炭、農(nóng)作物秸稈、干燥的農(nóng)家肥等；此外，本發(fā)明的厚垣普可尼亞菌微生物制劑中還可加入輔料或/和助劑；所述的輔料可以是蟹殼粉或幾丁質(zhì)等；所述的助劑可以是潤濕劑、分散劑或穩(wěn)定劑等。附圖說明圖1是航天誘變厚垣普可尼亞菌的菌落正面、背面和側(cè)面形態(tài)類型；圖2是航天誘變厚垣普可尼亞菌的孢子形態(tài)；圖3是航天誘變厚垣普可尼亞菌的菌落生長速度的柱狀圖；圖4是航天誘變厚垣普可尼亞菌菌株菌絲干重的柱狀圖；圖5是航天誘變厚垣普可尼亞菌的產(chǎn)孢量的柱狀圖。具體實施方式通過下列實施例將更具體說明本發(fā)明的實施方式，但是應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。實施例厚垣普可尼亞菌可濕性粉劑的制備一、厚垣普可尼亞菌孢子粉的制備(一)、發(fā)酵液的制備1、將厚垣普可尼亞菌航天誘變突變株菌種活化后，進行搖瓶種子培養(yǎng)；搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成(按質(zhì)量百分比計)：葡萄糖1.5-2％硝酸鈉0.4-0.6％硫酸銨0.2-0.3％黃豆粉0.2-0.3％磷酸氫二鉀0.1-0.2％硫酸鎂0.1-0.2％水余量液體發(fā)酵條件：500ml三角瓶中裝入種子培養(yǎng)基200ml,高壓滅菌后接種厚垣普可尼亞菌孢子懸浮液，接種量為1.5-3％，置于24-28℃，搖床150-200r/min，培養(yǎng)18-36h。2、二級液體擴大培養(yǎng)(按質(zhì)量百分比計):二級液體擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成：葡萄糖3-5％硝酸鈉0.4-0.6％硫酸銨0.2-0.3％黃豆粉0.2-0.3％磷酸氫二鉀0.1-0.2％硫酸鎂0.1-0.2％水余量將上述二級液體擴大培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中在位滅菌；液體發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度25-28℃，罐壓0.6-0.8bar，其通氧量可以是100-300L/h，轉(zhuǎn)速150-250rpm，起始pH值5.5-6.0。3、液體發(fā)酵培養(yǎng)：液體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成：葡萄糖10-18％硝酸鈉0.2-0.3％硫酸銨0.1-0.15％黃豆粉0.1-0.15％磷酸氫二鉀0.1-0.2％硫酸鎂0.1-0.2％土豆浸出液(20％)10-30％水余量將上述液體培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中在位滅菌；液體發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為28-30℃，其通氧量可以是100-300L/h，前24h，通氣量控制在100-150L/h，后期控制在250-300L/h；起始pH：5.0-6.0；轉(zhuǎn)速：150-200r/min；罐壓：0.6-0.8Mpa，發(fā)酵周期控制在6d，一般鏡檢孢子濃度達到109個/ml以上即可。(二)、從發(fā)酵液中回收并干燥孢子產(chǎn)物將發(fā)酵液離心，離心條件為：相對離心力為4000g，離心時間為40min，每100毫升發(fā)酵液中加入絮凝劑2.0g；棄上清，將沉淀菌漿用硅藻土載體吸附后陰干至產(chǎn)品中的含水量低于10％，即得厚垣普可尼亞菌孢子粉。二、可濕性粉劑的制備按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分：將上述制備的孢子粉85％，硅藻土11％，潤濕劑PEG2％、分散劑木鈉2％；將孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細，混合均勻，即得。試驗例1厚垣普可尼亞菌航體誘變突變株P(guān)c-m-123的篩選及誘變效應(yīng)的測定試驗1材料和方法1.1生物材料供試菌株厚垣普可尼亞菌(P.chamydosporia)源自美國，是用于防治根結(jié)線蟲的生產(chǎn)菌株，菌種保藏于中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所。航天誘變返地后，于本發(fā)明人實驗室4℃保存，備用。供試的南方根結(jié)線蟲(M.incognita)由中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所提供。1.2航天搭載將用PDA培養(yǎng)活化7d的菌絲塊轉(zhuǎn)移至無菌的EP管(1.5mL)2管，封口。其中一管進行航天搭載(神舟八號)，另一管作為對照材料保存在4℃冰箱中。1.3突變體篩選將經(jīng)航天誘變處理后的厚垣普可尼亞菌和原始菌株分別制成孢子懸浮液，稀釋孢子濃度到1.0×103cfu/mL，均勻涂布到直徑為9cm的PDA平板上(每皿加0.1mL孢子懸浮液)，25℃恒溫培養(yǎng)6d-9d后，觀察單菌落大小、形態(tài)和正反面顏色，挑選出與原始菌株差別較明顯的單菌落菌株；原始編號為“Pc”，其余菌株編號為“Pc-m-No.”。1.4航天誘變效應(yīng)的檢測以未搭載的厚垣普可尼亞菌原始菌株作為對照，比較航天誘變菌株在菌落形態(tài)、色素變化、孢子形態(tài)、生長速度、產(chǎn)孢量、致病力、耐鹽性和苯菌靈抗性等方面的變異性。1.4.1菌落的形態(tài)和色素變化觀察從已生長好的PDA平板上，用直徑為5mm的打孔器切菌落3塊于5mL含0.5‰吐溫的溶液中，充分振蕩，制成孢子懸浮液。在9cm培養(yǎng)皿(15mL培養(yǎng)基)中央接入2.5μL孢子懸浮液(孢子濃度為1×106cfu/mL)，置于25℃溫箱中培養(yǎng)，每個菌株重復(fù)3次。1.4.2孢子形態(tài)的觀察將孢子懸浮液(孢子濃度為1×106cfu/mL)滴在載玻片上制成臨時玻片，并在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。1.4.3菌落生長速度測定用滅好菌的直徑為5mm的濾紙片蘸滿孢子懸浮液(孢子濃度為1×106cfu/mL)放在PDA培養(yǎng)基平板中央，置于25℃溫箱中培養(yǎng)，以十字交叉法每3d測菌落直徑，直至菌株長滿整皿時停止測定。原始菌株為對照，重復(fù)3次。1.4.4菌絲干重測定150mL錐形瓶裝50mLPD培養(yǎng)基，吸取200μL(孢子濃度為1×106cfu/mL)孢子懸浮液于每瓶培養(yǎng)基中，恒溫搖床溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為120r/min。培養(yǎng)96h后，將三角瓶中所有的菌液倒入50mL的離心管中，5000r/min離心3min，倒出上清，將沉淀倒在濾紙上，烘箱50℃烘干至恒重，稱重。1.4.5產(chǎn)孢量測定用打孔器在菌落中央到邊緣的中點打取直徑為5mm的菌塊3塊，放入5mL含0.5‰吐溫的溶液中，充分振蕩，用血球計數(shù)板(25×16格)測定孢子含量，設(shè)3次重復(fù)。1.4.6致病力測定大棚采集病根，將病根洗凈，剪成0.5cm的小段，裝入500mL三角瓶中，倒入200mL1％次氯酸鈉溶液，封口后猛搖3min，迅速過200目篩子，再迅速過500目篩子，用蒸餾水反復(fù)沖洗留在500目篩子上的卵，最后用無菌水沖洗收集于無菌的小燒杯中，顯微鏡下觀察，調(diào)節(jié)蟲卵濃度到1000個/mL。在直徑6cm的培養(yǎng)皿中加入100μL卵懸浮液，并加入2mL的1.0×106個/mL的突變體孢子懸浮液，野生型Pc做對照。每個突變菌株各重復(fù)3次，25℃培養(yǎng)5d，統(tǒng)計卵的寄生數(shù)和未寄生數(shù)，并計算菌株孢子對南方根結(jié)線蟲蟲卵的寄生率。1.4.7數(shù)據(jù)處理與分析采用MicrosoftExcel軟件對數(shù)據(jù)進行處理。采用SPSS19.0進行單因素方差分析(One-wayANOPC-M-A)，運用Duncan法對不同菌株多重比較(P＝0.05)，試驗數(shù)據(jù)采用平均值加減標準差(mean±SD，n＝3)的形式表示。2結(jié)果與分析2.1航天誘變對菌落形態(tài)和色素變化的影響航天誘變厚垣普可尼亞菌通過3-4代繼代培養(yǎng)獲得穩(wěn)定性狀后，觀察發(fā)現(xiàn)菌落有明顯的形態(tài)分化(圖1)，可根據(jù)菌落的正面、背面及側(cè)面形態(tài)和顏色變化將分化菌株分為I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型4種類型：I型菌落形態(tài)與原始菌株P(guān)c相似，菌落正面呈白色羽絨狀，菌落背部為淡黃色，菌落側(cè)面呈平滑圓拱形，I型菌落共11株，占航天誘變菌株的37.9％；Ⅱ型菌株菌落正面為白色羽絨狀，菌落中心凹陷且有褶皺，背面顏色為淡黃色較I型深，Ⅱ型菌落共14株，占航天誘變菌株的48.3％；Ⅲ型菌落正面為白色羽絨狀，菌落中心凹陷無褶皺，背面顏色為淡黃色，Ⅲ型菌落共3株，分別是Pc-m-13、Pc-m-26和Pc-m-54，占航天誘變菌株的10.3％；Ⅳ型菌落正面為白色羽絨狀，菌落中心呈白色凸起且有褶皺，背部顏色為黃色，Ⅳ型菌落只有一個菌株P(guān)c-m-9，占航天誘變菌株的3.4％。2.2航天誘變對孢子形態(tài)的影響通過顯微鏡(100μm)觀察，航天誘變厚垣普可尼亞菌的分生孢子形態(tài)為球形或近球形，透明光滑，四個類型(I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)均與原始菌株P(guān)c無明顯差異。2.3航天誘變對菌落生長速度的影響據(jù)觀察，航天誘變厚垣普可尼亞菌的生長速度約為1cm/3d，但15d后生長速度變慢，菌落需約20d才能長滿整皿。培養(yǎng)15d的菌落直徑大于或等于原始菌株P(guān)c的菌株有10株，占突變菌株的34.5％；小于原始菌株P(guān)c的菌株有19株，占突變菌株的65.5％。方差分析顯示，突變菌株P(guān)c-m-38在前9d的生長速率較快，與原始菌株P(guān)c之間差異顯著(P<0.05)，之后生長速率逐漸變慢(表1、圖3)。表1航天誘變厚垣普可尼亞菌的菌落生長速度Table1VarietiesofcolonygrowthrateofaerospacemutantstrainsofPochoniachamydosporia/cm注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，數(shù)據(jù)后*表示與原始菌株P(guān)c相比有顯著性差異(P<0.05)。Note:Datainthetableismean±SD,datamarked*representssignificantdifference(P<0.05).2.4航天誘變對菌絲干重的影響航天誘變菌株培養(yǎng)過程中菌絲干重出現(xiàn)了正負雙向變異(圖4)。與原始菌株P(guān)c相比，菌絲干重提高的有13株，占突變菌株的44.8％；菌絲干重降低的有16株，占突變菌株的55.2％。其中，Pc-m-26的菌絲干重最重，為0.2776g；干重最小的誘變菌株為Pc-m-27，其干重為0.1559g。2.5航天誘變對產(chǎn)孢量的影響試驗結(jié)果見表2和圖5。經(jīng)航天誘變后的菌株出現(xiàn)了不同趨向和幅度的變異(表2)。與原始菌株P(guān)c相較，產(chǎn)孢量提高的有24株，占突變菌株的82.8％；產(chǎn)孢量降低的有5株，占突變菌株的17.2％。Pc-m-123的產(chǎn)孢量明顯高于原始菌株的產(chǎn)孢量，方差分析顯示，Pc-m-123的產(chǎn)孢量與原始菌株之間差異顯著(P<0.05)。表2航天誘變厚垣普可尼亞菌的產(chǎn)孢量Table2SporulationofaerospacemutantstrainsofPochoniachamydosporia/(×106cfu·mL-1)注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，數(shù)據(jù)后*表示與原始菌株P(guān)c相比有顯著性差異(P<0.05)。Note:Datainthetableismean±SD,datamarked*representssignificantdifference(P<0.05).2.6航天誘變對致病力的影響試驗結(jié)果見表3，厚垣普可尼亞菌航天誘變菌株對南方根結(jié)線蟲的致病力產(chǎn)生了明顯的變異。相較于原始菌株P(guān)c，對南方根結(jié)線蟲卵的寄生率提高的菌株有20株，占突變菌株的69.0％；寄生率降低的菌株有9株，占突變菌株的31.0％。寄生率正變異率最高為12.67％，負變異率最高為-15.67％，變異幅度在-15.67％到12.67％之間。其中，突變菌株P(guān)c-m-123對南方根結(jié)線蟲卵的寄生率達到94.28％，其對根結(jié)線蟲卵的寄生率與原始菌株之間差異顯著(P<0.05)。表3航天誘變厚垣普可尼亞菌對南方根結(jié)線蟲卵的寄生率Table3ParasiticrateofaerospacemutantstrainsofPochoniachamydosporiaagainstMeloidogyneincognitaeggs/％注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，數(shù)據(jù)后*表示與原始菌株P(guān)c相比有顯著性差異(P<0.05)。Note:Datainthetableismean±SD,datamarked*representssignificantdifference(P<0.05).實驗例1由厚垣普可尼亞菌航天誘變突變株P(guān)c-m-123制備的可濕性粉劑防治花椒根結(jié)線蟲的田間試驗1試驗材料及方法1.1供試菌劑試驗菌劑：用厚垣普可尼亞菌航天誘變突變株P(guān)c-m-123制備的可濕性粉劑(實施例1制備)；對照菌劑：用厚垣普可尼亞菌原始菌株(未進行航天誘變)制備的可濕性粉劑(按照實施例1的方法進行制備)。1.2實驗作物花椒種植區(qū)種植的花椒樹。1.3實驗設(shè)計實驗地點設(shè)在線蟲蟲量大且均勻的花椒種植區(qū)，藥前調(diào)查根結(jié)線蟲二齡幼蟲蟲口在每100g土壤20-30頭。實驗分為3組，試驗1組，試驗2組和清水對照組，具體實驗設(shè)計如下：試驗1組采用實施例1制備的可濕性粉劑進行處理；對照2組采用對照菌劑進行處理。清水對照組：采用清水進行處理(不施加任何防治線蟲的藥劑)，不作防線蟲處理；每個處理30個重復(fù)(分三列，每列10株花椒樹)，各處理隨機排列。4月15日至5月10日進行菌劑小區(qū)試驗，在花椒樹四周扒開根表面10cm厚、半徑為50cm的土層，將1毫升的原菌劑(試驗菌劑以及對照菌劑的用量均相同，均為1毫升原菌劑/株)用水稀釋后采用噴霧方式將稀釋后的菌劑均勻噴灑在挖好的坑中，使菌劑分布在根圍，再使扒開土壤復(fù)位。施藥90d后調(diào)查花椒樹根結(jié)指數(shù)(病情指數(shù))和土壤中二齡幼蟲數(shù)，評價防治效果。根結(jié)指數(shù)(病情指數(shù))計算方法：挖出每處理花椒根，按照根結(jié)線蟲分級調(diào)查指標進行調(diào)查，根結(jié)嚴重度分0-10級，分級標準參照Benjamin等(BenjaminD，GroverCBJ.ComparisonofcompatibleandincompatibleresponseofpotatotoMeloidogyneincognita.JournalofNematology，1987，19:218-221)。根結(jié)指數(shù)計算公式如下：幼蟲減少百分率(相對減退率)計算方法：每小區(qū)用取土鉆(2cm×H20cm)從作物根圍(0-20cm深)采集5個點的土樣，充分混勻后，取100g用離心漂浮分離法(KarssenG.ThePlantParasiticNematodeGenusMeloidogyneGoldi,(Tylenchida)inEurope[M].Gent:DrukkeruModern,1982:5-24.)分離土樣中的二齡幼蟲，熱殺死后用4％福爾馬林固定，在倒置顯微鏡下計數(shù)，計算100g土樣內(nèi)根結(jié)線蟲二齡幼蟲數(shù)及幼蟲減少百分率(相對減退率)。計算公式如下：相對防治效果計算公式如下：2實驗結(jié)果實驗結(jié)果見表4。表4厚垣普可尼亞菌航天誘變突變株P(guān)c-m-123可濕性粉劑對花椒根結(jié)線蟲的防治效果實驗從表4的試驗數(shù)據(jù)可見，試驗菌劑(用厚垣普可尼亞菌航天誘變突變株P(guān)c-m-123制備的可濕性粉劑)對根結(jié)線蟲的相對防治效果比對照菌劑(用厚垣普可尼亞菌原始菌株制備的可濕性粉劑)高出了27.08個百分點，試驗菌劑的幼蟲減少百分率比對照菌劑高出了25.1個百分點。田間防治根結(jié)線蟲的試驗結(jié)果表明，厚垣普可尼亞菌航天誘變突變株P(guān)c-m-123對于根結(jié)線蟲的生物防治效果要遠優(yōu)于原始菌株對于根結(jié)線蟲的生物防治效果。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3