本發(fā)明涉及一株產(chǎn)L-蘋果酸的米曲霉及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蘋果酸(Malic acid)又名二羥基丁二酸，分子式為HOOCH₂-CH(OH)COOH,相對(duì)分子質(zhì)量為134.09。蘋果酸是非常重要的有機(jī)酸之一，廣泛的應(yīng)用于化工、食品及醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。因其分子結(jié)構(gòu)中含一個(gè)不對(duì)稱碳原子，所以具有旋光性，存在L-蘋果酸和D-蘋果酸兩個(gè)手性對(duì)映體。其中L-蘋果酸廣泛存在于生物體中，作為三羧酸循環(huán)的一員參與細(xì)胞代謝。

蘋果酸是天然果酸的重要組成部分。蘋果酸的呈味作用明顯，酸味持久柔和、性質(zhì)穩(wěn)定，是優(yōu)良的酸味劑和調(diào)酸劑。L-蘋果酸能增進(jìn)藥物的穩(wěn)定性，促進(jìn)人體對(duì)藥物的吸收，可以作為藥物穩(wěn)定劑。蘋果酸還能應(yīng)用于日用化工方面。

目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蘋果酸主要有三種方法，直接發(fā)酵法、兩步發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法。直接發(fā)酵法又稱一步發(fā)酵法，該工藝采用糖質(zhì)原料，用霉菌直接發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸；兩步發(fā)酵法制備L-蘋果酸是采用兩種不同功能的微生物，采用糖質(zhì)原料，先由根霉發(fā)酵生成富馬酸或富馬酸與蘋果酸的混合物，再由酵母或細(xì)菌等轉(zhuǎn)化成單一的L-蘋果酸；轉(zhuǎn)化發(fā)酵是將兩步發(fā)酵中第一步發(fā)酵產(chǎn)物富馬酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸，而酶轉(zhuǎn)化法是利用微生物的延胡索酸酶將富馬酸鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酸鹽，成本高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一株產(chǎn)L-蘋果酸的米曲霉(Aspergillus oryzae)FMME 338，已于2016年7月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO:M 2016401，保藏地址為中國，武漢，武漢大學(xué)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種應(yīng)用所述米曲霉生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于，將所述米曲霉接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵；所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有葡萄糖80～130g/L，蛋白胨4～8g/L，CaCO390～120g/L。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，接種量為6～12％。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵溫度為28～32℃。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵周期為96h～168h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，接種前進(jìn)行種子培養(yǎng)，所述種子培養(yǎng)在種子培養(yǎng)基中進(jìn)行，使孢子終濃度為10⁶個(gè)/mL；所述種子培養(yǎng)基為：葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，K₂HPO₄0.56g/L，KH₂PO₄0.56g/L，NaH₂PO₄·H₂00.925g/L，Na₂HPO₄0.82g/L，MgSO₄·7H₂O 0.075g/L，CaCl₂·H₂O 0.075g/L。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，種子培養(yǎng)前進(jìn)行斜面培養(yǎng)，所述斜面培養(yǎng)是指接種一環(huán)菌株于PDA斜面培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)7天。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖120g/L，蛋白胨6g/L，K₂HPO₄ 0.15g/L，KH₂PO₄0.15g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCl₂·H₂O 0.1g/L，CaCO₃100g/L。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述斜面培養(yǎng)基為稱取洗凈去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水煮爛(約20～30分鐘)，雙層紗布濾去馬鈴薯塊，加入葡萄糖20g，瓊脂15g，定容至1L，115℃滅菌20分鐘。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵是以10％的接種量接種，在30℃，200r/min發(fā)酵120h。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述米曲霉在食品、化工領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其是在制備酸味劑、調(diào)味劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的米曲霉FMME 338在搖瓶水平上發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)109.2g/L，發(fā)酵液中L-蘋果酸純度高，雜酸占總酸6％以下。本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法工藝操作簡單易行、培養(yǎng)基成本低廉，且發(fā)酵周期短，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

生物材料保藏

米曲霉((Aspergillus oryzae)FMME 338，已于2016年7月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO:M 2016401，保藏地址為中國，武漢，武漢大學(xué)。

附圖說明

圖1為HPLC測定L-蘋果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為米曲霉菌落形態(tài)；

圖3為米曲霉發(fā)酵過程L-蘋果酸產(chǎn)量變化曲線。

圖4為發(fā)酵液HPLC檢測結(jié)果；A，1g/L L-蘋果酸標(biāo)樣色譜圖B，120h發(fā)酵液的色譜圖。

具體實(shí)施方式

PDA培養(yǎng)基：稱取洗凈去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水煮爛(20～30分鐘)，雙層紗布濾去馬鈴薯塊，加入葡萄糖20g，瓊脂15g，定容至1L，115℃滅菌20分鐘。

固體篩選培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30，NaNO₃3，K₂HPO₄1，KCl 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，瓊脂20。

產(chǎn)酸指示培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80，(NH₄)₂SO₄2，K₂HPO₄0.5，KH₂PO₄0.1，MgSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.03，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.05，CaCO₃10,瓊脂20，溴甲酚綠0.02。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨3，K₂HPO₄0.56，KH₂PO₄0.56，NaH₂PO₄·H₂00.925，Na₂HPO₄0.82，MgSO₄·7H₂O 0.075，CaCl₂·H₂O 0.075

微量元素溶液：5g/LNaCl，5g/LFeSO₄·7H₂O，1g/L檸檬酸。

L-蘋果酸的測定：

發(fā)酵液預(yù)處理：取發(fā)酵液加入4mol/L的HCl，8000r/min離心10min取上清。

高效液相色譜條件：色譜柱： C₁₈(5μm 4.6×250mm)；流動(dòng)相：0.1mol/LKH₂PO₄，磷酸調(diào)pH至2.8；柱溫：20℃；檢測波長：215nm；進(jìn)樣量：10μl；流速:0.6ml/min。

實(shí)施例1

(1)米曲霉初步分離純化

從無錫周邊地區(qū)果園采集土壤樣品，取適量的土壤，放入裝有100mL無菌水的250mL三角瓶，振蕩，稀釋10^-4～10^-6倍分別涂布于產(chǎn)酸指示平板上，在28℃下培養(yǎng)3天。觀察平板變色情況，挑取變色圈大的單菌落孢子接種于固體篩選培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)7天，分離純化至無雜菌，保藏于PDA斜面，以供使用。

(2)產(chǎn)L-蘋果酸米曲霉的篩選

取10支長滿孢子的上述分離純化得到的菌株，每支加入5mL無菌水，在超凈臺(tái)中用接種環(huán)將孢子全部刮下，用玻璃珠震蕩打散，通過宣紙過濾，得到單孢子懸液，將孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)14h后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)5天收集發(fā)酵液，經(jīng)高效液相分析，篩選L-蘋果酸產(chǎn)量為80g/L的菌株為目的菌株。

(3)產(chǎn)L-蘋果酸米曲霉的鑒定

提取目的菌株的基因組DNA，以出發(fā)菌株的基因組DNA為模板，使用真菌26S rDNA PCR通用引物正向引物EF3：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'、:反向引物EF4：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3進(jìn)行擴(kuò)增。用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，核酸電泳驗(yàn)證。18S rDNA測序由上海生工生物科技有限公司完成，將測序結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫中與已有序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果表明其與米曲霉的26S rDNA序列相似性最高達(dá)99％，將其命名為米曲霉(Aspergillus oryzae)FMME 338。

實(shí)施例2

(1)斜面培養(yǎng)：接種一環(huán)菌株于斜面培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)7天；

(2)種子培養(yǎng)：向裝液量100mL/250mL的種子培養(yǎng)基中接入孢子懸液，使孢子終濃度在10⁶個(gè)/mL；溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min條件下，培養(yǎng)14h；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以10％(v/v)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min條件下，發(fā)酵120h。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K₂HPO₄0.15，KH₂PO₄0.15，MgSO₄·7H₂O 0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，CaCO₃100。

HPLC檢測發(fā)酵液中L-蘋果酸及雜酸含量，結(jié)果如表1所示。

表1發(fā)酵液中L-蘋果酸及雜質(zhì)含量

采用本實(shí)施例的方法應(yīng)用米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸，發(fā)酵120h后，只有極少量其他雜酸的存在(如圖4所示，L-蘋果酸出峰時(shí)間為9.6min左右，琥珀酸出峰時(shí)間為11.6min左右，富馬酸出峰時(shí)間為14.9min左右)，琥珀酸含量僅為3.2g/L，富馬酸0.6g/L。

實(shí)施例3

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K₂HPO₄0.15，KH₂PO₄0.15，MgSO₄7H₂O 0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，CaCO₃90。

斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)條件同實(shí)施例2。

實(shí)施例4

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K₂HPO₄0.15，KH₂PO₄0.15，MgSO₄·7H₂O 0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，CaCO₃120。

斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)條件同實(shí)施例2。

實(shí)施例5

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K₂HPO₄0.15，KH₂PO₄0.15，MgSO₄·7H₂O 0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，CaCO₃80。

斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)條件同實(shí)施例2。

實(shí)施例6

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K₂HPO₄0.15，KH₂PO₄0.15，MgSO₄·7H₂O 0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1。

斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)條件同實(shí)施例2。

不同實(shí)施方式下L-蘋果酸發(fā)酵結(jié)果見表2。結(jié)果表明CaCO₃對(duì)米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸影響很大，發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加CaCO₃時(shí)，基本不產(chǎn)酸；當(dāng)CaCO₃添加量在80～100g/L時(shí)，L-蘋果酸產(chǎn)量幾乎保持在80g/L以上，且原料利用率高，殘?zhí)呛康陀?.1g/L。

表2不同實(shí)施方式下米曲霉生產(chǎn)L-蘋果酸發(fā)酵結(jié)果

實(shí)施例7

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖120，蛋白胨6，K₂HPO₄0.15，KH₂PO₄0.15，MgSO₄·7H₂O 0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，CaCO₃100。

斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)條件同實(shí)施例2。

HPLC檢測發(fā)酵液中L-蘋果酸及雜酸含量，結(jié)果如表3所示。蘋果酸含量為109.2g/L，雜酸含量僅為蘋果酸含量的6.68％。

表3發(fā)酵液中L-蘋果酸及雜質(zhì)含量

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。