本發(fā)明涉及一株分離的能夠產(chǎn)生桉葉油素的環(huán)紋炭團(tuán)菌(Annulohypoxylon)菌株，本發(fā)明還涉及所述菌株在生產(chǎn)桉葉油素中的應(yīng)用，屬于產(chǎn)桉葉油素菌株的分離及應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

生物質(zhì)能因其可再生、可循環(huán)、來源廣泛、效益顯著等特征而成為替代化石能源的主要選擇。許多國家對生物質(zhì)進(jìn)行處理作為生物燃料利用方式的研究逐漸深入，其中最直接的是將植物油用于柴油機(jī)上，其熱效率可接近礦質(zhì)柴油。如果將植物油等進(jìn)行單酯化處理，使其成為單酯類，會更適合于在內(nèi)燃機(jī)上使用。其中，桉葉油素(1,8-cineole，C₁₀H₁₈O)是一種辛烷衍生單萜類化合物，無色液體，有類似樟腦氣味。這種油即為“生物柴油”，目前在許多國家已經(jīng)商品化生產(chǎn)。中國也有人對桉葉油素作為燃料進(jìn)行研究分析。肖正春等(肖正春,張衛(wèi)明,張廣倫,等.生物柴油植物桉樹類葉油的開發(fā)利用[J].中國野生植物資源,2008,27(2):19-20.)證明桉葉油素在內(nèi)燃機(jī)中可以很好的使用，并發(fā)現(xiàn)藍(lán)桉和大葉桉如果人工栽培，加強(qiáng)管理，l株7-8年生樹每年可砍伐400kg鮮枝葉用于蒸油，估計人工栽培l(xiāng)hm²桉樹每年可產(chǎn)桉樹油20-40噸。管朝旭等(管朝旭,施彬,曾德賢,等.史密斯桉無性系桉葉出油率及成分分析[J].桉樹科技,2013(4):15-18.)對中國的史密斯桉無性系桉葉具有燃料性質(zhì)的桉葉油素的產(chǎn)量進(jìn)行分析，最高產(chǎn)量為2.92％。

近些年來，如炭團(tuán)菌(Hypoxylon sp.)，莖點(diǎn)霉(Phoma sp.)和多節(jié)孢屬真菌(Nodulisporium sp.)等真菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中都含有桉葉油素，這是除植物組織以外桉葉油素的另一種新的生物來源。其中，Tomsheck在2010年發(fā)表的文章中提及的炭團(tuán)菌(Hypoxylon sp)，在PDA上培養(yǎng)6天時產(chǎn)生的1,8-cineole為總的揮發(fā)性產(chǎn)物的0.5％，即為0.725ppmv(Tomsheck A R,Strobel G A,Booth E,et al.Hypoxylon sp.an Endophyte of Persea indica,Producing 1,8-Cineole and Other Bioactive Volatiles with Fuel Potential[J].Microbial Ecology,2010,60(4):903-14.)。

桉葉油素還具有燃料添加劑的潛在價值，作為乙醇汽油混合燃料的添加劑，可以提高辛烷值，這樣就彌補(bǔ)了乙醇的能量密度差的問題；桉葉油素與其他未經(jīng)酯化處理的植物油脂相比，直接作為內(nèi)燃機(jī)燃料使用有很大優(yōu)勢，即使全部使用1,8-cineole也是可行的。相對于以大體積的糧食谷物為原料的生物質(zhì)能而言，以農(nóng)林廢棄物為基質(zhì)產(chǎn)生具有燃料潛能物質(zhì)的微生物更有利用前景。但是，并不是所有能產(chǎn)生桉葉油素的菌株都能很好的利用纖維素基質(zhì)，已有研究表明將纖維素降解基因克隆到菌株內(nèi)從而可以很好地降解利用纖維素基質(zhì)。

因此，分離出新的能夠產(chǎn)生桉葉油素的真菌，利用其揮發(fā)性產(chǎn)物以及通過研究該類菌株產(chǎn)生桉葉油素的基因及其表達(dá)，利用遺傳改良手段優(yōu)化菌株等，將對第二代生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化利用具有非常重要的推動意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一株分離的產(chǎn)桉葉油素的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株；

本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是將所述環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株應(yīng)用于生產(chǎn)桉葉油素。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明從海南尖峰嶺樟科植物樹枝中分離、純化得到一株菌株，通過對該菌株4個基因位點(diǎn)(包括ITS、Actin、β-tubulin和EF-1α)的PCR序列在NCBI中blast的結(jié)果，確定了該菌株的OTU種為Annulohypoxylon。本發(fā)明將分離的菌株命名為環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株FPYF3050(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)。

本發(fā)明通過GC-MS對該環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)的揮發(fā)性產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，結(jié)果表明該環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株能夠產(chǎn)生2種特殊揮發(fā)性成分，分別為桉葉油素(1,8-cineole)和3-甲基-1-丁醇(1-Butanol,3-methyl)。本發(fā)明進(jìn)一步對揮發(fā)性成分定量分析的結(jié)果表明，該環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株在生長6天時產(chǎn)生桉葉油素(1,8-cineole)為0.764ppmv。

本發(fā)明將分離的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株FPYF3050(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No.12771；分類命名為：炭團(tuán)菌Annulohypoxylon sp.。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2016年07月07日；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明所分離的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)能夠在主要以農(nóng)林廢棄物為成分的培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)生產(chǎn)桉葉油素。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種利用所述的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)生產(chǎn)桉葉油素的方法，包括以下步驟：(1)培養(yǎng)所述的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株；(2)采用固相微萃取方法從菌株所產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體中萃取桉葉油素。

其中，步驟(1)培養(yǎng)環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株的培養(yǎng)基可以為PDA培養(yǎng)基，或者以農(nóng)林廢棄物的粉碎物作為主要成分的培養(yǎng)基；其中所述農(nóng)林廢棄物包括玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈、楊樹木屑或松樹木屑中的任意一種或多種，優(yōu)選為楊樹木屑。本發(fā)明對所述楊樹木屑的楊樹品種沒有特殊限制。本發(fā)明所述的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株在農(nóng)林廢棄物上能快速生長并產(chǎn)生桉葉油素。

步驟(1)所述培養(yǎng)的溫度為室溫，所述的室溫可以為15-30℃，優(yōu)選為25℃；所述培養(yǎng)的時間可以為24-240小時；優(yōu)選的，所述培養(yǎng)的時間120h-240h，更優(yōu)選為120h-168h。

步驟(2)所述萃取的時間可以為5-120min，優(yōu)選為40-120min，更優(yōu)選為60-120min，特別優(yōu)選為60-90min，最優(yōu)選為60min。

其中，所述的固相微萃取方法在室溫下進(jìn)行。所述固相微萃取方法所采用的萃取頭可以為纖維萃取頭，本發(fā)明對所述纖維萃取頭的型號沒有特殊限制。作為參考，所述纖維萃取頭可以為50/30μm，DVB/CAR/PDMS，Supelco。

本發(fā)明通過在玉米秸稈，小麥秸稈，楊樹木屑，水稻秸稈和松樹木屑5種農(nóng)林廢棄物等天然木質(zhì)纖維上接種所述的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)，通過GC-MS分析，最優(yōu)的天然木質(zhì)纖維為楊樹木屑。

本發(fā)明對環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)不同培養(yǎng)時間下桉葉油素的產(chǎn)量變化分析結(jié)果表明，在培養(yǎng)24-240小時的范圍內(nèi)，環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株在培養(yǎng)120h-168h之間桉葉油素的產(chǎn)量達(dá)到最高。

本發(fā)明在相同進(jìn)樣條件下，對環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)所產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)的萃取時間進(jìn)行優(yōu)化篩選，分別采用5-120min等9種不同的萃取時間進(jìn)行萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著萃取時間的逐步升高，所檢測到桉葉油素的產(chǎn)量逐漸提高；其中，當(dāng)萃取時間為60min時，桉葉油素的產(chǎn)量達(dá)到最高，當(dāng)萃取時間超過60min后，桉葉油素的產(chǎn)量不再增長并呈略微下降的趨勢。因此，本發(fā)明的萃取時間最優(yōu)選為60min。本發(fā)明通過對所分離的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株的培養(yǎng)條件及揮發(fā)性產(chǎn)物的萃取時間進(jìn)行優(yōu)化，使所生產(chǎn)的桉葉油素量達(dá)到最高。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明從海南尖峰嶺樟科植物樹枝中分離純化得到一株環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株，該菌株的揮發(fā)性產(chǎn)物中含有桉葉油素，而且在培養(yǎng)6天時產(chǎn)生桉葉油素的濃度達(dá)到0.764ppmv。本發(fā)明所分離的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株的桉葉油素產(chǎn)量高，該菌株能很好的降解利用纖維素基質(zhì)，對于生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化利用將具有重要的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)的特殊揮發(fā)性成分分析的質(zhì)譜圖；

圖2為不同萃取時間下產(chǎn)生的桉葉油素的峰面積折線圖；

圖3為不同培養(yǎng)時間下1,8-cineole(桉葉油素)的產(chǎn)量變化；

圖4為以As/Ai(標(biāo)樣面積/內(nèi)標(biāo)面積)為橫坐標(biāo)，Vs/Vi(標(biāo)樣體積/內(nèi)標(biāo)體積)為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5為環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)在楊樹木屑培養(yǎng)下?lián)]發(fā)性成分分析的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)的分離及鑒定

1、材料與方法

1.1菌株來源

海南尖峰嶺樟科植物樹枝。

1.2菌株的分離與鑒定

將采集到的樹枝表皮去掉，剪成2mm²大小的組織塊，用2％次氯酸鈉和75％的乙醇對組織進(jìn)行表面消毒，將已消毒的組織塊放入無菌水中清洗后接種到提前準(zhǔn)備好的水瓊脂培養(yǎng)基中；將分離得到的菌株在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化后的菌株進(jìn)行菌種保藏；將長有菌絲的培養(yǎng)基切成5mm²的小塊，然后放入經(jīng)過三次高壓滅菌的盛有無菌水的冷藏管中，密封，放入4℃保存。

用改進(jìn)后的CTAB法提取得到菌株的DNA：將培養(yǎng)基上的菌絲刮下來放入無菌的1.5mL離心管中放入-20℃冷藏，然后在拿出來解凍，反復(fù)凍融3-5次；用真菌通用引物ITS1/4(引物序列見White T J,Bruns T,Lee S,et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[J].PCR Protocols:a Guide to Methods and Applications,1990,18:315-322.)、EF1-983F/EF1-2218R(Rehner S A,Buckley E.A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-alpha sequences:evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs.[J].Mycologia,2005,97(1):84-98.)、β-tubulin(O'Donnell K,Cigelnik E.Two divergent intragenomic rDNA ITS2types within a monophyletic lineage of the FungusFusariumAre nonorthologous[J].Molecular phylogenetics and evolution,1997,7(1):103-116.)、Actin-512F/783R(Glass N L,Donaldson G C.Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes[J].Applied and Environmental Microbiology,1995,61(4):1323-1330.)4對引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送到測序公司測序；利用測序后得到的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

1.3揮發(fā)性產(chǎn)物定性分析

將菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，每個菌種重復(fù)三次；放在恒溫培養(yǎng)箱里，培養(yǎng)時間為5-10天。

GC-MS檢測揮發(fā)性氣體，用HP-5MS型毛細(xì)管柱(涂層：(5％苯基)-甲基聚硅氧烷，30.0m×0.25mm，涂層厚度：0.25μm)來分離揮發(fā)性氣體，氮?dú)鉃檩d氣。毛細(xì)管柱升溫程序如下：33℃維持2min，再以7℃/min的速率升溫至220℃維持7min。質(zhì)譜掃描速率為：5.0000scans/s。質(zhì)譜范圍41-560amu(原子質(zhì)量單位，atomic mass unit)。通過比較質(zhì)譜儀中NIST MS Search 2.0數(shù)據(jù)庫來鑒定揮發(fā)性物質(zhì)。

萃取步驟：萃取頭老化(氣相法)，老化的溫度分別為柱溫150℃，后進(jìn)樣口250℃，前檢測器200℃，老化時間10min；萃取：用電鉆在培養(yǎng)皿的側(cè)面打孔，放在支架上，將老化后的萃取針平行插入，將萃取頭調(diào)出，萃取時間為40min；進(jìn)樣：當(dāng)離子元溫度為150℃，壓力為70時就可以進(jìn)樣，將萃取頭調(diào)回，從頂空瓶中取出，插入進(jìn)樣孔中，然后將萃取頭調(diào)出，停留大概40s后拔出萃取頭；將分析的結(jié)果保存。

1.4定量分析

1.4.1菌株培養(yǎng)

用打孔器取同心圓上的菌塊(直徑為0.5mm)，接種在有10ml PDA(sigma)培養(yǎng)基9cm的培養(yǎng)皿中，在黑暗條件下25℃下培養(yǎng)5天。

1.4.2GC-FID定量分析參數(shù)設(shè)置

Agilent 7980GC-FID用HP-5MS型毛細(xì)管柱(涂層：(5％苯基)-甲基聚硅氧烷，30.0m×0.25mm，涂層厚度：0.25μm)來分離揮發(fā)性氣體。汽化溫度220℃恒壓20psi，不分流。柱溫35℃，保持2min，7℃/min升到220℃，保持7min；FID檢測器溫度250℃，H₂:O₂為40:400mL/min。

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配置標(biāo)樣1,8-cineole(相對分子質(zhì)量154.24g/mol，密度為0.9267g/ml)和內(nèi)標(biāo)linalool(相對分子質(zhì)量154.25g/mol，密度為0.87g/ml)的混合液，用正己烷稀釋成5個不同濃度，但內(nèi)標(biāo)濃度不變，如下表1。用GC-FID做標(biāo)準(zhǔn)曲線，取混合液，進(jìn)樣1μL，每個樣重復(fù)三次。將實(shí)驗(yàn)得出每個樣中的峰面積取均值，以As/Ai為橫坐標(biāo)，Vs/Vi為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算相對校正因子F。

表1 待測混合液的稀釋濃度

1.4.4測定樣品中1,8-cineole(桉葉油素)的含量

用電鉆在有樣品菌株的培養(yǎng)皿側(cè)面打孔，取濃度為0.0005μL/μL的linalool 1μL注射進(jìn)培養(yǎng)皿中，用封口膜封好口，將加入內(nèi)標(biāo)的培養(yǎng)皿放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中1h，然后用纖維萃取頭(50/30μm DVB/CAR/PDMS，Supelco)在室溫下萃取60min，進(jìn)樣1min。每個菌株三個重復(fù)。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中1,8-cineole的含量。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1分類地位鑒定

由于菌株不產(chǎn)生孢子，因此只能通過分子手段確定其分類地位。通過4個基因位點(diǎn)的PCR序列在NCBI中blast的結(jié)果如表2所示，確定了菌株的OTU種，為Annulohypoxylon。本發(fā)明將分離的菌株命名為環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株FPYF3050(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)。

表2 測序結(jié)果

2.2揮發(fā)性成分定性分析

2.2.1定性分析

通過GC-MS分析了環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株FPYF3050的特殊揮發(fā)性成分，從質(zhì)譜圖(圖1)中可以看到4種有效成分如表3，其中8.01和9.89這兩個保留時間的成分也存在空白對照中。

表3 有效揮發(fā)性成分

注：*表示該成分在空白對照中有存在。

本發(fā)明將分離的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株FPYF3050(Annulohypoxylon sp.FPYF3050)，提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No.12771。

2.2.2最優(yōu)萃取時間

在相同的進(jìn)樣條件下，分別通過5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、90min、120min 9種不同的萃取時間進(jìn)行了最優(yōu)萃取時間篩選，結(jié)果見圖2。

從圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，分別采用5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、90min以及120min這9種不同的萃取時間進(jìn)行萃取，隨著萃取時間的逐步升高，所檢測到的桉葉油素的產(chǎn)量逐漸提高，其中，經(jīng)比較得出最優(yōu)且適合的萃取時間為60min。

2.2.3不同培養(yǎng)時間下桉葉油素的產(chǎn)量變化

通過在最優(yōu)的萃取時間檢測了環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株FPYF3050在1到10天培養(yǎng)下1，8-cineole(桉葉油素)的產(chǎn)量變化，結(jié)果顯示菌株的培養(yǎng)時間在120h和168h之間，1,8-cineole的產(chǎn)量達(dá)到最高，如圖3所示。

2.3揮發(fā)性成分定量分析

2.3.1環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株FPYF3050產(chǎn)生氣體的體積

培養(yǎng)皿的直徑為8.4cm，高為1.1cm，PDA培養(yǎng)基占用的體積為10mL，計算得到除菌絲及培養(yǎng)基外剩余的空間體積約為50mL。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和相對校正因子的計算

通過GC-FID檢測得到標(biāo)樣和內(nèi)標(biāo)的面積，已知加入標(biāo)樣和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量，以As/Ai(標(biāo)樣面積/內(nèi)標(biāo)面積)為橫坐標(biāo)，Vs/Vi(標(biāo)樣體積/內(nèi)標(biāo)體積)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。

R稱為線性相關(guān)系數(shù)，R值為0.9995表示X和Y之間的線性相關(guān)程度為99.95％，說明該線性關(guān)系可以來對樣品中的桉葉油素定量。

F校正因子計算公式為F＝(Ai*Vs)/(As*Vi)，本次檢測中F值為0.85。

2.3.3菌株產(chǎn)生的1,8-cineole(桉葉油素)的含量

根據(jù)GC-FID中得到的線性回歸方程和質(zhì)量相對校正因子，通過線性回歸方程得到質(zhì)量再與相對校正因子相乘得到環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株FPYF3050在生長6天時產(chǎn)生的1,8-cineole(桉葉油素)的質(zhì)量，再根據(jù)已知?dú)怏w占用的體積計算得到環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株FPYF3050產(chǎn)生1,8-cineole的濃度為0.764ppmv。

試驗(yàn)例1環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株在農(nóng)林廢棄物培養(yǎng)下產(chǎn)生桉葉油素

本發(fā)明分別在5種農(nóng)林廢棄物，包括：玉米秸稈、小麥秸稈、楊樹木屑、水稻秸稈和松樹木屑等天然木質(zhì)纖維上接種所述的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株(Annulohypoxylon sp.FPYF3050，微生物保藏編號為：CGMCC No.12771)，通過GC-MS分析，最優(yōu)的天然木質(zhì)纖維為楊樹木屑(圖5)，本發(fā)明所分離的環(huán)紋炭團(tuán)菌菌株在楊樹木屑培養(yǎng)基上能夠快速生長、桉葉油素產(chǎn)量高。