本發(fā)明涉及植物病害的生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株對植物線蟲具有寄生和毒殺作用的輻毛小鬼傘(Coprinelllus radians)HMQAU090439N的篩選、發(fā)酵、殺線蟲活性測定及對小麥禾谷孢囊線蟲病的防治應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植物病原線蟲是一種危害嚴(yán)重的植物病害，每年給全世界農(nóng)業(yè)帶來近1570億美元的經(jīng)濟(jì)損失。已報(bào)道的植物病原線蟲達(dá)200多屬5000余種，其中禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)是危害小麥等麥類作物的重要病原線蟲，歐洲、亞洲、非洲、北美洲、南美洲和大洋洲的40多個(gè)國家均有分布，在國內(nèi)造成的小麥產(chǎn)量損失為10％-30％，最高達(dá)70％以上。

目前，化學(xué)防治仍然是控制植物線蟲的重要措施之一，化學(xué)殺線劑(如土壤熏蒸劑和非熏蒸劑)具有一定的防治效果，但長期使用劇毒化學(xué)殺線劑給環(huán)境和人類的健康帶來的危害日漸顯露。由于傳統(tǒng)殺線劑(如甲基溴化物和有機(jī)磷酸鹽)不斷被淘汰，研究開發(fā)高效低毒的生物殺線劑已成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要問題，因此尋找新的真菌資源是研發(fā)生物殺線制劑的關(guān)鍵因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一個(gè)目的在于提供一種從禾谷孢囊線蟲的孢囊上分離并篩選出來的生防真菌——輻毛小鬼傘(Coprinelllus radians)菌株HMQAU090439N，豐富小麥禾谷孢囊線蟲病生防真菌菌種資源，為研究開發(fā)生物殺線劑奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明第二個(gè)目的在于提供一種利用上述菌株HMQAU090439N生產(chǎn)的微生物菌劑。

本發(fā)明第三個(gè)目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。

本發(fā)明第四個(gè)目的在于提供上述微生物菌劑對禾谷孢囊線蟲的生測方法。

本發(fā)明第五個(gè)目的在于提供上述菌株HMQAU090439N防治禾谷孢囊線蟲病的室內(nèi)盆栽試驗(yàn)方法。

本發(fā)明第六個(gè)目的在于提供上述菌株HMQAU090439N防治禾谷孢囊線蟲病的田間試驗(yàn)方法。

本發(fā)明第七個(gè)目的在于提供上述菌株HMQAU090439N在防治禾谷孢囊線蟲病上的應(yīng)用。

本發(fā)明第八個(gè)目的在于提供上述菌株HMQAU090439N的鑒定方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述。

一株輻毛小鬼傘(Coprinelllus radians)HMQAU090439N于2016年1月8日保藏于中國科學(xué)院微生物所內(nèi)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)：CGMCC No.11814。

利用上述輻毛小鬼傘HMQAU090439N生產(chǎn)的微生物菌劑，活性成分為菌體或發(fā)酵濾液。

上述微生物菌劑的制備步驟如下。

帶菌平板(菌體)的制備：將菌株HMQAU090439N轉(zhuǎn)接至PDA平板上，25度培養(yǎng)，待菌落直徑為4-6cm時(shí)備用。

發(fā)酵濾液：(1)菌種活化：將低溫保藏的菌株HMQAU090439N于PDA平板上25℃培養(yǎng)48h，得到活化的菌種；(2)發(fā)酵培養(yǎng)：從活化的菌落邊緣用直徑為5mm的打孔器打出兩個(gè)菌餅，接種到70mL PD液體培養(yǎng)基中，120r/min，25℃搖培7天后，8000rpm離心10min，取發(fā)酵上清，用細(xì)菌過濾器過濾，收集發(fā)酵濾液，4℃保存?zhèn)溆?；PD液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，加水定容至1L。150mL三角瓶每瓶分裝70mL培養(yǎng)基。

帶菌麥粒(菌體)的制備：先將小麥粒用清水清洗干凈，再用清水浸泡至手指搓捻無實(shí)心感，用沸水煮25-30min，至麥粒無白心，濾水裝瓶，250mL三角瓶每瓶裝50g，高溫滅菌后冷卻至室溫，在無菌條件下將HMQAU090439N帶菌平板上加5ml無菌水，用手術(shù)刀將菌絲刮下來接種到上述麥粒培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)15d后備用。

本發(fā)明的有益效果是。

1.本發(fā)明的輻毛小鬼傘HMQAU090439N菌株對禾谷孢囊線蟲有很好的生防效果，既能寄生小麥孢囊線蟲孢囊，對孢囊孵化有較強(qiáng)的抑制效果，又對二齡幼蟲(J2)有較高的毒殺作用，對盆栽小麥孢囊線蟲病防治效果明顯。

2.本發(fā)明所提供的輻毛小鬼傘HMQAU090439N菌株防治效果穩(wěn)定，對環(huán)境友好，大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵工藝簡單、生產(chǎn)成本低廉。

根據(jù)本發(fā)明提供的輻毛小鬼傘HMQAU090439N和發(fā)酵濾液菌劑可作為單劑或組合制劑利用或施用，這樣的制劑可包括農(nóng)業(yè)上合適的助劑、溶劑、載體、表面活性劑或填充劑。

本發(fā)明的菌劑可用于防治各種線蟲病害。

本發(fā)明的菌劑可用于防治的線蟲實(shí)例包括，但不限于禾谷孢囊線蟲，這里所使用的線蟲是指植物線蟲，所述植物線蟲意指對植物造成傷害的植物寄生線蟲和生活在土壤中的線蟲。植物寄生線蟲包括，但不僅限于，體外寄生蟲，例如劍線蟲屬、長針線蟲屬、毛刺線蟲屬；半寄生物例如穿刺線蟲屬；遷移性內(nèi)寄生蟲，例如短體屬、穿孔線蟲屬和Scutellonerna spp.；固著性寄生蟲，例如異皮線蟲屬、Globoderal spp.和根結(jié)線蟲屬；莖和葉內(nèi)寄生蟲，例如莖線蟲屬、滑刃線蟲屬和Hirshmaniella spp.。尤其是有害的根寄生性土壤線蟲，例如異皮線蟲屬或球異皮線蟲屬的孢囊線蟲和根結(jié)線蟲屬的根結(jié)線蟲。然而，這里描述的化合物的使用不局限于這些屬或物種，且也以同樣的方式擴(kuò)展到其他線蟲。

本發(fā)明中的菌劑可作用的植物并不是特別限制的：例如，谷物(例如水稻、大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、高粱等)、豆類(大豆、紅豆、菜豆、蠶豆、豌豆、花生等)，果樹或水果(蘋果、柑橘、梨、葡萄、桃、杏、櫻桃、核桃、扁桃、香蕉、草莓等)、蔬菜(甘藍(lán)、西紅柿、菠菜、椰菜、生菜、洋蔥、蔥、胡椒等)、塊根作物(胡蘿卜、土豆、甘薯、蘿卜、蓮藕等)、經(jīng)濟(jì)作物(棉、麻、油菜、甜菜、甘蔗、橄欖、橡膠、咖啡、煙草、茶葉等)、牧場用植物(果園草、高粱、三葉草、紫花苜蓿等)、草坪用草(高麗草、小糠草等)、調(diào)味作物(薰衣草、迷迭香、百里香、香菜、胡椒、姜等)和開花植物(菊花、玫瑰、蘭花等)。

根據(jù)本發(fā)明的菌劑對植物和植物部位的處理，使用常用的處理方法，直接進(jìn)行或作用于他們的周圍、生長地進(jìn)行，例如通過浸漬、噴涂、霧化、灌溉、揮發(fā)、撒粉、撒播、發(fā)泡、涂布、澆灌、滴水灌溉等，并且在繁殖材料的情況下，尤其是種子的情況下，還通過一層或多層涂覆等作為用于干燥種子的處理粉末、處理種子的溶液、用于漿液處理的水溶性粉末。也可通過超低容量的辦法施用菌劑，或注射菌劑本身到土壤中。

具體實(shí)施方式：

下面實(shí)施例用于進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但是不以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無特殊說明，一般為常規(guī)方法。

小麥禾谷孢囊線蟲土樣的采集，孢囊的分離及無菌孢囊和二齡幼蟲的獲得方法。

小麥禾谷孢囊線蟲土樣的采集：從山東省青島市萊西市夏格莊鎮(zhèn)五四農(nóng)場小麥禾谷孢囊線蟲病田采集，去除植株周圍地面表土，用滅菌鏟取距地表10-20cm的小麥根圍土壤放入塑封袋內(nèi)，隨機(jī)五點(diǎn)取樣，每點(diǎn)取兩株小麥，共10株，混合成一個(gè)樣本。

孢囊的分離：將土樣充分混勻，取500g放入直徑27cm，深10cm盆中，注入水，充分?jǐn)噭?。將上懸液過40目和60目套篩，用60目篩收集孢囊，反復(fù)5次。將60目篩上收集到的孢囊、根殘片及其他碎片淋洗至燒杯中。將燒杯中的懸液經(jīng)濾紙過濾，將濾紙移到培養(yǎng)皿內(nèi)，置于顯微鏡下觀察。用毛刷挑取孢囊至鋪濕濾紙的表面皿上，放入5℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

無菌孢囊的獲得：從小麥禾谷孢囊線蟲病土樣中分離孢囊，挑出新鮮飽滿成熟的孢囊。將孢囊用1％NaClO表面消毒3min，無菌水沖洗三次，轉(zhuǎn)至PDA平板上，25℃培養(yǎng)10天，無病菌長出的為無菌孢囊。

二齡幼蟲的獲得：將小麥土樣在5℃溫度下預(yù)處理30天后，分離其內(nèi)孢囊，將孢囊浸在清水中，置15℃下孵化。3d后開始收集線蟲，每天及時(shí)收集新孵化出來的二齡幼蟲(J2)，最后將獲得到的J2置于5℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例1：菌株HMQAU090439N及其發(fā)酵濾液對禾谷孢囊線蟲的拮抗作用。

(1)菌株HMQAU090439N對禾谷孢囊線蟲孢囊的寄生性

將無菌孢囊轉(zhuǎn)至菌株HMQAU090439N帶菌平板的菌落邊緣，每皿5個(gè)，三次重復(fù)，25度培養(yǎng)7d后，將孢囊輕輕挑出(注意不要弄破孢囊),1％NaClO表面消毒3min，無菌水沖洗三次后，置于PDA平板上，25℃培養(yǎng)5天。觀察孢囊長菌情況，記載菌株對孢囊的寄生率。帶菌平板接種孢囊試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株HMQAU090439N對禾谷孢囊線蟲的孢囊有很強(qiáng)寄生能力，寄生率達(dá)100％，從而再進(jìn)一步研究其作為生防菌株的研究價(jià)值。

(2)菌株HMQAU090439N發(fā)酵濾液對禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲的毒性取2mL發(fā)酵濾液于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入50條新孵化的J2幼蟲，于15℃培養(yǎng)箱中，分別于0h，6h，12h，24h，48h觀察記錄J2死亡率。以無菌PD液體培養(yǎng)基為對照，每處理3次重復(fù)，計(jì)算出平均死亡率和校正死亡率。鑒定J2死亡的方法：采用“體態(tài)法”和“生理鹽水刺激法”(方中達(dá)，《植病研究方法》，第三版，1996,319)，在體視顯微鏡下觀察經(jīng)過處理的J2活動(dòng)狀態(tài)和體態(tài)。存活的J2蟲體一般是彎曲的，且可以不斷地移動(dòng)；死亡的J2蟲體一般是僵直的，然后將蟲體僵直的J2再次分離后置于盛有2％生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用輕輕撥動(dòng)J2，靜止不動(dòng)的即為死亡個(gè)體。

校正死亡率＝((試驗(yàn)組死亡率-對照組死亡率)/對照組死亡率)×100％試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株HMQAU090439N發(fā)酵濾液對禾谷孢囊線蟲的J2有較強(qiáng)的毒殺作用，6h和12h的致死率分別為21.3％和66.0％，24h致死率達(dá)92.67％，48h能殺死全部J2。

(3)菌株HMQAU090439N發(fā)酵濾液對禾谷孢囊線蟲孢囊孵化的影響取2mL發(fā)酵濾液于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入10個(gè)無菌孢囊，于15℃培養(yǎng)箱中，每天觀察記錄J2孵化條數(shù)。以無菌PD液體培養(yǎng)基做對照，每處理3次重復(fù)。孵化動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株發(fā)酵濾液處理1至10天的平均孵化量分別為4.3，6.0，7.3，10.0，13.0，17.0，20.0，21.3，23.7，25.7；對照的1至10天的平均孵化量分別為，105.3，151.7，178，191.7，206.7，222.7，228.3，236.7，240.0，242.3條。表明發(fā)酵濾液對禾谷孢囊線蟲的孢囊孵化有明顯抑制作用，第10天平均抑制率89.4％。

實(shí)施例2：菌株HMQAU090439N對禾谷孢囊線蟲的盆栽防效

每個(gè)紙杯中加入混勻的5g帶菌麥粒和200g禾谷孢囊線蟲病土，每杯播種一粒小麥種子，20℃恒溫培養(yǎng)，以加入未混帶菌麥粒的病土紙杯為對照，每處理5次重復(fù)，第60d調(diào)查小麥根部侵染情況。將杯中小麥根及土壤全部取出，用清水清洗，檢查記錄根部及60目篩子上白色雌蟲的數(shù)量。計(jì)算孢囊減退率。用次氯酸鈉- 酸性品紅染色法，觀察小麥根組織，統(tǒng)計(jì)J2侵染量，并測定小麥地上部鮮重。

孢囊減退率＝((對照孢囊數(shù)-處理孢囊數(shù))/對照孢囊數(shù))×100％

J2侵染抑制率＝((對照J(rèn)2侵染量-處理J2侵染量)/對照J(rèn)2侵染量)×100％

盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，第60d時(shí)，帶菌麥粒處理組和對照組的單株小麥根部平均孢囊數(shù)分別為42.2個(gè)和110.8個(gè)，孢囊減退率為61.9％；帶菌麥粒處理組和對照組的單株小麥地上鮮重分別為1.4克和0.7克，處理組的鮮重增加了100％；帶菌麥粒處理和對照的單株小麥J2侵染量分別為42.4條和53條，J2侵染抑制率為20％。表明接種帶菌麥粒的處理組中禾谷孢囊線蟲的孢囊減少明顯，小麥長勢良好，J2侵染量降低。菌株HMQAU090439N對禾谷孢囊線蟲病有較好的防治效果。

實(shí)施例3：菌株HMQAU090439N對禾谷孢囊線蟲的田間防效

于秋季小麥播種時(shí)，將長20cm，直徑4cm的塑料管底端用紗布封住，每管加入混勻5g帶菌麥粒與200g未感染CCN的健康土后，每管播種三粒小麥種子，埋入田間，以只加入未感染CCN的健康土為對照，每處理5次重復(fù)，待小麥出苗后，每塑料管中接種20個(gè)禾谷孢囊線蟲的孢囊。四月中旬調(diào)查小麥根部侵染情況。將管中小麥根及土壤全部取出，用清水清洗，檢查記錄根部及60目篩子上白色雌蟲的數(shù)量。計(jì)算孢囊減退率。用次氯酸鈉-酸性品紅染色法，觀察小麥根組織，統(tǒng)計(jì)J2侵染量。

田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，4月15號(hào)時(shí)，帶菌麥粒處理組和對照組的單株小麥根部平均孢囊數(shù)分別為4.8個(gè)和7.8個(gè)，孢囊減退率為38.4％；帶菌麥粒處理和對照的單株小麥J2侵染量分別為3.4條和8.2條，J2侵染抑制率為58.54％。表明接種帶菌麥粒的處理組中禾谷孢囊線蟲孢囊減少明顯，小麥長勢良好，J2侵染量降低。菌株HMQAU090439N對禾谷孢囊線蟲病有較好的防治效果。

實(shí)施例1，2，3結(jié)果表明，菌株HMQAU090439N及其發(fā)酵濾液對禾谷孢囊線蟲有很好的生防效果，既能寄生禾谷孢囊線蟲孢囊，對孢囊孵化有較強(qiáng)的抑制效果，又對J2有較高的毒殺作用。

實(shí)施例4：菌株HMQAU090439N的鑒定。

(1)形態(tài)鑒定

在PDA平板上25℃培養(yǎng)7天，菌落直徑7.0cm，菌落黃色，絮狀。菌絲無色或淡黃色，孢子量大，單胞無色，長3-10μm，寬2-4μm，棍棒型或長卵形。產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)密集，孢子著生在產(chǎn)孢梗末端疣狀凸起上。

(2)分子鑒定

用SDS法提取菌株HMQAU090439N基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用引物對ITS1/ITS4擴(kuò)增rDNA-IITS片段。所述引物序列為ITS 1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG C；ITS 4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC。擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5μL，5mM dNTP 2μL，10μM引物各1μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 1μL，補(bǔ)水至25μL。ITS-PCR程序：94℃預(yù)變性3min，94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸1min，共計(jì)34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min，循環(huán)結(jié)束后4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行純化和雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)Seqman5.0軟件自動(dòng)裝配后導(dǎo)出重疊群(Contig)并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列對比，并用MEGA 5.05軟件采用鄰接法(neighbor–joining analysis，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中Bootstrap檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為1,000次。結(jié)果表明，菌株HMQAU090439N為Coprinelllus radians。

綜合以上形態(tài)特征和rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果可知菌株HMQAU090439N屬于輻毛小鬼傘(Coprinelllus radians)。

上述輻毛小鬼傘菌株HMQAU090439N的鑒定方法，包括以待測菌株的基因組DNA為模板，以ITS1和ITS4為引物的擴(kuò)增，如果所得PCR產(chǎn)物為SEQIDNo:1所示的核苷酸序列，即為HMQAU090439N菌株。

<110> 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一株防治及其應(yīng)用

<160> 1

<210> 1

<211> 685

<212> DNA

<213> 輻毛鬼傘(Coprinelllus radians)HMQAU090439N

<400> 1

TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ACGAATAACT ATGGCGTTGG TTGTAGCTGG 60

CTCCTCGGAG CAATGTGCAC GCCCGCCATT TTTATCTTTC CACCTGTGCA CCGACTGTAG 120

GTCTGGATAC CTCTCGCCTC CGGGCGGATG CGAGGGTTGC TCGTAAGGGC TTCCCTTGAA 180

CTTCCAGGCT CTACGTCTTT TTACACACCC CAATAGTATG ATGCAGAATG TAGTCAATGG 240

GCTTCTCAGC CTATAAAACA CTATACAACT TTCAGCAACG GATCTCTTGG CTCTCGCATC 300

GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAAGTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG 360

AATCTTTGAA CGCACCTTGC GCTCCTTGGT ATTCCGAGGA GCATGCCTGT TTGAGTGTCA 420

TTAAATTCTC AACCTCACCA GTTTTCTGAA CTGACTGAGG CTTGGATGTG GGGGTTTGTG 480

CAGGCTGCCT CACCGGCGGT CTGCTCCCCT GAAATGCATT AGCGAGGTTC ATGCTGGACC 540

TCCGTCTATT GGTGTGATAA TTATCTACGC CGTGGACGAG GATACAGACT CGCTTCTAAC 600

CGTCCGCGAG GACAATACCT TGACAATTTG ACCTCAAATC AGGTAGGACT ACCCGCTGAA 660

CTTAAGCATA TCAATAAGCG GAGGA 685