本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一株珊瑚來源真菌土曲霉(Aspergillus terreus)菌株C21-10的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著海洋天然產(chǎn)物和海洋藥物研究的不斷深入，海洋共附生微生物。海洋中存在有大量的海洋微生物，且海洋微生物由于所處環(huán)境特殊，具有與陸源微生物所不具有的一些特異遺傳和代謝特性，不僅可適應(yīng)高鹽、低溫、高壓、寡營養(yǎng)等海洋特殊環(huán)境，同時(shí)生長周期短、代謝易調(diào)控、菌種易選育、可通過大規(guī)模發(fā)酵實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)生物制劑和醫(yī)藥等領(lǐng)域開發(fā)利用中具有獨(dú)特優(yōu)勢，具有十分重要的研究價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，并已有許多相關(guān)專利與成功事例。

珊瑚是刺胞動(dòng)物門(Cnidaria)珊瑚蟲綱(Anthozoa)海生無脊椎動(dòng)物，珊瑚代謝產(chǎn)物種類繁多、結(jié)構(gòu)新穎，是海洋天然產(chǎn)物三大來源之一。大量研究表明，珊瑚共附生微生物可能是這些代謝產(chǎn)物的真正產(chǎn)生者。

因此，在尋找新穎結(jié)構(gòu)的活性化合物以及新的珊瑚共附生微生物的相關(guān)研究具有重要的實(shí)踐意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株珊瑚來源真菌土曲霉(Aspergillus terreus)菌株C21-10的應(yīng)用，尤其在抗氧化、抗菌和/或抗乙酰膽堿酯酶活性方面的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明從徐聞珊瑚保護(hù)區(qū)的普哥濱珊瑚中分離得到一株土曲霉菌株C21-10，該菌株于2016年1月18日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No：60004。

利用所述土曲霉菌株C21-10能夠制備具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰膽堿酯酶活性的化合物，因此，該菌株在制備具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰膽堿酯酶活性的制劑方面，以及在制備具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰膽堿酯酶活性的化合物方面，都具有很好的應(yīng)用前景。

優(yōu)選地，所述抗菌是指抗金黃色葡萄球菌(Staphlococcusaureus,S.a)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和/或大腸桿菌(Escherichia coli,E.c)。

所述土曲霉菌株C21-10的形態(tài)特征如下：菌株C21-10在PDA培養(yǎng)基上，菌落土褐色至肉桂色，反面呈暗黃色至棕褐色，絲絨狀菌絲上有豐富的粉末，菌絲呈放射狀，無皺紋，邊緣絲絨狀，無滲出液或可溶性色素。

所述土曲霉菌株C21-10的顯微形態(tài)特征如下：顯微觀察，菌株C21-10分生孢子頭初為疏松球形，繼而成為致密的球形，分生孢子梗生自基質(zhì)，孢梗徑短，120-160μm×4-4.3μm，有些彎曲，無色，壁光滑；頂囊半球形，直徑為15-18μm，約有3/4表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層；梗基8.6-9.5μm×2.5-3μm，瓶梗7-8μm×1.3-1.5μm，排列密集、向上；分生孢子近球形，2.4μm，壁光滑。

另外，本發(fā)明分離得到四種具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰膽堿酯酶活性的化合物，分別為化合物8、化合物11、化合物12和化合物13，其結(jié)構(gòu)式分別如下所示：

所述化合物8在制備具有抗氧化和/或抗乙酰膽堿酯酶活性的物質(zhì)或制劑方面的應(yīng)用，所述化合物11、12和/或13在制備具有抗菌和/或抗乙酰膽堿酯酶活性的物質(zhì)或制劑方面的應(yīng)用，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述抗菌是指抗金黃色葡萄球菌(Staphlococcusaureus,S.a)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和/或大腸桿菌(Escherichia coli,E.c)。

另外，所述化合物11為一種新構(gòu)型的丁內(nèi)酯Ⅶ的化合物，其結(jié)構(gòu)如上所示。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明分離獲得了一株珊瑚來源真菌土曲霉(Aspergillus terreus)菌株C21-10。利用該菌株能夠制備具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰膽堿酯酶活性的化合物，該菌株可以很好的應(yīng)用于抗氧化、抗菌和/或抗乙酰膽堿酯酶等方面。

因此，該菌株在制備具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰膽堿酯酶活性的制劑方面，以及在制備具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰膽堿酯酶活性的化合物方面，都具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為菌株C21-10在PDA培養(yǎng)基上的菌落菌苔特征；A-B：菌落3d時(shí)正面(A)和反面形態(tài)(B)；C-D：菌落7d時(shí)正面(A)和反面形態(tài)。

圖2為菌株C21-10的分生孢子梗和分生孢子；1-2：產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；3-4：分生孢子頭；5-6：分生孢子。

圖3為菌株C21-10的ITS-rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖4為化合物11的核磁共振氫譜圖(¹H-NMR圖譜)。

圖5為化合物11的核磁共振碳譜圖(¹³C-NMR圖譜)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。

實(shí)施例1菌株C21-10的分離鑒定

1、菌株分離

(1)樣品：采集自徐聞珊瑚保護(hù)區(qū)的普哥濱珊瑚。

(2)樣品處理：樣品用無菌海水快速清洗3次后，用滅菌的剪刀、解剖刀、研磨棒在無菌操作臺內(nèi)將珊瑚樣品磨碎，放入滅菌的研缽內(nèi)研磨至漿狀，用滅菌的藥匙取10g左右于90mL無菌海水中，然后玻璃珠振蕩3min，靜置20min，取上清液制成10^-2、10^-3的稀釋液。

(3)菌株分離：吸取100μL各稀釋液，用滅菌涂布棒均勻涂布到相應(yīng)的分離培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5d。待菌絲長出后，挑取不同形態(tài)菌落，純化，共分離到23株菌，挑取單菌落于PDA斜面上，培養(yǎng)并保存。

其中的一個(gè)命名為C21-10的菌株具有抗氧化、抗菌和抗乙酰膽堿酯酶活性。

2、菌株鑒定

(1)形態(tài)鑒定

如附圖1所示，菌株C21-10在PDA培養(yǎng)基上，菌落土褐色至肉桂色，反面程暗黃色至棕褐色，絲絨狀菌絲上有豐富的粉末，菌絲呈放射狀，無皺紋，邊緣絲絨狀，無滲出液或可溶性色素。

(2)顯微形態(tài)特征

如附圖2所示，顯微觀察發(fā)現(xiàn)，菌株C21-10分生孢子頭初為疏松球形，繼而成為致密的球形，分生孢子梗生自基質(zhì)，孢梗徑短，120-160μm×4-4.3μm，有些彎曲，無色，壁光滑；頂囊半球形，直徑為15-18μm，約有3/4表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層；?；?.6-9.5μm×2.5-3μm，瓶梗7-8μm×1.3-1.5μm，排列密集、向上；分生孢子近球形，2.4μm，壁光滑。

(3)分子鑒定

對上述分離得到的菌株C21-10進(jìn)行ITS-rDNA序列分析。

利用ITS通用引物ITS1F和ITS4經(jīng)PCR分別從真菌中提取DNA，得到長約600bp的單一PCR片段，對純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序分析。

經(jīng)BLAST對比分析和MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如附圖3所示。

上述鑒定結(jié)果顯示，菌株C21-10屬于土曲霉(Aspergillus terreus，JQ717327)，命名為土曲霉菌株C21-10，并于2016年1月18日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，地址為：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，保藏編號為GDMCC No：60004。

實(shí)施例2利用菌株C21-10分離活性化合物

1、化合物的分離

將土曲霉菌株C21-10在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液和菌絲體，用乙酸乙酯分別萃取發(fā)酵液和菌絲體，得到的浸膏用氯仿：甲醇(1：1)溶解后上凝膠(Sephadex LH-20)，洗脫溶劑氯仿：甲醇(1：1)，收集后分別點(diǎn)板，展開劑石油醚：乙酸乙酯(2：1)根據(jù)點(diǎn)板結(jié)果分別合并樣品，一共獲得13種化合物。

具體分離方法如下：

(1)珊瑚真菌土曲霉C21-10的菌種活化：用PDA斜面培養(yǎng)基在28℃下活化培養(yǎng)2-3代。

(2)珊瑚真菌土曲霉C21-10發(fā)酵液和菌絲體的制備

按8％的接種量將活化好的菌株接種到含有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于28℃，150r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)6d。發(fā)酵條件為：最適pH7.0-7.5，最適溫度28℃、接種量8％，150r/min搖床培養(yǎng)6d。

其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：1％麥芽糖、2％可溶性淀粉、0.02％N_aH₂PO₄、0.04％K₂HPO₄。

然后采用抽濾的方法處理發(fā)酵產(chǎn)物，從而得到發(fā)酵液和菌絲體。

(3)珊瑚真菌土曲霉C21-10發(fā)酵粗提物

A、發(fā)酵液萃取物的制備

準(zhǔn)確量取發(fā)酵液，用等量體積的乙酸乙酯溶液充分萃取3次，將萃取的有機(jī)相進(jìn)行合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，最后得到發(fā)酵液乙酸乙酯提取物。

B、菌絲體萃取物的制備

菌絲體用乙酸乙酯超聲處理30min，放在室溫下，浸泡48h左右進(jìn)行抽濾，除去菌絲體殘余物，減壓濃縮干燥后，最后得到菌絲體乙酸乙酯提取物。

經(jīng)薄層層析(TLC)分析上述A、B得到的發(fā)酵液乙酸乙酯提取物和菌絲體乙酸乙酯提取物的成分相似，合并提取物。

將提取物用氯仿、甲醇溶解后上凝膠(Sephadex LH-20)，洗脫溶劑氯仿：甲醇(1:1)，收集后分別點(diǎn)板，展開劑石油醚:乙酸乙酯(2:1)，根據(jù)點(diǎn)板結(jié)果分別合并樣品，一共獲得13種化合物。目前9種化合物結(jié)構(gòu)已確定，還有4種化合物結(jié)構(gòu)仍在鑒定中。

2、化合物的鑒定

(1)對獲得的化合物進(jìn)行核磁共振分析鑒定，根據(jù)¹H-NMR圖譜和¹³C-NMR圖譜等結(jié)果，結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)的信息，分析出化合物的化學(xué)式和結(jié)構(gòu)式，如表1所示。

表1化合物結(jié)構(gòu)信息

(2)其中，化合物11是黃色油狀物，核磁共振譜數(shù)據(jù)歸屬如下表2所示。

表2化合物11核磁共振譜數(shù)據(jù)歸屬

(3)對化合物11進(jìn)行核磁共振分析鑒定的譜圖，如附圖4和5所示。

實(shí)施例3化合物活性測定

1、抗氧化活性

實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)《Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga》采用體外1,1-二苯基-苦基肼(DPPH)抗氧化模型進(jìn)行化合物抗氧化活性評價(jià)。用酶標(biāo)儀在96孔板上篩選樣品在100μM時(shí)的DPPH自由基清除率，計(jì)算平均值，陽性對照為維生素C計(jì)算各濃度下的抑制率后，對其中有活性的的單體化合物，再進(jìn)行定量分析，梯度稀釋，平行測定三次，并用SPSS軟件計(jì)算當(dāng)DPPH達(dá)到50％清除率時(shí)的濃度，即半效應(yīng)濃度(EC₅₀)。

結(jié)果如下表3所示：化合物8，化合物11，化合物12，化合物13都顯示出了抗氧化活性，其中化合物12，化合物13顯示出了明顯的抗氧化活性，甚至高于陽性對照維生素C?；衔?，化合物11顯示了中等強(qiáng)度的抗氧化活性。其余化合物抗氧化活性均不明顯。

表3單體化合物的DPPH自由基清除活性(X±S，n＝3)

備注：“-”表示沒有活性(12和13，活性比陽性對照好)

2、抗細(xì)菌

抗菌實(shí)驗(yàn)參考臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦《需氧菌釋法抗菌藥物敏感試驗(yàn)方法》(M7-A7)研究分離得到的單體化合物的抗菌活性。測試對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphlococcusaureus,S.a)，革蘭氏陰性菌副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)，大腸桿菌(Escherichia coli,E.c)，銅綠假單胞(P.Aeruginosa)，SL1(FJ404757.1,Pseudoalteromonas sp.)的抗菌活性。

結(jié)果如表4，對照陽性實(shí)驗(yàn)環(huán)丙沙星，其中化合物11對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌，革蘭氏陰性菌副溶血弧菌有抑菌活性，但活性并不是很強(qiáng)。化合物12，化合物13對金黃色葡萄球菌有強(qiáng)抑菌活性，對大腸桿菌有弱的抑菌活性。

表4部分單體化合物的抗菌活性

3、抗乙酰膽堿酯酶活性

阿爾茨海默氏病(Alzheimer，s disease,AD)是發(fā)生在老年和老年前期以進(jìn)行性神經(jīng)退化為特征的大腦退化性病變，又稱早老性癡呆癥。在各種病理理論中，膽堿能假說是目前被廣泛接受的。因此乙酰膽堿酯酶抑制劑是目前研究比較廣泛的應(yīng)用在AD中的藥物。本實(shí)驗(yàn)采用乙酰膽堿酯酶抑制活性篩選模型，對幾種化合物進(jìn)行抗乙酰膽堿酯酶的活性進(jìn)行探究。

對幾種化合物通過改進(jìn)的Ellman法進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性的測定，幾種化合物中抑制效果最明顯的的是化合物8，在100μM時(shí)的抑制率達(dá)到51.31％，對乙酰膽堿有一定的抑制作用，其他幾種化合物沒有抑制乙酰膽堿酯酶的活性，陽性對照為石杉堿甲。

表5單體化合物的抑制乙酰膽堿酯酶的活性(X±S，n＝3)

4、綜上所述，化合物活性匯總?cè)绫?所示。

表6化合物活性匯總

備注：+：有活性；-：沒有活性。