專利名稱：測定生防真菌和化學(xué)藥劑對靶標(biāo)病原菌增效作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)病蟲害防治領(lǐng)域，具體地說，涉及一種測定生防真菌和化學(xué)藥劑對靶標(biāo)病原菌增效作用的方法。
背景技術(shù)：
隨著生物農(nóng)藥的不斷出現(xiàn)和投入生產(chǎn)應(yīng)用，農(nóng)業(yè)病蟲害的防治已進(jìn)入真正意義上的化學(xué)防治與生物防治并存的新時代。將生防菌劑應(yīng)用于防治植物病害，減少化學(xué)藥劑的絕對用量，符合人們對生態(tài)保護(hù)和食品安全的要求，符合綠色植保的發(fā)展方向。生物農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病蟲害的防治，與化學(xué)藥劑相遇將是不可回避的問題。生物測定表明，大部分化學(xué)藥劑對生防菌有一定的抑制作用，只有少數(shù)化學(xué)藥劑對特定的生防菌無抑制作用，所以有選擇地使用生防菌劑與化學(xué)藥劑才能使兩者共同作用于病原菌。如果不清楚兩者的相互作用關(guān)系，將兩者任意結(jié)合，可能出現(xiàn)的化學(xué)藥劑對生防菌的抑制作用消弱或完全限制生防菌劑對病源菌的作用，達(dá)不到對植物病害防治的預(yù)想效果。由此可見，探明生防菌劑與化學(xué)藥劑兩者對病原菌的協(xié)同作用機制，將化學(xué)防治技術(shù)和生物防治技術(shù)有效地結(jié)合在一起并應(yīng)用于防治植物病害之中成為亟待解決的問題?；瘜W(xué)藥劑之間的協(xié)同作用評價方法已經(jīng)得到廣泛地應(yīng)用，例如，1925年提出的Abbott法多用于兩種殺蟲劑混用增效作用的評價，1960年提出的Gowing法多用于除草劑混用聯(lián)合作用的評價，1967年提出的Wadely法用于兩種殺菌劑混用增效作用的評價。鑒于生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥的協(xié)同作用的評價方法尚未見到報道，建立生防菌劑與化學(xué)藥劑協(xié)同作用的評價系統(tǒng)，研究生防菌劑與化學(xué)藥劑之間的相互作用關(guān)系，篩選合理的生防菌劑與化學(xué)藥劑組合或指導(dǎo)二者的合理應(yīng)用具有現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的是提供一種測定生防真菌和化學(xué)藥劑對靶標(biāo)病原菌增效作用的方法。由于不同類別的化學(xué)藥劑與生防真菌的協(xié)同作用要求采用不同的評價方法。因此，本申請是在菌絲生長速率法的基礎(chǔ)上，采用對峙接種培養(yǎng)來測定生防真菌與化學(xué)藥劑(殺菌劑)協(xié)同對靶標(biāo)病原菌的抑制作用，形成了不同于化學(xué)藥劑之間協(xié)同作用的新評價方法?；瘜W(xué)藥劑與生防真菌協(xié)同作用于靶標(biāo)菌，理想的目標(biāo)是二者產(chǎn)生對靶標(biāo)菌的增效作用。這種作用要顯著大，而二者自身的相互抑制作用要盡量小，也就是說，促進(jìn)大于抵消。不考慮生防真菌對化學(xué)藥劑的反作用，也不考慮靶標(biāo)菌對化學(xué)藥劑和生防真菌的反作用，那么化學(xué)藥劑與生防真菌對靶標(biāo)菌的抑制應(yīng)大于化學(xué)藥劑對生防真菌的抑制，生防真菌才有對病原菌的作用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種測定生防真菌和化學(xué)藥劑對靶標(biāo)病原菌增效作用的方法，包括以下步驟:
I)以相同的接種量，將生防真菌和靶標(biāo)病原菌同時接種于含有化學(xué)藥劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行對峙培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，測量菌落半徑，生防真菌和靶標(biāo)病原菌的菌落半徑分別以RTt和RBt表示；同時設(shè)置對照培養(yǎng)，以與對峙培養(yǎng)相同的接種量，將生防真菌和靶標(biāo)病原菌分別接種于不含所述化學(xué)藥劑的，且與對峙培養(yǎng)使用的相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時間與對峙培養(yǎng)相同，培養(yǎng)結(jié)束后測量菌落半徑，生防真菌和靶標(biāo)病原菌的菌落半徑分別以Rra和Rbck表示；2)根據(jù)公式(I)計算協(xié)同系數(shù):協(xié)同系數(shù)(S)= (RBt - Rbck)/(RTt - Rtck)公式(I)若S彡1.5,表不生防真菌和化學(xué)藥劑具有增效作用，若I < S < 1.5,表不生防真菌和化學(xué)藥劑具有相加作用，若S < I，表示生防真菌和化學(xué)藥劑具有拮抗作用。前述方法中所述生防真菌為真菌生物農(nóng)藥，所述化學(xué)藥劑為農(nóng)用殺菌劑等。前述方法中所述靶標(biāo)病原菌為植物病原真菌。前述方法中，接種對象為真菌的菌絲或菌餅。前述方法中所述生防真菌和化學(xué)藥劑對靶標(biāo)病原菌具有抑制作用。本發(fā)明的優(yōu)點在于:本方法能評價出對生防真菌沒有抑制作用以及對生防真菌抑制作用較小的化學(xué)藥劑(殺菌劑)與所述生防真菌的協(xié)同增效作用，能準(zhǔn)確評價并淘汰掉殺菌劑與生防真菌協(xié)同增效不明顯的組合。理論上講，當(dāng)殺菌劑對生防真菌有抑制作用時，隨著濃度的增大，其與生防真菌協(xié)同增效作用越小。本發(fā)明方法獲得的結(jié)果與上述推斷相一致，經(jīng)離體葉片法驗證增效作用并采用Abbott法進(jìn)一 步檢驗其增效作用大小，表明本方法準(zhǔn)確性高。與Gowing法、Abbott法相比,本方法不僅能評價出對生防真菌沒有抑制作用或者抑制作用較小的化學(xué)藥劑與生防真菌的協(xié)同增效作用，還能夠評價出殺菌劑低濃度范圍與生防真菌存在的微弱的協(xié)同增效作用。生防真菌與化學(xué)藥劑可以組合在一起，并且二者共同作用可以促進(jìn)對病菌的抑制；這種促進(jìn)的程度是可以進(jìn)行評價的。本評價方法可以找出生防真菌與化學(xué)藥劑共同應(yīng)用的劑量范圍，對開發(fā)和評價生防真菌與化學(xué)藥劑的共同應(yīng)用有實際意義。


圖1為本發(fā)明實施例1中對照培養(yǎng)組中哈茨木霉菌和番茄灰霉菌的菌落半徑。圖2為本發(fā)明實施例1中對峙培養(yǎng)組中哈茨木霉菌和番茄灰霉菌的菌落半徑。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例1對峙培養(yǎng)測定木霉菌(生防真菌)與啶酰菌胺對灰霉菌(病原菌)的協(xié)同作用I 目的木霉菌屬于真菌，篩選出具備對農(nóng)業(yè)病原菌有抑制作用的菌株經(jīng)過工程化后用于農(nóng)業(yè)病害的防治。這些菌株對同一種殺菌劑的敏感性不同，同一菌株對不同種殺菌劑的敏感性也不同；殺菌劑對真菌的抑制作用是有選擇性的，一種殺菌劑對真菌的抑制作用程度也表現(xiàn)在不同濃度范圍內(nèi)。實踐中對生防木霉菌絕對沒有抑制作用的殺菌劑很少，而是存在一定的范圍內(nèi)，需要一一對應(yīng)測定。建立木霉菌與殺菌劑協(xié)同增效的評價方法時要求必須能準(zhǔn)確評價出木霉菌與各種殺菌劑的協(xié)同增效作用。2材料和藥劑2.1供試菌株生防菌:哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum), T-S-2單抱菌株病原菌:番爺灰霉菌(Botrytis cinerea), B-Z-13-2單孢菌株2.2供試培養(yǎng)基馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)2.3供試藥劑99.6%唳酰菌胺(boscalid)原藥(巴斯夫歐洲公司)原藥0.0lg用ImL有機溶劑(丙酮)溶解后,加水配制成IX 104μ g/mL的母液，4°C保存?zhèn)溆谩?試驗方法分別準(zhǔn)確量取啶酰菌胺母液稀釋成0、0.125,0.25,0.5、1、5 μ g/mL六個不同的梯度濃度，用移液槍吸取藥液2mL加入已滅菌的18mL PDA中，制成含藥PDA平板，在平板上以相同的接種量同時接種經(jīng)活化培養(yǎng)(25°C，2天)的木霉菌和灰霉菌菌餅(兩菌餅相距3cm，菌餅直徑5mm)，進(jìn)行對峙培養(yǎng)(圖2);以單獨接入木霉菌和番茄灰霉菌的平板為藥劑對照；同時設(shè)置對照培養(yǎng)(圖1)，以與對峙培養(yǎng)相同的接種量，分別將木霉菌和灰霉菌接種于不加藥的PDA平板作為空白對照。倒置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。每個濃度處理重復(fù)4次，試驗重復(fù)3次。培養(yǎng)結(jié)束后測量各處理的菌落半徑，取平均值。根據(jù)公式(I)計算協(xié)同系數(shù)(S):S= (Rm - Rbck) / (Rn - Rtck)公式(I)其中，Rm表示對峙培養(yǎng)組中灰霉菌菌落相向半徑Rlt表示對峙培養(yǎng)組中木霉菌菌落相向半徑Rbck表示對照培養(yǎng)組中灰霉菌菌落半徑Rtck表示對照培養(yǎng)組中木霉菌菌落半徑上述協(xié)同系數(shù)計算 公式中，減去對照值是為了消除試驗誤差。gSSl.5，表示生防木霉菌和啶酰菌胺具有增效作用，若I < S < 1.5，表示二者具有相加作用，若S < I，表示二者具有拮抗作用。4 結(jié)果表I對峙培養(yǎng)測定木霉菌與啶酰菌胺對灰霉菌的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種測定生防真菌和化學(xué)藥劑對靶標(biāo)病原菌增效作用的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)以相同的接種量，將生防真菌和靶標(biāo)病原菌同時接種于含有化學(xué)藥劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行對峙培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，測量菌落半徑，生防真菌和靶標(biāo)病原菌的菌落半徑分別以RTt和Rm表示；同時設(shè)置對照培養(yǎng)，以與對峙培養(yǎng)相同的接種量，將生防真菌和靶標(biāo)病原菌分別接種于不含所述化學(xué)藥劑的，且與對峙培養(yǎng)使用的相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時間與對峙培養(yǎng)相同，培養(yǎng)結(jié)束后測量菌落半徑，生防真菌和靶標(biāo)病原菌的菌落半徑分別以Rtck和Rbck表不； 2)根據(jù)公式(I)計算協(xié)同系數(shù) 協(xié)同系數(shù)(S) = (RBt - Rbck)/(RTt - Rtck)公式(I) 若S > 1. 5，表示生防真菌和化學(xué)藥劑具有增效作用，若I < S < I. 5，表示生防真菌和化學(xué)藥劑具有相加作用，若S < I，表示生防真菌和化學(xué)藥劑具有拮抗作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述生防真菌為真菌生物農(nóng)藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)藥劑為殺菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述靶標(biāo)病原菌為植物病原真菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，接種對象為菌絲或菌餅。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述生防真菌和化學(xué)藥劑對靶標(biāo)病原菌具有抑制作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定生防真菌和化學(xué)藥劑對靶標(biāo)病原菌增效作用的方法，將生防真菌和病原菌同時接種于含有化學(xué)藥劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行對峙培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，測量菌落半徑，生防真菌和病原菌的菌落半徑分別以RTt和RBt表示；同時設(shè)置對照培養(yǎng)，將生防真菌和靶標(biāo)病原菌分別接種于不含所述化學(xué)藥劑的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時間與對峙培養(yǎng)相同，培養(yǎng)結(jié)束后測量菌落半徑，生防真菌和靶標(biāo)病原菌的菌落半徑分別以RTCK和RBCK表示，根據(jù)(RBt–RBCK)/(RTt–RTCK)計算協(xié)同系數(shù)(S)，若S≥1.5，表示生防真菌和化學(xué)藥劑具有增效作用，若1≤S＜1.5，表示二者具有相加作用，若S＜1，表示二者具有拮抗作用。
文檔編號C12Q1/18GK103255198SQ201310148580
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月25日
發(fā)明者馬志強, 牛芳勝, 畢秋艷 申請人:河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所