專利名稱：一種將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導培養(yǎng)基及方法
技術領域：
本發(fā)明屬于干細胞誘導分化技術領域，具體涉及一種誘導分化培養(yǎng)基及方法。
背景技術：
神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性病變?nèi)缗两鹕喜?、阿爾茨海默病、亨廷頓氏病等，一直是困擾人類健康的難題，而細胞移植是治愈此類疾病的希望。目前用于移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要是胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞，但由于供體來源難，倫理學異議、免疫排斥反應以及移植細胞存活困難等問題，發(fā)展空間有限。脂肪間充質(zhì)干細胞來源廣泛、取材容易，便于自體移植，具有強大的增殖能力，在體外長期培養(yǎng)過程中可以始終保持其多向分化潛能，在特定條件誘導下可以分化為成骨、軟骨、肌腱、肌細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞和肝細胞等，是一種理想的組織工程種子細胞。干細胞的分化是部分基因選擇性地被激活或差異性表達，從而控制細胞表型和蛋白質(zhì)的特異性分布。間充質(zhì)干細胞分化為特定細胞類型主要取決于基因的激活，而細胞外微環(huán)境中各種因子類型和濃度則是基因激活的重要因素。間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞的誘導分化至少具有兩方面的意義:一方面，揭示細胞的基因機制具有可塑性，外環(huán)境的變化能夠激發(fā)出細胞的多能性，從而超越起源胚層的固有限制，分化為攜帶本胚層/其它胚層標志物的細胞。另一方面，作為產(chǎn)生移植用神經(jīng)細胞的新途徑，為臨床移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供機會。目前文獻報道的運用間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為神經(jīng)細胞的研究報道非常多，主要有:(1)傳統(tǒng)的化學誘導劑(抗氧化劑)法如:β-ΜΕ(β-巰基乙醇)、DMS0( 二甲基亞砜)、BHA (丁基羥基茴香醚)聯(lián)合誘導等；(2)生長因子誘導法如:神經(jīng)生長因子NGF，表皮生長因子EGF，堿性成纖維細胞 生長因子bFGF、維甲酸(RA)單獨或者聯(lián)合誘導等；(3)生長因子與化學誘導劑聯(lián)合；(4)共培養(yǎng)或用接近生理狀態(tài)的條件培養(yǎng)基；(5)基因轉(zhuǎn)染；(6)中藥丹參、黃芩苷等。表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor, bFGF)在胚腦和成年腦組織中均有分泌,是促細胞生長作用很強的多肽因子，又是重要的致有絲分裂原，主要通過細胞表面相應的受體促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)細胞增殖和分化。bFGF在體內(nèi)作用廣泛，在神經(jīng)系統(tǒng)能維持神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的存活，誘導神經(jīng)元合成神經(jīng)特異性基因產(chǎn)物等，并能促進交感和副交感神經(jīng)元的軸突生長，具有絲裂原樣作用。EGF在神經(jīng)系統(tǒng)可促進神經(jīng)元軸突的延長和維持神經(jīng)元的存活。EGF和bFGF作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要生長因子，在神經(jīng)系統(tǒng)形成過程中發(fā)揮重要作用，但兩者對神經(jīng)干細胞增殖、分化的作用不同。在胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化的過程中，bFGF可促進神經(jīng)外胚層向神經(jīng)前體細胞轉(zhuǎn)化；用定量PCR檢測，bFGF能夠促進未分化狀態(tài)細胞的一些神經(jīng)外胚層相關基因的表達。研究表明，不同濃度bFGF可使皮層神經(jīng)前體細胞增殖或分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞，而EGF則對發(fā)育較晚期的神經(jīng)前體細胞有促進增殖和分化作。
中藥香丹注射液已被證明對心腦疾病確有臨床療效，且在臨床廣泛應用，具有抗氧化、抗缺血、改善微循環(huán)等功效。香丹注射液由丹參和降香組成，其濃度均為12g/100ml,其中主要含有丹參的水溶性成分丹參素。以蔡梅等對香丹注射液中丹參素的檢測量為標準，推算出丹參素實際在注射液中的濃度約為Iyg/μ I ;實驗時，直接將香丹注射液加入培養(yǎng)基，使其體積百分比濃度為2 4%,則丹參素的濃度為2 4μ g/μ I。因為丹參素為超氧負離子的清除劑，具有抗氧化作用，且已證實其具有誘導MSCs向神經(jīng)細胞分化的功倉泛。
腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor, BDNF)是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，對神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育起重要作用，并能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應，而且也是成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元維持生存及正常生理功能所必需。
GMl是最重要的神經(jīng)節(jié)苷脂之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的治療中起重要作用。GMl除具有上述神經(jīng)節(jié)苷脂的共同作用外，還可以通過維持中樞神經(jīng)細胞膜上的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，起到維持細胞內(nèi)外離子平衡、減輕神經(jīng)細胞水腫、防止細胞內(nèi)Ca2+積聚的作用；GM1可以對抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用，減少自由基對神經(jīng)細胞的損害等。因此，GMl具有促進神經(jīng)重構(gòu)(神經(jīng)重塑，神經(jīng)可塑性)的作用，即通過促進各種形態(tài)、生化、組化、神經(jīng)生理及行為參數(shù)的改善，最終可以加速神經(jīng)修復，最大程度地恢復原有的神經(jīng)功能。GMl能促進多種原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)功能的恢復，促進神經(jīng)重構(gòu)。
傳統(tǒng)的化學誘導劑法雖然可以高效、快速地將脂肪間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞，但細胞死亡率較高(化學誘導劑具有一定毒性，BHA、DMS0等可使細胞突變，用于細胞移植存在致瘤性的危險)；生長因子誘導方法雖然誘導后細胞存活率高，但誘導時間長、誘導效率低?；蜣D(zhuǎn)染誘導因為基因改變存在罹患癌癥的潛在風險。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的誘導劑及誘導方法存在的缺陷，提供一種安全無毒、誘導效率高，誘導時間短的將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導分化完全培養(yǎng)基。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是:一種將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導培養(yǎng)基，由A液、B液、C液組成，采用如下方法配制而成:
A液:8 12ug bFGF溶于500ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，過濾除菌，即得A液，其中bFGF濃度16 24ng/ml ；
B液:10ml 20ml香丹注射液加入到490 480ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，混合后總體積為500ml，即得B液，其中香丹注射液體積終濃度為2% 4% ；
C 液:4 8ugbFGF、4 8ugEGF、40 60ugBDNF、80 120ug GMl 溶于 500ml 人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，即得C液，其中bFGF終濃度8 16ng/ml，EGF終濃度8 16ng/ml, BDNF 終濃度 80 120ng/ml，GMl 終濃度 160 240ng/ml。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的方法，采用本發(fā)明提供的誘導培養(yǎng)基，具體包括以下步驟:1、制備脂肪間充質(zhì)干細胞；2、脂肪間充質(zhì)干細胞的鑒定:取P3代脂肪間充質(zhì)干細胞，流式細胞儀檢測細胞表面標記；3、誘導脂肪間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞:先用A液預誘導24h，然后B液誘導6h，PBS洗滌，最后C液誘導分化5d ;4、誘導后神經(jīng)細胞鑒定:形態(tài)學觀察法；免疫細胞化學法檢測誘導后NeuN、β -TubulinIII, GFAP的表達情況，NeuN、β -TubulinIII表達陽性者為神經(jīng)細胞，GFAP表達陽性為神經(jīng)膠質(zhì)細胞；免疫熒光染色法檢測誘導后細胞β-TubulinIII的表達情況，β -TubulinIII表達陽性為神經(jīng)細胞。本發(fā)明的將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導培養(yǎng)基，采用香丹注射液(有效成分丹參素)聯(lián)合生長因子EGF、bFGF、BDNF、GMl誘導人脂肪間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞，所選用的誘導成分均無毒，誘導效率高，誘導時間短，誘導后細胞移植后無排斥，無倫理問題，安全性高。采用本發(fā)明提供的方法誘導脂肪間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞，誘導成功率高。


圖1是人脂肪間充質(zhì)干細胞形態(tài)圖(X200)；圖2是采用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導后出現(xiàn)的神經(jīng)細胞形態(tài)圖(X200)；圖3是采用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導后NeuN陽性表達細胞免疫細胞化學染色結(jié)果圖(X400)；圖4是采用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導后β -TubulinIII陽性表達細胞免疫細胞化學染色結(jié)果圖(Χ400)；圖5采用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導后GFAP陽性表達細胞免疫細胞化學染色結(jié)果圖(Χ400)；圖6是采用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導后β-TubulinIII陽性表達免疫熒光染色結(jié)果圖(Χ200);圖中:a示β-TubulinIII陽性細胞，呈紅色熒光;b *Hoechst33258復染的胞核，呈藍色熒光；c為a與b的合成。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的一種將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導培養(yǎng)基及方法作詳細說明。實施例1本實施例的一種將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導培養(yǎng)基，由A液、B液、C液組成，采用如下方法配制而成:A液:10ug bFGF(喊性成纖維細胞生長因子，peprotech,96-100-18B-50)溶于500ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基(L0NZA，貨號00190632)中，過濾除菌，即得A液，其中bFGF 濃度 20ng/ml ；B液:10ml香丹注射液(有效成分丹參素，江蘇常熟雷允上制藥有限公司)加入到490ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，即得B液，其中香丹注射液體積終濃度為2% ；C 液:5ug bFGF、5ug EGF(表皮生長因子，p印rotech，96-AF-100-15_500)、50ugBDNF(腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，P印rotech，貨號450-02)、100ug GMl (神經(jīng)節(jié)苷脂，Sigma,G7641-1MG)溶于500ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，即得C液，其中bFGF終濃度IOng/ml, EGF 終濃度 10ng/ml，BDNF 終濃度 100ng/ml，GMl 終濃度 200ng/ml。
實施例2采用本發(fā)明的誘導培養(yǎng)基將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導分化成神經(jīng)細胞的方法，步驟如下:
一、人脂肪間充質(zhì)干細胞制備:
1、接收脂肪組織，用75%的酒精擦拭裝脂肪組織的容器外壁；
2、分裝脂肪組織，每一個T175培養(yǎng)瓶分裝脂肪組織為50ml。IOml移液管，去吸頭，于脂肪采集瓶先吸取下層紅色液體棄掉，剩余上層脂肪混勻后進行分裝。
3、洗滌脂肪組織，除去血細胞。向T175培養(yǎng)瓶中加入IOOml氯化鈉注射液，擰緊蓋子，劇烈晃動3分鐘以充分洗滌脂肪組織，接著靜止3 5分鐘，使不同相分離，吸去下層水相；重復以上操作三次，直到下層液較為清澈。
4、膠原酶I消化:加入等量新配制的預熱(提前半小時于37°C的氣浴搖床預熱)的膠原酶I溶液(0.1%膠原酶I配制方法:稱取0.1g膠原酶I粉末溶解于IOOml未加任何因子的培養(yǎng)基中，用之前37°C預熱)，封口膜封口，劇烈晃動培養(yǎng)瓶5 10秒，置于振動氣浴鍋中，37°C，70rpm，消化60分鐘，每隔15分鐘劇烈晃動培養(yǎng)瓶5 10秒，直到看起來較為平滑。
5、分離基質(zhì)血管組分(SVF):將消化后的組織用無菌40目濾網(wǎng)分裝到50ml的心管中，室溫400g離心10分鐘，得到的沉淀即為SVF。
6、凈化沉淀:離心后，SVF沉積于離心管底部，用移液管自上而下小心除去上層油脂和下層的膠原酶溶液。注意:在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免擾動沉淀細胞。適量生理鹽水重懸細胞，吹散，室溫400g，10分鐘離心。離心完畢，小心吸去上清液，不能直接倒掉。吸取時移液管頭應該置于離心管的上部以便于徹底的出去油。10ml培養(yǎng)基懸浮細胞，然后將細胞匯總到50ml離心管中，過100目篩，再次室溫300g，10分鐘離心。
7、細胞種植:離心后加20ml培養(yǎng)基充分混勻。基于組織塊法:根據(jù)培養(yǎng)瓶的面積進行細胞種植。按照每平方厘米接種0.16ml抽脂得到的脂肪量進行接種，即每個T75培養(yǎng)瓶中接種12ml抽脂脂肪量。即每100ml脂肪組織，最終可以接種8個T75培養(yǎng)瓶。進行未處理脂肪量和最終得到的細胞懸液換算，進而接種細胞。
8、原代細胞培養(yǎng):平置培養(yǎng)瓶,將培養(yǎng)瓶放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱。培養(yǎng)條件:37±0.5°C，二氧化碳體積分數(shù)為5±0.2%。培養(yǎng)基:人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基(L0NZA,00190632)。
9、換液:原代培養(yǎng)第24h,進行全量換液。此后每隔3天全量換液,放置二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。
10、原代細胞收獲:7d左右，原代培養(yǎng)的細胞克隆團的面積百分比到達70% 80%時，消化收獲。
在培養(yǎng)瓶中加入消化酶(消化酶為0.125% Trypsin-EDTA溶液，使用前室溫(20 25°C )放置15 25min，每75cm2加入2ml消化酶溶液)，消化時間為5 8min，加入培養(yǎng)基2 3ml反復吹打瓶底至細胞大部分脫落，移入50ml離心管中，原培養(yǎng)瓶中加入4 5ml氯化鈉注射液沖洗瓶壁,加入離心管中定容至50ml,移液管吹打懸浮后，100um無菌濾網(wǎng)過濾,過濾液收集到50ml離心管中，l000rpm，10min離心洗滌。
11、原代細胞傳代:觀察單個離心管內(nèi)余下細胞沉淀量，適當合并數(shù)個離心管中細胞沉淀至I個離心管中，加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸浮細胞，定容至30ml，吹打混勻，取樣計數(shù)。計數(shù)后IOOOrpm, IOmin 二次離心。去除上清液,在離心管中加入培養(yǎng)基適量,輕輕吹打重懸浮細胞，定容后接種至新的培養(yǎng)容器中，傳代細胞密度為5000 6000個/cm2，即(3.75 4.5) X IO5個cells/T75，按照4.5 X IO5個cells/T75進行傳代。在培養(yǎng)容器上標不細胞代數(shù)與培養(yǎng)時間等信息。將培養(yǎng)容器放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱開始培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱，37 ± 0.5 °C, 二氧化碳體積分數(shù)為5±0.2%。培養(yǎng)至細胞融合達85% 90%。二、脂肪間充質(zhì)干細胞的鑒定1、取P3代脂肪間充質(zhì)干細胞，流式檢測細胞表面標記，結(jié)果見表1:表I流式細胞儀檢測P3代脂肪間充質(zhì)干細胞表面標記物
權(quán)利要求
1.一種將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導培養(yǎng)基，其特征在于:由A液、B液、C液組成，采用如下方法配制而成: A液:8 12ug bFGF溶于500ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，過濾除菌，即得A液，其中bFGF濃度16 24ng/ml ； B液:10ml 20ml香丹注射液加入到490 480ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，混合后總體積為500ml，即得B液，其中香丹注射液體積終濃度為2% 4% ； C 液:4 8ug bFGF、4 8ug EGF、40 60ug BDNF、80 120ug GMl 溶于 500ml 人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，即得C液，其中bFGF終濃度8 16ng/ml，EGF終濃度8 16ng/ml, BDNF 終濃度 80 120ng/ml, GMl 終濃度 160 240ng/ml。
2.一種采用權(quán)利要求1所述的誘導培養(yǎng)基將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的方法，其特征在于:包括以下步驟:(I)、制備脂肪間充質(zhì)干細胞；(2)、脂肪間充質(zhì)干細胞的鑒定:取P3代脂肪間充質(zhì)干細胞，流式細胞儀檢測細胞表面標記；(3)、誘導脂肪間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞:先用A液預誘導24h，然后B液誘導6h，PBS洗滌，最后C液誘導分化5d ； (4)、誘導后神經(jīng)細胞鑒定:形態(tài)學觀察法；免疫細胞化學法檢測誘導后NeuN、β -TubulinIII, GFAP的表達情況，NeuN、β -TubulinIII表達陽性者為神經(jīng)細胞，GFAP表達陽性者為神經(jīng)膠質(zhì)細胞；免疫熒光染色法檢測誘導后細胞β-TubulinIII的表達情況，β -TubulinIII表達陽性為神經(jīng)細胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于干細胞誘導分化技術領域，具體涉及一種誘導分化培養(yǎng)基及方法。一種將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導培養(yǎng)基，由A液、B液、C液組成，采用如下方法配制而成A液8～12ug bFGF溶于500ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，過濾除菌，即得A液；B液10～20ml香丹注射液加入到490～480ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，即得B液；C液4～8ugbFGF、4～8ugEGF、40～60ugBDNF、80～120ug GM1溶于500ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中，即得C液。本發(fā)明的將人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基，采用香丹注射液聯(lián)合生長因子EGF、bFGF、BDNF、GM1誘導人脂肪間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞，所選用的誘導成分均無毒，誘導效率高，誘導時間短，誘導的細胞移植后無排斥，無倫理問題，安全性高。
文檔編號C12N5/0775GK103215222SQ20131014765
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者劉海英, 楊升寶, 于麗, 陳云燕, 王清華 申請人:陳云燕