專利名稱：檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，尤其涉及一種高靈敏性的應(yīng)用二重PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法。
背景技術(shù)：
柑橘冬生疫霉褐腐病原菌Phytophthora hibernalis Carne具有寄主范圍廣，為害柑橘生產(chǎn)嚴(yán)重，分布地域廣的特點(diǎn)，且都可以帶病果實(shí)、組織或無(wú)性繁殖材料進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。我國(guó)柑橘種植區(qū)域分布廣泛，近年來(lái)這些病原菌隨著引進(jìn)優(yōu)質(zhì)的種子苗木傳人我國(guó)的幾率越來(lái)越大。一旦該病傳入，將對(duì)我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)造成極大危害。柑橘冬生疫霉褐腐病原菌引起的柑橘冬生疫霉褐腐病害是在澳大利亞西部的柑橘果實(shí)上首次發(fā)現(xiàn)的，隨后在其他國(guó)家和地區(qū)也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。該疫病是侵染柑橘引起的是一種毀滅性病害，侵染初期，果實(shí)表皮出現(xiàn)淺褐色變色，感染部位皮質(zhì)堅(jiān)硬，濕度適合時(shí)長(zhǎng)出白色菌絲體。受害果實(shí)味苦、具腐臭味。中國(guó)的柑橘種植區(qū)域廣泛，地理氣候多樣，有適合病害發(fā)生的地區(qū)，故定殖可能性大。 近距離傳播方式有風(fēng)雨、工具等傳播途徑，遠(yuǎn)距離傳播主要以土壤、果實(shí)、繁殖材料進(jìn)行傳播。該病害一直持續(xù)困擾著意大利、葡萄牙等地的柑橘生產(chǎn)。
柑橘枝瘤病原菌Sphaeropsis tumefaciens Hedges,主要危害墨西哥酸橙、來(lái)檬和大多數(shù)的橘科植物。表現(xiàn)枝瘤和叢枝兩類癥狀,但以枝瘤及枝瘤潰瘍?yōu)橹?。帶病的植物組織可傳病原菌。病原菌可借風(fēng)、雨等近距離傳播，帶病的植物組織如樹(shù)枝、病葉以及繁殖材料是遠(yuǎn)距離傳播病原菌的途徑。許多柑橘栽培種都對(duì)此病敏感，影響極大。2008年5月 22日，歐盟食品安全局發(fā)布由法國(guó)當(dāng)局完成的關(guān)于柑橘有害生物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告就包括了該病原菌的評(píng)估。
目前針對(duì)疫霉屬真菌的系統(tǒng)發(fā)育已有部分研究，針對(duì)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的分子檢測(cè)技術(shù)也有PCR檢測(cè)的報(bào)道。2008年，張海峰等比較分析了冬生疫霉和其它疫霉的ITS序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了 I對(duì)檢測(cè)冬生疫霉的特異引物751F/752R，該對(duì)引物可從冬生疫霉菌中擴(kuò)增到一條長(zhǎng)616 bp的DNA條帶，而其它19種疫霉和其它真菌均無(wú)擴(kuò)增條帶。其檢測(cè)限度可達(dá)到每25 UL反應(yīng)體系只需10 fg基因組DNA的水平，但帶菌柑橘樣品的擴(kuò)增條帶不特別明顯。
針對(duì)柑橘枝瘤病原菌，目前，柑橘枝瘤病原菌的檢測(cè)僅見(jiàn)到有使用通用引物ITS4 和ITS5進(jìn)行PCR檢測(cè)的報(bào)道。從NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，也只有區(qū)區(qū)2條核糖體序列。因此，PCR引物設(shè)計(jì)成了難題。
由上可見(jiàn)，柑橘枝瘤病原以及柑橘冬生疫霉褐腐病原菌是國(guó)外的柑橘中常見(jiàn)的兩種對(duì)柑橘的危害很大的兩種病菌，因此提供一種更高靈敏性的同時(shí)檢測(cè)上述兩種病菌的檢測(cè)方法，成了本領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容`
本發(fā)明解決了上述背景技術(shù)中的難題，提供了一種基于二重PCR擴(kuò)增檢測(cè)柑橘枝瘤病原以及柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，該方法步驟簡(jiǎn)單、能夠有效果的對(duì)兩種病菌進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為
一種基于二重PCR擴(kuò)增檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于包括以下步驟(I)、取一只無(wú)菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩沖液、dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPT1、反義引物 SPT2、目標(biāo)物DNA以及TaqDNA聚合酶，然后將其混合均勻后離心，將反應(yīng)液離心至管底；
(2)、將離心管置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
(3)、PCR產(chǎn)物用2%-3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠溶液染色12_20min后， 在紫外透射儀上觀察PCR反應(yīng)結(jié)果。
步驟(I)中所述的PCR緩沖液為IO X PCR緩沖液，所加入的去離子水、PCR緩沖液、 dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPT1、反義引物SPT2、目標(biāo)物DNA 以及TaqDNA聚合酶之間的體積比為16 2. 5 1 1 1 1 1 1 :0. 5，其中正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPTl以及反義引物SPT2的濃度均為10 μ M，dNTPs混合物的濃度為2. 5 mM each, TaqDNA聚合酶的濃度為5υ/μ 1，目標(biāo)物DNA的濃度為100-200 ng/μ I。
步驟(2)中擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C3min，94°C 30S，62°C 30S，72°C 30S，循環(huán) 32-36 次，最后72°C補(bǔ)時(shí)5min。
本發(fā)明提供的基于二重PCR擴(kuò)增檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法有以下優(yōu)點(diǎn)(I)、該方法能準(zhǔn)確診斷出柑橘是否攜帶有這兩種檢疫性的病原真菌；(2)該方法采用二重PCR的方法，只需要半天就可以鑒定出柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的種類，可以快速通關(guān)；(3)該方法重復(fù)性好，靈敏度高，目標(biāo)物DNA只需要 IOOng/ μ L就可以鑒定出柑橘攜帶病原真菌的種類。


圖1為實(shí)施例1中的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的說(shuō)明。
本實(shí)施例中菌種柑橘冬生疫霉褐腐病原菌(Phytophthora hibernalis Carne)購(gòu)自美國(guó)ATCC菌種保藏中心，編號(hào)為32995 ，并嚴(yán)格按照檢疫危險(xiǎn)性菌種進(jìn)行操作與使用。 使用前經(jīng)過(guò)DNA的PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序的驗(yàn)證。
本實(shí)施例所用菌種柑橘枝瘤病原菌(Sphaeropsis tumefaciens Hedges)購(gòu)自美國(guó)ATCC菌種保藏中心，編號(hào)為20908 ，并嚴(yán)格按照檢疫危險(xiǎn)性菌種進(jìn)行操作與使用。使用前經(jīng)過(guò)DNA的PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序的驗(yàn)證。
本實(shí)施例中目標(biāo)物DNA的提取方法如下將100 μ I濃度為IO7孢子懸液涂布于鋪有滅菌玻璃紙的PDA和V8平板上，18°C下培養(yǎng)7-10天，刮取 菌絲冷凍備用。取O. 5g菌絲，置于離心管中，加2ml己預(yù)熱(65°C)的CTAB提取緩沖液中，將離心管顛倒混勻，65°C 水浴5min,輕輕混勻;力口入等體積的苯酌·:氯仿:異戍醇(25:24:1),混勻，12000r/min離心15min，取上清液于離心管中，再加入等體積氯仿異戊醇(24:1)混勻，12000r/min離心 15min，取上清液于離心管中，加入2倍體積的100%乙醇顛倒混勻，12000r/min離心lOmin，傾去上清液，用70%乙醇將沉淀洗滌兩次。洗滌結(jié)束后將含有DNA的離心管置于37°C溫箱中干燥。干燥后加30 μ I TE溶解沉淀，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 以下實(shí)施例中正義引物PHIBl的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示 5，-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3’ ；反義引物 PHIB2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 2 所示 5，-CTTCCACAACCAATTCCATTATGC-3。正義引物 SPTl 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示 5' -GAACGCAGCGAAATGCGATAAG- 3';反義引物 SPT2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO :4 所示 5' -ATGCTNAAGTTCAGCGGGTAT- 3' 。
實(shí)施例1
本實(shí)施例中二重PCR反應(yīng)體系的總體積為25μ 1，具體的檢測(cè)方法如下(1)取一只無(wú)菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩沖液、濃度為2. 5mM each的 dNTPs混合物、濃度為1(^11的正義引物？!1181、濃度為10 μ M的反義引物PHIB2、濃度為 10 μ M的正義引物SPT1、濃度為10 μ M的反義引物SPT2、濃度為lOOng/μ I的目標(biāo)物DNA以及濃度為5υ/μ I的TaqDNA聚合酶，各物質(zhì)的體積分別為:16 μ 1、2· 5 μ 1、1 μ 1、1 μ 1、1 μ1、 1μ1、1μ1、1μ1、0. 5μ1。然后將其混合均勻后離心,將反應(yīng)液離心至管底。
(2)、將離心管置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C下3min，94°C下30S， 62°C下30S，72°C下30S，循環(huán)36次，最后72°C下補(bǔ)時(shí)5min，擴(kuò)增后得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
(3)、PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠溶液染色20min后，在紫外透射儀上觀察PCR反應(yīng)結(jié)果。
結(jié)果顯示應(yīng)用引物對(duì)PHIB1/PHIB2與SPT1/SPT2進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增，同時(shí)檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌，在瓊脂糖凝膠上可以觀察到僅有泳道5上有2 條清晰的特異性的DNA片段(307bp和407 bp)，如圖1所示，圖1中泳道M，DL2000;泳道 1，冬生疫霉菌+水；泳道2，枝瘤病原菌+水；泳道3，冬生疫霉菌+PHIB，泳道4，枝瘤病原菌+SPT ;泳道5，冬生疫霉菌+枝瘤病原菌+PHIB +SPT ;泳道6，冬生疫霉菌+SPT ;泳道7， 枝瘤病原菌+ PHIB0
實(shí)施例2
本實(shí)施例中二重PCR反應(yīng)體系的總體積為25μ 1，具體的檢測(cè)方法如下(1)取一只無(wú)菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩沖液、濃度為2. 5mM each的 dNTPs混合物、濃度為1(^11的正義引物？!1181、濃度為10 μ M的反義引物PHIB2、濃度為 10 μ M的正義引物SPT1、濃度為10 μ M的反義引物SPT2、濃度為200ng/μ I的目標(biāo)物DNA以及濃度為5υ/μ I的TaqDNA聚合酶，各物質(zhì)的體積分別為14 μ 1、2. 5 μ1、I μ1、I μ1、I μ1、 I μ IU μ 1>1 μ1、0. 5μ1。然后將其混合均勻后離心,將反應(yīng)液離心至管底。
(2)、將離心管置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C下3min，94°C下30S， 62°C下30S，72°C下30S，循環(huán)33次，最后72°C下補(bǔ)時(shí)5min，擴(kuò)增 后得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
(3)、PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠溶液染色13min后，在紫外透射儀上觀察PCR反應(yīng)結(jié)果。
結(jié)果顯示應(yīng)用引物對(duì)PHIB1/PHIB2與SPT1/SPT2進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增，同時(shí)檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌，在瓊脂糖凝膠上可以觀察到有2條清晰的特異性的 DNA 片段(307bp 和 407 bp)。
氨基酸序列表<ιιο>:中華人民:ft.和W湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局<120>；檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法<!60> 4<210> I <211> 22 <212> DNA <213>:人工序列 <400>:1tcgggtctga gctagtagtc tt72<210> 2 <21 > 24<212> DNA <213>人Τ:序列 <400> 2cttccacaac caartccatt atgc<210>3 <211>22<212>；DNA <213>:人工序列<400>3gaacgcagcg aaatgcgata ag22
<210> 4 <211> 21 <212> DNA<213>:人工序列 <400> 4atgctnaagt tcagcgggta t2權(quán)利要求
1.一種基于二重PCR擴(kuò)增檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、取一只無(wú)菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩沖液、dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPT1、反義引物SPT2、目標(biāo)物DNA以及TaqDNA聚合酶，然后將其混合均勻后離心，將反應(yīng)液離心至管底； (2)、將離心管置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物； (3)、PCR產(chǎn)物用2%-3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠溶液染色12-20min后，在紫外透射儀上觀察PCR反應(yīng)結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于二重PCR擴(kuò)增檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于步驟(I)中所述的PCR緩沖液為IOXPCR緩沖液，所加入的去離子水、PCR緩沖液、dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPT1、反義引物SPT2、目標(biāo)物DNA以及TaqDNA聚合酶之間的體積比為16 :2. 5:1 1 1 :1 :1 :1 :0. 5，其中正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPTl以及反義引物SPT2的濃度均為10 μ M，dNTPs混合物的濃度為2. 5 mM each, TaqDNA聚合酶的濃度為5U/ μ 1，目標(biāo)物DNA的濃度為 100-200 ng/μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于二重PCR擴(kuò)增檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于步驟(2)中擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C 3min，94°C 30S，62°C 30S，72°C 30S，循環(huán) 32-36 次，最后 72°C補(bǔ)時(shí) 5min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于二重PCR擴(kuò)增檢測(cè)柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，包括以下步驟首先取一只無(wú)菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩沖液、dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPT1、反義引物SPT2、目標(biāo)物DNA以及TaqDNA聚合酶，然后將其混合均勻后離心，將反應(yīng)液離心至管底；將離心管置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；將PCR產(chǎn)物用2%-3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠溶液染色12-20min后，在紫外透射儀上觀察PCR反應(yīng)結(jié)果。本發(fā)明提供的方法步驟簡(jiǎn)單、能夠有效果的對(duì)兩種病菌進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK103031383SQ20121058342
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者王振華, 張建坤, 徐家文, 馮漢利 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局