本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及出芽短梗霉alb1基因敲除突變株及其應用。
背景技術：
：出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)是一類類酵母真菌，具有酵母狀和真菌菌絲體兩種形態(tài)，因其產(chǎn)生大量黑色素，又被稱為黑酵母。出芽短梗霉發(fā)酵能產(chǎn)生胞外多糖、酶、抗菌素、單細胞蛋白等多種產(chǎn)物，尤其是所產(chǎn)生的普魯蘭多糖具有極佳的成膜性、阻氧性、可塑性、穩(wěn)定性、粘結性和易自然降解等許多獨特的理學和生物學特性，無毒無害，對人體無任何副作用，可廣泛地應用于醫(yī)藥、食品、化妝品、煙草、采油等眾多領域，是一種有極大開發(fā)價值和前景的多功能新型生物制品。由于出芽短梗霉發(fā)酵過程中合成大量黑色素，一半以上的黑色素會分泌到發(fā)酵液中，與胞外多糖緊密結合，給多糖的純化和精制帶來極大困難，不但降低多糖收率，而且嚴重影響產(chǎn)品品質。因此，獲得不產(chǎn)黑色素的出芽短梗霉菌株是普魯蘭多糖工業(yè)化生產(chǎn)的必然需求。構建出芽短梗霉無色素菌株的方法有物理誘變、化學誘變、基因工程構建等。誘變的方法具有簡單、快捷、高效的特點，但誘變是一個隨機的過程，缺乏方向性，而且誘變菌株傳代穩(wěn)定性差，在發(fā)酵過程中極易產(chǎn)生回復突變?；蚬こ虡嫿ň昃哂锌刹倏氐姆较蛐裕一蚯贸@得的菌株性狀非常穩(wěn)定，基本不會發(fā)生回復突變，在工業(yè)微生物改造中得到了大量應用。目前，國內外研究機構普遍采取誘變的方法進行菌株構建，但基因工程構建出芽短梗霉無色素菌株尚未見報道。出芽短梗霉黑色素屬于二羥萘(DHN)黑色素，但出芽短梗霉黑色素體內合成途徑及相關基因尚未有報道。因此，如何通過基因工程的方法構建出芽短梗霉無色素菌株是目前的技術難點所在。出芽短梗霉無色素菌株的構建研究對于出芽短梗霉的工業(yè)化應用具有重要的意義。技術實現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明的一個目的是提供一株出芽短梗霉alb1基因敲除突變株。本發(fā)明提供的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株，是將出芽短梗霉菌株中的alb1基因的全部或部分編碼基因敲除，替換為潮霉素B抗性基因盒。優(yōu)選的，是將alb1基因從第1位至1911位之間的編碼基因敲除，替換為潮霉素B抗性基因盒。優(yōu)選的，所述出芽短梗霉菌株為菌株As3.3984，購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號為3.3984。上述As3.3984菌株中的alb1基因的全部編碼基因序列如序列表中SEQIDNO.1所示。所述潮霉素B抗性基因盒包含：出芽短梗霉轉錄延長因子啟動子PTEF和潮霉素B抗性基因HygR。所述出芽短梗霉轉錄延長因子啟動子PTEF的序列如序列表中SEQIDNO.2所示；所述潮霉素B抗性基因序列hygR序列如序列表中SEQIDNO.3所示。所述潮霉素B抗性基因HygR來源于大腸桿菌，將啟動子替換為出芽短梗酶來源的高效啟動子PTEF，目的是使該基因能在出芽短梗酶中正常表達。本發(fā)明的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株，命名為出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)Mut，已于2016年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，菌種保藏號為CGMCCNO.12509。為方便說明，在本發(fā)明的后續(xù)表述中將“出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)Mut”記為“As3.3984Δalb1”。本發(fā)明的另一目的是提供一種構建上述出芽短梗霉alb1基因敲除突變株的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：(1)合成含alb1左同源臂-潮霉素B抗性基因盒-alb1右同源臂的重組片段，重組片段的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；(2)將步驟(1)的重組片段連接到pUC18質粒上的EcoRI位點，得到alb1基因敲除質粒；(3)將alb1基因敲除質粒轉化到出芽短梗霉感受態(tài)細胞中，通過潮霉素B抗性篩選得到抗性菌株；對抗性菌株進行鑒定，篩選得到敲除alb1基因的突變株。步驟(1)中，所述重組片段采用全基因合成的方法進行合成。步驟(3)中，利用電轉化的方法將alb1基因敲除質粒轉化到出芽短梗霉感受態(tài)細胞中。步驟(3)中，敲除alb1基因的突變株的篩選方法為：根據(jù)SEQIDNO.4序列合成可以擴增潮霉素B抗性基因的引物hyg-1和hyg-2，如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；根據(jù)出芽短梗霉As3.3984基因組中alb1左同源臂左側序列設計引物out-1，如SEQIDNO.7所示，根據(jù)alb1右同源臂右側序列的反向互補序列設計引物out-2，如SEQIDNO.8所示。用hyg-1/hyg-2和out1-1/out-2兩對引物通過PCR的方法對抗性菌株進行鑒定。上述出芽短梗霉alb1基因敲除突變株在制備微生物多糖中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的第三個目的是提供一種制備微生物多糖的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：在多糖發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)上述的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株，發(fā)酵液離心，收集上清液，向上清液中加入工業(yè)乙醇沉淀多糖，離心，收集沉淀，干燥，純化，即得微生物多糖。所述多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：蔗糖100.0g/L，酵母膏2.0g/L，NaCl1.0g/L，MgSO4.7H2O0.2g/L，K2HPO45.0g/L，(NH4)2SO40.6g/L，pH6.5，115℃滅菌30分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：28℃震蕩培養(yǎng)72小時。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明首次利用基因敲除技術對出芽短梗霉的alb1基因編碼區(qū)進行了部分敲除，經(jīng)基因敲除后，細胞不能合成黑色素。傳統(tǒng)的出芽短梗霉發(fā)酵過程中黑色素會分泌到發(fā)酵液中并與胞外多糖緊密結合，給多糖的純化和精制帶來困難，采用本發(fā)明的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株進行多糖的生產(chǎn)，發(fā)酵過程中無黑色素的產(chǎn)生，能明顯提高多糖的純化收率和產(chǎn)品品質。經(jīng)試驗證明，采用本發(fā)明的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株進行多糖的生產(chǎn)，與原始菌相比，多糖的純化收率和純化后多糖產(chǎn)量能分別提高18.0％和21.4％以上。(2)本發(fā)明構建的出芽短梗霉alb1基因敲除突變株，為出芽短梗霉的工業(yè)化應用打下了良好的基礎。附圖說明圖1：本發(fā)明所述出芽短梗霉alb1基因敲除突變株PCR鑒定電泳圖；其中，M.DNAladder；1.以As3.3984基因組為模板，以hyg-1/hyg-2為引物對的PCR產(chǎn)物；2.以As3.3984Δalb1基因組為模板，以hyg-1/hyg-2為引物對的PCR產(chǎn)物；3.以As3.3984基因組為模板，以out-1/out-2為引物對的PCR產(chǎn)物；4.以As3.3984Δalb1基因組為模板，以out-1/out-2為引物對的PCR產(chǎn)物；圖2：本發(fā)明所述出芽短梗霉原始菌As3.3984和突變株As3.3984Δalb1發(fā)酵液及發(fā)酵生產(chǎn)的微生物多糖。圖中：A.As3.3984發(fā)酵液；B.As3.3984Δalb1發(fā)酵液；C.As3.3984發(fā)酵生產(chǎn)的多糖；D.As3.3984Δalb1發(fā)酵生產(chǎn)的多糖。具體實施方式下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術中已有的常規(guī)實驗方法，檢測方法。實施例1：出芽短梗霉alb1基因敲除突變株的構建(1)基因敲除片段合成采用全基因合成方法合成含alb1左同源臂-潮霉素B抗性基因盒-alb1右同源臂的重組片段，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，該重組片段連接到pUC18質粒上的EcoRI位點，構建得到alb1基因敲除質粒。上述重組片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(2)出芽短梗霉As3.3984電轉化感受態(tài)制備挑取As3.3984(購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號為3.3984)單菌落接種至3mLYPD液體培養(yǎng)基，28℃震蕩培養(yǎng)48小時；轉接100μL培養(yǎng)物至50mLYPD液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至OD600為1.0～1.2左右；4℃離心收集菌體，用1mol/L山梨醇溶液細菌2次，最后用3mL1mol/L山梨醇重懸菌體，分裝100μL/管，保存于-80℃?zhèn)溆?。上述YPD培養(yǎng)液成分：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，115℃滅菌30分鐘。其中葡萄糖單獨配制滅菌，115℃滅菌30分鐘，取出后與其他成分混合。(3)alb1基因敲除質粒電轉化取上述步驟(1)中的alb1基因敲除質粒0.1～1μg與上述步驟(2)中制備的As3.3984感受態(tài)細胞100μL混合，加入電轉杯后冰浴10分鐘，在1.0～2.5kV電壓、3～5ms脈沖時間條件下電擊1～10次。加入1mL含1mol/L山梨醇的YPD液體培養(yǎng)基，28℃，100rpm震蕩培養(yǎng)3～4小時后涂布于含有400μg/mL潮霉素B的YPD平板上。28℃培養(yǎng)72小時，挑取單菌落進行鑒定。(4)突變株篩選和驗證根據(jù)SEQIDNO.4序列設計可以擴增潮霉素B抗性基因的引物hyg-1和hyg-2。引物序列如下：hyg-1:5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3’(SEQIDNO.5)；hyg-2:5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3’(SEQIDNO.6)；根據(jù)出芽短梗霉As3.3984基因組中alb1左同源臂左側序列設計引物out-1，根據(jù)alb1右同源臂右側序列的反向互補序列設計引物out-2，引物序列如下：out-1:5’-AAGGTGGTCATCGTAGCCTC-3’(SEQIDNO.7)；out-2:5’-TGGCAGAGATGACACCAGCA-3’(SEQIDNO.8)；用真菌基因組提取試劑盒提取原始菌As3.3984和步驟(3)中得到的潮霉素B抗性菌落的基因組，提取步驟參照OMEGA公司的真菌基因組提取試劑盒說明書。以上述基因組為模板，分別用hyg-1/hyg-2和out-1/out-2兩對引物進行PCR擴增。若突變株發(fā)生同源重組雙交換，潮霉素B抗性基因盒HygR將替換基因組中alb1基因第1位到第1911位的編碼序列。相應的，用hyg-1/hyg-2引物將能夠擴增到1026bp的片段，而原始菌結果為陰性。用out-1/out-2引物將能夠擴增到2450bp的片段，而原始菌得到的片段為2784bp。篩選PCR產(chǎn)物大小與理論值相符的突變株，經(jīng)DNA測序驗證后，將該菌株命名為As3.3984Δalb1，DNA電泳結果如圖1所示。該菌株命名為As3.3984Δalb1，于2016年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，菌種保藏號為CGMCCNO.12509。實施例2：微生物多糖發(fā)酵和純化實驗1.微生物多糖的發(fā)酵和純化：(1)菌株發(fā)酵：分別將出芽短梗霉原始菌As3.3984和實施例1中獲得的出芽短梗霉突變株As3.3984Δalb1接種于多糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)72小時。上述多糖發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蔗糖100.0g/L，酵母膏2.0g/L，NaCl1.0g/L，MgSO4.7H2O0.2g/L，K2HPO45.0g/L，(NH4)2SO40.6g/L，pH6.5，115℃滅菌30分鐘。(2)沉淀粗多糖：發(fā)酵液8000rpm離心10分鐘收集上清液；上清液中加入3倍體積工業(yè)乙醇沉淀多糖，3000rpm離心5分鐘收集沉淀，50℃烘干獲得粗多糖。(3)多糖純化：將粗多糖溶于水，使?jié)舛葹?％～10％，粗多糖溶液中加入0.5％～2％活性炭粉末，混勻，50℃保溫0.5小時；抽濾除掉活性炭顆粒，收集濾液；濾液中加入3倍體積工業(yè)乙醇沉淀多糖，3000rpm離心5分鐘收集沉淀，50℃烘干獲得多糖。2.結果分析：如圖2所示，出芽短梗霉原始菌As3.3984在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量黑色素，發(fā)酵液呈黑色；而突變株As3.3984Δalb1由于敲除了黑色素合成中的關鍵酶基因alb1，在發(fā)酵過程中不產(chǎn)生黑色素，發(fā)酵液呈黃色。對出芽短梗霉原始菌As3.3984和突變株As3.3984Δalb1進行發(fā)酵液顏色、多糖顏色、粗多糖產(chǎn)量、多糖產(chǎn)量、多糖收率等比較，結果見表1。由表1可以看出，突變株和原始菌發(fā)酵液多糖含量相近，但突變株多糖在純化過程中的收率和純化后多糖產(chǎn)量明顯高于原始菌，多糖的收率和產(chǎn)量分別提高了18.0％和21.4％。表1出芽短梗霉原始菌和突變株在多糖生產(chǎn)中的比較菌株原始菌As3.3984突變株As3.3984Δalb1發(fā)酵液顏色黑色黃色多糖顏色棕黑色白色發(fā)酵液多糖含量(g/L)32.0431.56多糖產(chǎn)量(g/L)24.8030.11收率(％)77.495.4以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術的技術人員在本發(fā)明批露的技術范圍內，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>山東省藥學科學院;山東福瑞達醫(yī)藥集團公司<120>出芽短梗霉alb1基因敲除突變株及其應用<130>2016<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>6489<212>DNA<213>AureobasidiumpullulansAs3.3984<400>1atgtctaacgttcttcttttcggcgaccagaccgccgagcagtaccctctgctccgcaag60gtggtcctgagaactaagaatgctctcgttctcaacttcctggagcgcaccgtcgtcgct120ctgcgaggagaaattgcccaactctctcgccctcagcgcgatgccattccggatttcatg180accctcaacaacttggtcgatctctactacgagaagggattgaagcttcctcaccttgag240agtgccctggtcactatcgcccagcttggccactacatcggatacttctccgagaagact300aacgagcttcctcctgctgccaacactcgcattcttgctctctgcactggatcactcgcc360gctgccgctgtcgcttccgccagaactcttgatgagctcgtcactcttggtgtcgagacc420gtccgcatcgccttccgcactggtgtccgcgtcaatgaagccagaactgctttgggccag480gacctcatgtccagggagagctggtctactattgtcactggcattaacgagcagtccgcc540aaggaggctctcaacgctttccacgagtctgctggcattcccactaccagccacgcttac600atcagcgctgttagcaccatggccatcactatcagtggtcctcccaccatcactaagcgc660ttcttcgaggagtctgaggctgttcgcaagaacaaccgtgttaagatccccgtttacgct720ccttaccacgccgagcacctctacagcagtgccgatatcgagaccgtcattggcgaggag780tctgctaagctcctccaggcttaccagcctcgttcgttggtccactccggctcatctggc840atgtgccacattgccgagaacaccttcgagctgttcaagttgtccctgaacgacatgctc900agatcccctgttggctggaacaacctcctcgaggagagtgtttcgcagatcaccgccaac960accaacgctcctgctaaggtcttctgcattggtgtcagcaacgtatccaacagcctcgtc1020tcggccatcaaagctggtggccaggcctcggtctccctcgttgaccactctgcctgggag1080tctgccgtcactgatgccagccacggtcgcacccagaacgacaagattgccatcgttggt1140atgtctggtcgtttccccagcgctgccagcaccgaggctctttgggaacttctcgagaag1200ggtctcgatgtccaccgcaagattccctctgaccgtttcgatgccgacgctcactgcgac1260ccctctggcaagggcaagaacaagtcgcacactccttacggttgctttatcgacgagcct1320ggtcttttcgaccctcgcttcttcaacatgtctcctcgtgaggctgcacagactgatcct1380atgggtcgtctggctctcgtcaccgcttacgaggctcttgagcaatctggttacgtcccc1440aaccgtactccctccaccaagcttcaccgcatcggtaccttctacggtcagacctctgac1500gattggcgtgagatcaacgcttccgagaatgttgacacctacttcatcactggtggtgtg1560cgtgctttcgcacctggtcgcatcaactactacttcaagttcagtggtccttcgttctcg1620atcgatactgcttgttcgtcatctttggctgctattcagcttgcctgcacttcgctgtgg1680gccggtgactgcgacactgcctgtgctggtggtctgaacgtccttaccaaccctgacatt1740ttctctggtctttccaagggtcaattcttgtccaagacaggttcttgcaagacttacgac1800aacgctgccgatggttactgccgtggtgatggttgtggtaccgttgtcctcaagagatac1860gaggatgcgcttgccgacaaggacaacatcctcggatgcattcttggcgctgctaccaac1920cactctgctgaggctgtttctattactcaccctcacgctggcgctcaggagttcctttac1980aagaaggtcctcgccaacgctggtgtcgatgcccatgagattagctacgtcgagatgcac2040ggtactggtacccaggctggtgatggtattgagatgacctcagtcaccaacgtcttcgct2100ccccgtcaccgccagcgcaagcctgaggagaagctccaccttggtgccatcaaggccaac2160atcggccacggtgaagccgcttctggtatcaactccctctgcaaggtcttgatgatgatg2220aagaagaacgccattcctgccaacgttggtatcaagggcgagatcaacaagactttcccc2280aaggacttgaaggaccgcaatgtccacattcctcagcagcagatcgacttcccccgcaac2340ggtgctgagaagcgcaagatcttcctcaacaacttctccgctgctggtggtaacaccgcc2400atcctcctcgaggatggtcctcttcgtgaggctcctaaggctgttgaccctagaggcact2460cttcccgtcactgtaactgcccgttcgatcgctgccttgaagaacaacattcagcgtctg2520cagggatacctccgcgagaaccccgagaccactcttcccagcttgtcctacacttcgact2580gcccgccgcatccagcacaactaccgcatcgccttccccattgctgatattgccaaggtc2640agcgatgctctgcaggcccaaactaaggacacctacagcccagtccccatggtttctacc2700aagaccgccttctgcttcaccggacagggctcacagtacactgctcttggtcagaagctc2760taccaagacctcaagtctttccgtgacgacatcaaccagctcgacaacatggccaccatt2820cagggccttccttcgttcattgagctgcttgacggcactgatgtcgctactctttcccct2880gtcaaggttcagctgggtatggcttgtattcaggttgctctcgctcgcatgtgggcttca2940tggggtatcactcctaccgctgtcattggccacaacttgggcgagtacgctgctctccac3000gttgctggtgtcatctctgccagcgacatgatcaccctcgttggtcgtcgtgctgagctc3060cttgtcaaggactgcactcctcacacccacggtatgctcgctgtcaagggtggcgctgaa3120gccatccgtgacgtcctcggctccaagatgaccgagattgcctgcatcaacggtcctgag3180gagactgtactttgcggtagtggcgaggttgttagtgctgccaacgagactctttccgct3240cgcggcttcaaggccaccaagctcaatgttcccttcgccttccactcggcccaggtcgac3300cctatcctcgagtccttcaagaaggttgcttcctgcgtcaccttcaacaagcccgctgtc3360cctgtcctctctcccctttccggagatgtcattcgcgaggctggtgttattggcccagac3420tacctcgctagacacgccagagagactgtcaacttctggaccgctctgaccactggtcag3480aaggagaagatcttcgatgagaagactgcttggctcgaggttggcgctcaccccgtctgc3540tctggcatggtcaaggcttctgtcggtgccaccgtcaccgctcctt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