本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一株塔賓曲霉及其在溶無機(jī)磷方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

磷素是植物生長發(fā)育所必需的三大礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一。磷不僅參與許多重要的生命代謝活動(dòng)，而且還是很多植物器官的組成成分，磷對(duì)作物碳水化合物的運(yùn)輸、合成和分解起著重要的作用?？梢娡寥乐辛自氐呢S缺度對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)影響非常明顯。由于大部分磷與土壤中的Ca²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Al³⁺結(jié)合形成難溶磷酸鹽，導(dǎo)致土壤中95％以上的難溶性磷源不能直接被植物吸收利用。

土壤中存在著大量溶磷微生物，它們能夠?qū)㈦y溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的有效磷，具有這種能力的微生物稱為溶磷微生物(phosphate-solubilizing microorganisms)。溶磷微生物分為溶磷真菌和細(xì)菌，研究顯示，溶磷細(xì)菌的的數(shù)量是溶磷真菌的2-50倍；然而，溶磷細(xì)菌往往在傳代過程中溶磷活性降低或失去活性，溶磷真菌的活性和溶磷能力均高于溶磷細(xì)菌。溶磷真菌類主要包括曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、小菌核菌(Sclerotium)和鐮刀菌(Fusarium)。其中，研究指出，在眾多溶磷微生物中，曲霉屬的溶解活性最高。因此，篩選高效溶磷真菌是開發(fā)微生物菌肥不可或缺的重要環(huán)節(jié)，一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2。

本發(fā)明提供的塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2的保藏編號(hào)為CGMCC No.13185。菌株P(guān)2-2的分類命名為塔賓曲霉Aspergillus tubingensis，該菌株已于2016年11月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2的新用途。

本發(fā)明提供了上述塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2在作為溶磷微生物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑的新用途。

本發(fā)明提供了上述塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在溶磷中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在制備溶磷的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述溶磷為將難溶性無機(jī)磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的有效磷；所述難溶性無機(jī)磷具體為磷酸三鈣、磷酸鋅或羥基磷灰石。

本發(fā)明還提供了上述塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在制備復(fù)合微生物菌肥和/或植物營養(yǎng)液中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述促進(jìn)植物生長體現(xiàn)為增加植物株高和/或濕重。

上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品的活性成分為上述塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑；

所述產(chǎn)品具有如下1)-5)中任一所述的功能：

1)活化難溶性磷源；

2)將難溶性無機(jī)磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的有效磷；

3)促進(jìn)植物生長；

4)制備復(fù)合微生物菌肥；

5)制備植物營養(yǎng)液。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種促進(jìn)植物生長的方法。

本發(fā)明提供的促進(jìn)植物生長的方法包括如下步驟：將植物在含有上述塔賓曲霉Aspergillus tubingensis P2-2的發(fā)酵液中培養(yǎng)。

上述方法中，所述促進(jìn)植物生長體現(xiàn)為增加植物株高和/或濕重。

上述方法中，所述發(fā)酵液為將P2-2菌株的菌懸液接種于難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到的溶液；所述難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基具體為磷酸三鈣難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基、磷酸鋅難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基或羥基磷灰石難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基；所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為25℃，200r/min搖床培養(yǎng)5天。

本發(fā)明從土壤中分離純化出一株高效的溶磷真菌，該溶磷真菌能活化多種難溶性磷源，將分解溶液中的無機(jī)磷轉(zhuǎn)化為能被植物利用的有效磷，可直接應(yīng)用于植物營養(yǎng)液的制備。通過實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明的溶磷真菌不僅具有很強(qiáng)的溶磷特性，而且與一組功能型復(fù)合微生物菌群兼容性好，也可用于復(fù)合微生物菌肥的研發(fā)。

附圖說明

圖1為p2-2在Ca₃(PO₄)₂、Zn₃(PO₄)₂、羥基磷灰石為磷源的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的溶磷圈。圖1a:p2-2；b、c、d分別表示p2-2在Ca₃(PO₄)₂、Zn₃(PO₄)₂、羥基磷灰石為磷源的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的溶磷圈。

圖2為磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3為P2-2菌株與功能菌株間的親和性檢驗(yàn)。

圖4為大豆幼苗在各溶液中的生長情況。

保藏說明

菌種名稱：塔賓曲霉

拉丁名：Aspergillus tubingensis

菌株編號(hào)：P2-2

保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心

保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC

地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)

保藏日期：2016年11月18日

保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCC No.13185

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的培養(yǎng)基：

(1)難溶無機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，磷源5g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl 0.2g，KCl 0.2g，MnSO₄ 0.03g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g，瓊脂20g，酵母膏0.5g，水1L，pH值7.0±0.2，121℃滅菌30分鐘備用。

(2)難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，磷源5g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl 0.2g，KCl 0.2g，MnSO₄ 0.03g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g，酵母膏0.5g，水1L，pH值7.0±0.2，121℃滅菌30分鐘備用。

上述培養(yǎng)中的磷源為難溶磷酸鹽，難溶磷酸鹽為磷酸三鈣(Ca₃(PO₄)₂)、磷酸鋅(Zn₃(PO₄)₂)或羥基磷灰石。其中，磷酸三鈣(Ca₃(PO₄)₂)和羥基磷灰石購于上海百舜生物科技有限公司；磷酸鋅(Zn₃(PO₄)₂)購于北京普益華科技有限公司。

(3)查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基(CYA)：K₂HPO₄ 1g，查氏濃縮液10mL，酵母抽提粉5g，蔗糖30g，瓊脂15g，水1L。查氏濃縮液配方:NaNO₃ 30g，KCl 5g，MgSO₄·7H₂O 5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.1g，ZnSO₄·7H₂O 0.1g，CuSO₄·5H₂O 0.05g，無菌水100mL。

(4)混合培養(yǎng)基：是將PDA(美國BD公司)、LA(美國BD公司)培養(yǎng)基和高氏1號(hào)(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)等體積比混勻得到的培養(yǎng)基。

下述實(shí)施例中的試劑：

鉬銻貯存溶液：量取153ml濃硫酸(分析純，密度1.84g/ml)，緩緩加入到400ml蒸餾水中，不斷攪拌，冷卻。另稱取經(jīng)磨細(xì)的鉬酸銨10g溶于溫度約60℃300ml水中，冷卻。然后將硫酸溶液緩緩倒入鉬酸銨溶液中。再加入0.5％酒石酸銻鉀溶液100ml，冷卻后，加水稀釋至1000ml，搖勻，貯于棕色試劑瓶中，此貯備液含鉬酸銨1％，硫酸2.75mol/L。

鉬銻抗顯色劑：稱取1.50g抗壞血酸溶于100ml鉬銻貯存溶液中，此溶液有效期不長，宜隨配隨用。

5mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液：將0.4394g磷酸二氫鉀溶于100ml水，加5ml濃硫酸防腐，用水定容到1L，得到濃度為100mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，此溶液可以長期保存。吸取10ml濃度為100mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液于200ml容量瓶中，加水至標(biāo)度，得到濃度為5mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，此溶液不宜久存。

下述實(shí)施例中的供試菌株：

淡紫擬青霉YES-2(CGMCC No.2012)、紅灰鏈霉菌HDZ-9-47(CGMCC No.2878)(Sr)和蒼白桿菌NC1(CGMCC No.12154)。

實(shí)施例1、塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株P(guān)2-2的分離及鑒定

一、塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株P(guān)2-2的分離

1、土壤中微生物的初步篩選

將土壤(北京昌平(E116°07.909′；N 40°11.303′)大豆地的土壤)制備得到10^-2-10^-4的懸液，然后將土壤懸液涂布于以Ca₃(PO₄)₂為磷源的含有鏈霉素(100μg/ml)和氯霉素(100μg/ml)的難溶無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)，觀察，分離、純化產(chǎn)生溶磷圈的菌株，并將分離純化獲得的菌株為命名為P2-2，用15％甘油-80℃保存菌株，備用。

二、菌株P(guān)2-2的鑒定

1、菌株P(guān)2-2的形態(tài)學(xué)觀察

將菌株P(guān)2-2在CYA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5天后，菌落直徑為2.8cm；菌落顏色為褐色，反面為淡黃褐色；菌落質(zhì)地有放射狀溝紋；滲出液少量；頂囊為球形，直徑為25-50μm；分生孢子球形，直徑2.8-4.5μm。

2、菌株P(guān)2-2的分子生物學(xué)鑒定

用熱裂解法提取菌株P(guān)2-2的DNA，以獲得的DNA為模板，采用引物Bt2a(GGTAACC AAATCGGTGCTGCTTTC)和Bt2b(ACCCTCAGTGTAGTGACCC TTGGC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即為菌株P(guān)2-2的真菌微管蛋白β-tubulin基因。并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

菌株P(guān)2-2的真菌微管蛋白β-tubulin基因序列如序列1所示，然后利用Blast程序?qū)⑿蛄?所示的β-tubulin序列與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比對(duì)。

綜合上述鑒定結(jié)果，菌株P(guān)2-2的分類命名為塔賓曲霉Aspergillus tubingensis，該菌株已于2016年11月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No.13185。

實(shí)施例2、菌株P(guān)2-2對(duì)Ca₃(PO₄)₂、Zn₃(PO₄)₂、羥基磷灰石為磷源的無機(jī)磷培養(yǎng)基的溶解作用

一、菌株P(guān)2-2對(duì)Ca₃(PO₄)₂、Zn₃(PO₄)₂、羥基磷灰石為磷源的固體無機(jī)磷培養(yǎng)基的溶解作用

將菌株P(guān)2-2制作成菌懸液(菌懸液為將菌株P(guān)2-2的孢子溶于水得到的溶液)，使菌懸液中孢子數(shù)達(dá)到1×10⁶cfu/ml。取200μl菌懸液于6cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入5顆玻璃珠均勻涂板。25℃培養(yǎng)2天后用6mm的打孔器打成菌餅，將菌餅分別接入以Ca₃(PO₄)₂、Zn₃(PO₄)₂、羥基磷灰石為磷源的固體無機(jī)磷平板上，25℃培養(yǎng)5天后照相，并分別測定溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)大小，以此來確定菌株的溶磷能力。

表1、P2-2在不同磷源的無機(jī)磷培養(yǎng)基中產(chǎn)生溶磷圈的大小與菌落的比值

D:溶磷圈的直徑(cm)；d:菌落直徑(cm)

研究表明：菌株P(guān)2-2在不同磷源的無機(jī)磷培養(yǎng)基上產(chǎn)生的溶磷圈明顯(圖1)，且溶磷圈的直徑與菌落的比值均大于1.2(表1)，證明菌株P(guān)2-2對(duì)不同無機(jī)磷的溶解效果均較好，是一種溶磷菌，且菌株P(guān)2-2能溶解Ca₃(PO₄)₂、Zn₃(PO₄)₂、羥基磷灰石等多種磷源的培養(yǎng)基，證明溶磷菌P2-2菌株溶解磷源的范圍廣。

二、菌株P(guān)2-2對(duì)Ca₃(PO₄)₂、Zn₃(PO₄)₂、羥基磷灰石為磷源的液體無機(jī)磷培養(yǎng)基的溶解作用

1、磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取0、2、4、6、8、10mL的濃度為5mg/L的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液至50mL容量瓶中，再分別加入蒸餾水至體積為30mL；然后加入2滴2.4-二硝基酚指示劑，逐滴加入4mol/L的NaOH溶液至容量瓶中液體呈微黃色，再逐滴加入1mol/L的H₂SO₄至黃色剛剛消去，接著加入5mL鉬銻抗顯色劑，并用蒸餾水定容至刻度。在常溫下顯色1小時(shí)，然后與上述樣品的顯色液同在分光光度計(jì)上測定吸光度值，波長設(shè)定為700nm。以磷濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。磷標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

2、鉬銻抗比色法測定發(fā)酵液中有效磷的含量

在500ml三角瓶中裝入50mL已滅菌的難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，難溶磷酸鹽分別為磷酸三鈣(Ca₃(PO₄)₂)、磷酸鋅(Zn₃(PO₄)₂)和羥基磷灰石，難溶磷酸鹽濃度均為5g/L。將1mL P2-2菌懸液分別接種于上述難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，25℃,200r/min搖床培養(yǎng)5d，分別得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液搖勻，取20mL到離心管中，8000r/min，離心10min，收集上清液；吸取5mL上清液到50mL的容量瓶中，加入蒸餾水至體積為30mL，加入2滴2.4-二硝基酚指示劑，再加入1滴1mol/L的H₂SO₄至溶液黃色剛好退去，接著加入5mL的鉬銻抗試劑，定容至刻度，在常溫下顯色1小時(shí)。然后與上述樣品的顯色液同在分光光度計(jì)上測定吸光度值，波長設(shè)定為700nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對(duì)應(yīng)的有效磷含量。同時(shí)以不接菌的溶液為對(duì)照。

結(jié)果如表2所示。菌株P(guān)2-2接種5天后各發(fā)酵液中有效磷含量分別是不接菌溶液的19.97倍、65.58倍和18.11倍。說明由于溶磷菌株P(guān)2-2對(duì)無機(jī)磷底物的溶解，顯著增加了溶液中可溶性磷的含量。

表2、溶磷菌在不同磷源溶液中的溶解情況(mg/L)

實(shí)施例3、菌株P(guān)2-2與功能菌株的親和性檢驗(yàn)

淡紫擬青霉YES-2(YES-2)、紅灰鏈霉菌HDZ-9-47(HDZ-9-47)和蒼白桿菌NC1(NC1)均為具有防治黃瓜根結(jié)線蟲的功能型復(fù)合微生物。

1、將PDA、高氏1號(hào)和LA培養(yǎng)基按照等質(zhì)量比例混勻滅菌后倒入9cm培養(yǎng)皿中，得到混合培養(yǎng)基，待混合培養(yǎng)基凝固后將紅灰鏈霉菌HDZ-9-47(HDZ-9-47)和蒼白桿菌NC1(NC1)菌體以“井”字形劃線方式接種到混合培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2天；然后用打孔器從培養(yǎng)5d的菌株P(guān)2-2和淡紫擬青霉YES-2(YES-2)菌落邊緣打取0.6cm的菌餅，分別接入距紅灰鏈霉菌HDZ-9-47(HDZ-9-47)和蒼白桿菌NC1(NC1)菌體0.5cm的位置，于25℃下倒置培養(yǎng)5d后觀察各菌株間生物兼容性。

各功能菌株在混合培養(yǎng)基上共培養(yǎng)5d后的菌落形態(tài)如圖3所示。菌株P(guān)2-2生長良好，且與各菌株間無拮抗現(xiàn)象，表明菌株P(guān)2-2與功能菌株淡紫擬青霉YES-2(YES-2)、紅灰鏈霉菌HDZ-9-47(HDZ-9-47)和蒼白桿菌NC1(NC1)間具有良好的生物兼容性。說明溶磷菌株P(guān)2-2具有用作功能型微生物菌群研究的潛在價(jià)值。

實(shí)施例4、菌株P(guān)2-2的發(fā)酵液對(duì)大豆幼苗的水培促生實(shí)驗(yàn)

1、幼苗的培育：把無菌紗布放入9cm培養(yǎng)皿中，倒入無菌水使紗布濕透，每皿加入大豆種子50粒，萌發(fā)，注意加水保濕；待幼苗長到5cm左右移栽。

2、難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的制備：在500ml三角瓶中裝入難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，難溶磷酸鹽分別為磷酸三鈣(Ca₃(PO₄)₂)、磷酸鋅(Zn₃(PO₄)₂)和羥基磷灰石，難溶磷酸鹽濃度均為5g/L，分別得到磷酸三鈣難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基、磷酸鋅難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基和羥基磷灰石難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基。

3、菌株P(guān)2-2的發(fā)酵液的制備：將200μL P2-2菌懸液分別接種于磷酸三鈣難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基、磷酸鋅難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基和羥基磷灰石難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，25℃，200r/min搖床培養(yǎng)5d，使菌株P(guān)2-2完全溶解難溶無機(jī)磷為有效磷，分別得到發(fā)酵液，滅活上述發(fā)酵液，并用無菌水稀釋50倍，分別得到菌株P(guān)2-2溶解磷酸三鈣的發(fā)酵液、P2-2溶解磷酸鋅的發(fā)酵液和P2-2溶解羥基磷灰石的發(fā)酵液。裝入容量瓶保存、備用。

4、菌株P(guān)2-2的發(fā)酵液對(duì)大豆幼苗的水培促生作用：將步驟1中的幼苗分別移至裝有菌株P(guān)2-2溶解磷酸三鈣的發(fā)酵液、P2-2溶解磷酸鋅的發(fā)酵液和P2-2溶解羥基磷灰石的發(fā)酵液的50ml離心管中，每管1顆幼苗，3個(gè)重復(fù)。以水(CK，H₂O)和未用菌株P(guān)2-2溶解的難溶無機(jī)磷液體培養(yǎng)基(CKS)為對(duì)照進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)12天后，分別觀察大豆幼苗的長勢，并測定大豆幼苗的株高和濕重。

表3、P2-2菌株發(fā)酵液對(duì)大豆幼苗的水培促生作用(12d)

結(jié)果如圖4和表3所示。結(jié)果表明：菌株P(guān)2-2的發(fā)酵液與CKS相比，在菌株P(guān)2-2溶解磷酸三鈣的發(fā)酵液、P2-2溶解磷酸鋅的發(fā)酵液和P2-2溶解羥基磷灰石的發(fā)酵液中，大豆幼苗株高分別增加39.6％、26.7％、42.7％；濕重分別增加3.9％、3.9％、7.9％(表3)。從而說明，菌株P(guān)2-2能有效分解各種無機(jī)磷為有效磷，并且分解出的有效磷對(duì)植物幼苗具有明顯的促生作用。

序列表

<110>中國科學(xué)院微生物研究所

<120>一株高效溶磷的塔賓曲霉菌株及其應(yīng)用

<160>1

<210>1

<211>490bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ggaacatcat ctctcaagct atcttagctt gagttcagat gttatccatc gggtatatag 60

ctatcgggtt aagaacacgt ctaacaactc aacaggcaga ccatctctgg cgagcacggc 120

cttgacggct ccggtgtgta agtacaactt tttcacacct ctcaattggt caacaatgtg 180

gaaaggattg ggtttcctga cgcgcaggat agttacaatg gcacctccga cctccagctg 240

gagcgcatga acgtctactt caacgaggtt agatcacacc gtccctgagt tttttcacga 300

caatatcatc aatgtcctga ccacttcagc aggctagcgg taacaagtat gtcccccgtg 360

ccgtcctcgt cgatctcgag cccggtacca tggacgccgt ccgtgccggt cccttcggcc 420

agctcttccg ccccgacaac ttcgtcttcg gccagtccgg tgctggtaac aactgggcca 480

agggtcacta 490