本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一株重組黑曲霉表達(dá)菌株。
背景技術(shù)：
：葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase,GOD,E.C1.1.3.4)是一種需氧脫氫酶，該酶分子為二聚體，含有兩個(gè)亞基，分子量約160kDa，每亞基結(jié)合一個(gè)FAD分子。它能利用分子氧作為電子受體，專一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。葡萄糖氧化酶由于具有催化專一性和高效性的優(yōu)點(diǎn)，在食品、化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、飼料等領(lǐng)域有比較廣泛的應(yīng)用。由于葡萄糖氧化酶良好的應(yīng)用效果，目前己經(jīng)在很多行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用，近年來倍受關(guān)注，市場(chǎng)需求量也越來越大。GOD廣泛分布于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，從動(dòng)植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富，細(xì)菌GOD產(chǎn)酶量少。微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)GOD的主要來源。目前市場(chǎng)上大部分商業(yè)產(chǎn)品都是由畢赤酵母和絲狀真菌，如黑曲霉，米曲霉等發(fā)酵生產(chǎn)。絲狀真菌作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)品(如酶)為人們熟知，其中尤以黑曲霉和米曲霉由于“通常認(rèn)為安的”(GenerallyRecognizedAsSafe，GRAS)的特征而被廣泛用于表達(dá)宿主，從而用于生產(chǎn)食品添加劑。GOD在食品工業(yè)中主要作用在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個(gè)方面。目前，許多國(guó)家己將GOD作為公認(rèn)的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食品和食品加工工藝中，例如：用于酒類除氧、蛋白脫糖、食品包裝、果蔬及制品的保鮮。近幾年，GOD作為一種新型的酶飼料添加劑，己被農(nóng)業(yè)部列為12種允許使用的飼料酶制劑添加劑之一開始在畜牧、飼料行業(yè)上應(yīng)用。在飼料中添加葡萄糖氧化酶能夠清除牲畜腸道上皮細(xì)胞大量自由基，保護(hù)腸道上皮細(xì)胞的完整。葡萄糖氧化酶通過不斷的催化葡萄糖生成葡萄糖酸，降低胃腸道的pH值，偏酸性環(huán)境有利于益生菌的生長(zhǎng)增殖，從而抑制了病原微生物的存活，提高了牲畜的自身免疫力。除此之外，由于葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖過程中會(huì)產(chǎn)生過氧化氫，當(dāng)過氧化氫積累到一定濃度時(shí)，可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、弧菌等病原菌的生長(zhǎng)繁殖，并且這種抑菌作用不會(huì)產(chǎn)生菌體抗藥性。隨著葡萄糖氧化酶制備提純工藝的不斷發(fā)展完善，使用成本的不斷降低，葡萄糖氧化酶將在飼料行業(yè)中發(fā)揮越來越重要的作用。由于單酶的作用比較單一，目前飼料工業(yè)大多以復(fù)合酶為主?，F(xiàn)有的復(fù)合酶有以下兩種來源：(1)同一菌種在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種酶，以一種酶活高的酶為主活力，其它酶為副活力；(2)復(fù)合酶的另一種來源為不同菌種發(fā)酵生產(chǎn)的單酶，經(jīng)過復(fù)配后形成復(fù)配酶產(chǎn)品。但該復(fù)合酶由于不是同一菌種生產(chǎn)，存在協(xié)調(diào)性和協(xié)同作用差，相互作用可能會(huì)存在干擾等缺點(diǎn)，因此開發(fā)以單菌種表達(dá)多酶系的菌株具有更加良好的應(yīng)用效果和市場(chǎng)前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一株重組黑曲霉表達(dá)菌株及其應(yīng)用，該重組黑曲霉表達(dá)菌株除了能高效表達(dá)葡萄糖氧化酶外，其表達(dá)產(chǎn)物還包含糖化酶，淀粉酶，蛋白酶等其它副表達(dá)產(chǎn)物。該菌株分類命名為黑曲霉(Aspergillusniger)，于2016年6月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)CGMCCNO.12518。本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建重組黑曲霉表達(dá)菌的方法。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)葡萄糖氧化酶復(fù)合酶的方法。本發(fā)明還提供了一種葡萄糖氧化酶重組表達(dá)載體。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一株重組黑曲霉表達(dá)菌株，該菌株分類命名為黑曲霉(Aspergillusniger)，于2016年6月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCCNO.12518。上述的重組黑曲霉表達(dá)菌株在生產(chǎn)復(fù)合酶及制備動(dòng)物飼料添加劑中的應(yīng)用。一種構(gòu)建重組黑曲霉表達(dá)菌的方法，構(gòu)建包含葡萄糖氧化酶GOD基因序列的重組表達(dá)盒，該重組表達(dá)盒為包含葡萄糖氧化酶GOD基因序列、啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記等元件的基因片段，將該重組表達(dá)盒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞原生質(zhì)體，曲霉轉(zhuǎn)化技術(shù)原理遵循非同源斷裂修復(fù)機(jī)理。該表達(dá)盒包含有選擇標(biāo)記，通過標(biāo)記物篩選獲得重組黑曲霉表達(dá)菌株。所述的葡萄糖氧化酶基因?yàn)榍?、或青霉屬來源葡萄糖氧化酶基因；?yōu)選為黑曲霉來源葡萄糖氧化酶基因；更進(jìn)一步優(yōu)選為具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；所述的宿主細(xì)胞為黑曲霉。為了構(gòu)建葡萄糖氧化酶表達(dá)盒，首先需要選擇必須的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是黑曲霉內(nèi)源啟動(dòng)子，如黑曲霉糖化酶啟動(dòng)子，中性淀粉酶啟動(dòng)子，酸性淀粉酶啟動(dòng)子，α-葡萄糖苷酶啟動(dòng)子等。也可以是外源啟動(dòng)子，如米曲霉中性淀粉酶啟動(dòng)子，米根酶糖化酶啟動(dòng)子。也可以是啟動(dòng)子變體，如黑曲霉中性淀粉酶變體。與啟動(dòng)子3’末端連接的可以是調(diào)控序列，如合適的前導(dǎo)序列，即對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)，如米曲霉中性淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶前導(dǎo)序列。葡萄糖氧化酶基因可以選擇黑曲霉內(nèi)源基因，也可以來自其他種如米曲霉，青霉屬。本發(fā)明優(yōu)選黑曲霉來源葡萄糖氧化酶(GOD)。優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。所述的啟動(dòng)子和終止子可以通過設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物從曲霉基因組獲得，所列舉的啟動(dòng)子和終止子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的序列。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記，其允許簡(jiǎn)單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hyg(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)或米曲霉的amdS和hyg。構(gòu)建重組黑曲霉表達(dá)菌的最優(yōu)選技術(shù)方案的詳細(xì)步驟為：(1)pUC57質(zhì)粒經(jīng)EcoRI-HindIII雙酶切后得到的片段；(2)以SEQIDNO.1為模板，以GOD_F與GOD_R為引物，以SEQIDNO.2為模板，以hyg_F與hyg_R為引物分別通過PCR擴(kuò)出帶有重組臂的GOD基因和hyg基因，然后利用PCR通過GOD_F與hyg_R引物兩端的重疊序列將GOD基因和hyg基因拼成一條直鏈長(zhǎng)片段，再與具有末端互補(bǔ)序列的pUC57EcoRI-HindIII酶切線性回收片段進(jìn)行重組，得到pGODHyg質(zhì)粒；GOD_F：gaagtcagaattcatggtgttttgatcattttaaatttttatatggcgggGOD_R：agaaagagtcaccggtcactgtacatgcattgaatgacagtgatatcagcagahyg_F：gtacagtgaccggtgactctttcthyg_R：ctatgaccatgattacgccaagcttctcgagtggagatgtggagtg(3)將pGODHyg質(zhì)粒HindIII酶切線性化后轉(zhuǎn)化入黑曲霉原生質(zhì)體；黑曲霉原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化過程為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的技術(shù)。(4)進(jìn)行定性篩選及定量篩選得到包含重組黑曲霉表達(dá)菌。所述的黑曲霉為黑曲霉CICC2462。所述定性篩選的過程為：采用Fiedure.K.顯色法，將轉(zhuǎn)化的重組黑由霉菌株點(diǎn)種于平板分離培養(yǎng)基，培養(yǎng)至出現(xiàn)藍(lán)色圈，進(jìn)行藍(lán)色圈大小定性比對(duì)，挑取變色圈較大的菌株接種至平板培養(yǎng)；所述定量篩選的過程為：將黑曲霉轉(zhuǎn)化子搖瓶培養(yǎng)，離心收集上清液，測(cè)定上清液的葡萄糖氧化酶活性。一種生產(chǎn)葡萄糖氧化酶復(fù)合酶的方法，其特征在于：發(fā)酵培養(yǎng)上述的重組黑曲霉表達(dá)菌株使其表達(dá)以葡萄糖氧化酶為主的復(fù)合酶。一種葡萄糖氧化酶重組表達(dá)載體，采用以下方法構(gòu)建：(1)pUC57質(zhì)粒經(jīng)EcoRI-HindIII雙酶切后得到的片段；(2)以SEQIDNO.1為模板，以GOD_F與GOD_R為引物，以SEQIDNO.2為模板，以hyg_F與hyg_R為引物分別通過PCR擴(kuò)出帶有重組臂的GOD基因和hyg基因，然后利用PCR通過GOD_F與hyg_R引物兩端的重疊序列將GOD基因和hyg基因拼成一條直鏈長(zhǎng)片段，再與具有末端互補(bǔ)序列的pUC57EcoRI-HindIII酶切線性回收片段進(jìn)行重組，得到葡萄糖氧化酶重組表達(dá)載體pGODHyg質(zhì)粒；GOD_F：gaagtcagaattcatggtgttttgatcattttaaatttttatatggcgggGOD_R：agaaagagtcaccggtcactgtacatgcattgaatgacagtgatatcagcagahyg_F：gtacagtgaccggtgactctttcthyg_R：ctatgaccatgattacgccaagcttctcgagtggagatgtggagtg。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明構(gòu)建的重組表達(dá)菌株除了能高效表達(dá)葡萄糖氧化酶外，其表達(dá)產(chǎn)物還包含糖化酶，淀粉酶，蛋白酶等其它副表達(dá)產(chǎn)物。以單菌種表達(dá)多酶系的菌株具有更加良好的應(yīng)用效果和市場(chǎng)前景。該菌株表達(dá)的包含多酶組分的葡萄糖氧化酶在動(dòng)物飼料領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用效果。附圖說明圖1pGODHyg質(zhì)粒圖譜圖2GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株在活性檢測(cè)平板上的顯色效果圖圖3GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液SDS-PAGE圖4GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液對(duì)肉雞糞便的影響具體實(shí)施方式1.葡萄糖氧化酶重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建該質(zhì)粒包含以下幾個(gè)部分：(1)pUC57質(zhì)粒經(jīng)EcoRI-HindIII雙酶切后得到的片段；酶切過程為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的技術(shù)。(2)葡萄糖氧化酶(GOD)表達(dá)盒，其中GOD序列來源于黑曲霉，由GenScript公司合成，序列如SEQIDNO.1所示；(3)選擇標(biāo)記Hyg表達(dá)盒，由GenScript公司合成，序列見SEQIDNO.2；首先分別用引物GOD_F與GOD_R、hyg_F與hyg_R分別以合成的GOD和篩選標(biāo)記Hyg的表達(dá)盒為模板通過PCR擴(kuò)出帶有重組臂的GOD基因和hyg基因，PCR體系及過程為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，然后利用PCR通過GOD_F與hyg_R引物兩端的重疊序列將GOD基因和hyg基因拼成一條直鏈長(zhǎng)片段，再通過ClonEZ(購(gòu)自GenScript公司)方法與具有末端互補(bǔ)序列pUC57EcoRI-HindIII酶切線性回收片段進(jìn)行重組，得到pGODHyg質(zhì)粒，構(gòu)建好的質(zhì)粒圖譜見圖1。該質(zhì)粒在GOD表達(dá)盒上游和Hyg表達(dá)盒下游分別加上了HindIII位點(diǎn)，以便線性化。引物名稱引物序列GOD_FgaagtcagaattcatggtgttttgatcattttaaatttttatatggcgggGOD_Ragaaagagtcaccggtcactgtacatgcattgaatgacagtgatatcagcagahyg_Fgtacagtgaccggtgactctttcthyg_Rctatgaccatgattacgccaagcttctcgagtggagatgtggagtg2.GOD原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體的制備：在TZ液體培養(yǎng)基(牛肉膏粉0.8％(w/v，g/ml)；酵母浸膏0.2％(w/v)；蛋白胨0.5％(w/v)；NaCl0.2％(w/v)；蔗糖3％(w/v)；pH5.8)中培養(yǎng)黑曲霉菌絲體(黑曲霉CICC2462，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC)從培養(yǎng)液中過濾菌絲體并用0.7MNaCl(pH5.8)洗滌，菌絲體濾干后轉(zhuǎn)移至含纖維素酶1％(w/v，g/ml)(Sigma)、蝸牛酶1％(w/v)(Sigma)和溶壁酶(Sigma)0.2％(w/v)的酶解液中。30℃，65rpm酶解2.5-3h。然后將含有原生質(zhì)體的酶解液置于冰上并用四層擦鏡紙過濾。得到的濾液3000rpm，4℃離心10min后，棄上清；附著在管壁上的原生質(zhì)體用STC溶液(1MD-山梨醇、50mMCaCl2、10mMTris-HCl，pH7.5)洗滌一次，最后把原生質(zhì)體重懸于適量的STC溶液中。原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：將10μgpGODHyg質(zhì)粒HindIII線性化DNA(4989bp)加入到100μl原生質(zhì)體懸浮液中，混勻后室溫放置25min；然后分三次共加入900μlPEG溶液(60％(w/v)PEG4000、10mMCaCl2、10mMTris-HCl，pH7.5)，混勻后室溫放置25min；3000rpm，常溫離心10min，收集原生質(zhì)體，最后把原生質(zhì)體重懸于1mlSTC溶液中。把該懸浮液與預(yù)先降溫至45℃左右的TB3培養(yǎng)基(酵母浸膏0.3％(w/v)、酸水解酪蛋白0.3％(w/v)、蔗糖20％(w/v)、瓊脂0.7％(w/v))混合并鋪平板；待平板凝固后放入34℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24h后在平板上再鋪一層含300ng/μl潮霉素(Hygromycin)的TB3固體培養(yǎng)基(瓊脂1％(w/v)，其余成分同上)，繼續(xù)將平板置于34℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5天后，長(zhǎng)出上層培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化子即為陽性轉(zhuǎn)化子。3.GOD黑曲霉重組表達(dá)菌株的平板篩選平板定性篩選：采用Fiedure.K.J顯色法，挑取少量黑曲霉陽性轉(zhuǎn)化子菌絲到活性鑒定平板，28℃培養(yǎng)1～2d后出現(xiàn)藍(lán)色顏色圈，挑取變色圈較大的的菌株接種至平板培養(yǎng)。所述平板活性鑒定培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖40g·L-1，蛋白胨2g·L-1，氯化鉀0.5g·L-1，碳酸鈣3.5g·L-1，可溶性淀粉10g·L-1，KI1.7g·L-1，脫氧膽酸鈉0.2g·L-1，瓊脂20g·L-1，磷酸緩沖液0.1mol·L-1pH5.5。4.GOD黑曲霉重組表達(dá)菌株的搖瓶培養(yǎng)將平板篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子使用50mlYPM培養(yǎng)基(2g/L酵母提取物，2g/L蛋白胨，20g/L的麥芽糖)的搖瓶在34℃下，220rpm的搖床中培養(yǎng)六天，離心收集上清液，測(cè)定上清液的葡萄糖氧化酶活性。5.葡萄糖氧化酶的酶活測(cè)定在有氧條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產(chǎn)生H2O2，在辣根過氧化物酶(POD)的作用下，氧供體鄰-聯(lián)(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產(chǎn)物。根據(jù)其在540nm處吸光度的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線，可換算GOD的活性。酶活測(cè)定體系中包含2.5mL鄰聯(lián)茴香胺溶液，0.3mL的18％葡萄糖，0.lmL的90Um·L-1辣根過氧化物酶，35℃保溫2min后，向試管中加入稀釋好的酶液樣品0.1mL，反應(yīng)3min后，加入2mol·L-1硫酸終止反應(yīng)，取出試管，測(cè)OD540,的吸光值，以熱失活的酶液做空白對(duì)照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，計(jì)算葡萄糖氧化酶活力單位。試劑和溶液0.1mol/LpH5.5磷酸氫二鈉-檸檬酸鈉緩沖液：準(zhǔn)確稱取14.32g磷酸氫二鈉，8.4056g一水合檸檬酸，溶解于400ml蒸餾水中，用磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)pH至5.5，備用。鄰聯(lián)茴香胺溶液：準(zhǔn)確稱取0.1g鄰聯(lián)茴香胺，溶于10ml甲醇中，此為儲(chǔ)存液，4℃有效保存3天。實(shí)驗(yàn)前取0.1ml儲(chǔ)存液，溶于12ml0.1mol/L，pH5.5的上述磷酸緩沖液，即得。18％葡萄糖：準(zhǔn)確稱取9.0000g烘干至恒重的葡萄糖(AR)，溶解于少量蒸餾水中，并用蒸餾水定容至50ml，4℃保存。2mol/LH2SO4：準(zhǔn)確稱取40.00gH2SO4，緩慢加入160mL蒸餾水中，定容至200mL，備用。GOD標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)買酶活為10000單位的sigma葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確加入5mL蒸餾水，混勻，-20℃保存?zhèn)溆谩?0U/mL辣根過氧化物酶：購(gòu)買辣根過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品(酶活力＞250units/mg，100mg)，準(zhǔn)確加入1mL蒸餾水，充分溶解辣根過氧化物酶，-20℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)取適量標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至酶活為90U/ml后使用，需現(xiàn)稀釋現(xiàn)用。酶活力的測(cè)定(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將GOD標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4U/mL，在試管中加入2.5mL鄰聯(lián)茴香胺溶液和0.3mL的18％葡萄糖溶液，再加入0.1mL90U/mL辣根過氧化物酶溶液，35℃預(yù)熱2min后，以15s的時(shí)間間隔加入0.1mL稀釋好的GOD標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確反應(yīng)3min后立即加入2ml2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，取出混勻，在540nm處測(cè)定吸光值，以吸光值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)酶活力為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝Kx+b。(2)樣品的測(cè)定在試管中加入2.5mL鄰聯(lián)茵香胺溶液和0.3mL的18％葡萄糖溶液，加入0.1mL90U/mL辣根過氧化物酶溶液，35℃預(yù)熱2min后，以15s的時(shí)間間隔加入0.1mL稀釋好的待檢樣品(稀釋標(biāo)準(zhǔn)為該樣品的檢測(cè)吸光值在線性范圍內(nèi))，準(zhǔn)確反應(yīng)3min后立即加入2ml2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，取出混勻，在540nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)，計(jì)算酶活。(3)酶活力的計(jì)算X＝(K*A+b)*n式中：X---樣品的酶活力U/mlA---樣品檢測(cè)吸光值n---酶液的稀釋倍數(shù)K----標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率b----標(biāo)準(zhǔn)曲線截距6.GOD黑曲霉重組表達(dá)菌株的酶活測(cè)定及蛋白電泳分析經(jīng)過平板及搖瓶活性篩選，得到了一株GOD表達(dá)量最高的黑曲霉重組表達(dá)菌株。該菌株分類命名為黑曲霉(Aspergillusniger)，于2016年6月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCCNO.12518。將該菌株使用50mlYPM培養(yǎng)基(2g/L酵母提取物，2g/L蛋白胨，20g/L麥芽糖)的搖瓶在34℃下，220rpm的搖床中培養(yǎng)六天。測(cè)定發(fā)酵酶液中GOD的酶活為1058U/ml，糖化酶活性為1009U/ml，較對(duì)照菌株有明顯的下降，結(jié)果如表一。將發(fā)酵液進(jìn)行濃縮到GOD酶活為10000U/ml后，參考各酶種活性國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法，測(cè)定該菌株表達(dá)的濃縮酶液中不同酶組分的酶活表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果如表二。通過對(duì)發(fā)酵酶液蛋白電泳(SDS-PAGE)可以看到分子量大小約為大于120kDa的糖化酶蛋白條帶，80kDa左右的葡萄糖氧化酶條帶，60kDa的酸性淀粉酶條帶和50kDa的中性淀粉酶條帶。表一：重組黑曲霉表達(dá)菌株與對(duì)照菌株(黑曲霉CICC2462)主要酶活組分活性比較名稱葡萄糖氧化酶(U/ml)糖化酶(U/ml)對(duì)照菌株未檢出7516GOD重組表達(dá)菌株10581009表二重組黑曲霉表達(dá)菌株各酶活組分活性比較名稱檢測(cè)依據(jù)酶活(U/ml)中性蛋白酶GB/T23527-2009430葡萄糖氧化酶35℃，3min10000糖化酶GB8276-200610700真菌α-淀粉酶QB2526-2001363果膠酶QB1502-9240纖維素酶Q/0126NNE004-20123木聚糖酶GB/T23874-200914半乳糖苷酶Q/0126NNE005-201265過氧化氫酶37℃，pH7.001610中溫淀粉酶GB/T24401-200949甘露聚糖酶Q/0126NNE002-2012未檢出7.GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選取1日齡羅斯308肉雞，共4個(gè)雞舍，每個(gè)雞舍11000只雞，隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組2個(gè)雞舍。對(duì)照組飼喂商品日糧+常樂(大蒜素與牛至油混合物由黑龍江省匯豐動(dòng)物保健品有限公司提供)100mL/t，試驗(yàn)組飼喂商品日糧+GOD重組表達(dá)菌株發(fā)酵酶液100U/L，試驗(yàn)期自由采食、飲水，試驗(yàn)期42天，試驗(yàn)日糧由玉米、豆粕、小麥、棉粕、DDGS、花生粕、鴨油、預(yù)混料等組成，營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)見表三。每天記錄飼料消耗量，于21天及出欄時(shí)稱重，并測(cè)定期間各欄飼料消耗量，統(tǒng)計(jì)各期的平均日飼料采食量、平均日增重，計(jì)算料肉比。試驗(yàn)期間觀察糞便、腹瀉及雞群整體狀況。表三.日糧營(yíng)養(yǎng)水平愛益農(nóng)510：動(dòng)物飼料，河北愛益農(nóng)飼料有限公司產(chǎn)品和美511：動(dòng)物飼料，山東和美集團(tuán)有限公司產(chǎn)品(1)GOD重組表達(dá)菌株發(fā)酵酶液對(duì)肉雞的生產(chǎn)性能影響如表四所示：表四.GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液對(duì)肉雞的生產(chǎn)性能影響由結(jié)果可見，添加GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液對(duì)雞群整體狀況有改善作用，就料肉比方面，1-21日齡，試驗(yàn)組較對(duì)照組降低2.98％，22日齡-出欄降低7.50％，全程料比降低6.05％。就日增重方面，GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液添加提高了試驗(yàn)組雞只日增重，后期表現(xiàn)明顯(22日齡-出欄)，使得42日齡雞只重量?jī)?yōu)于對(duì)照組。對(duì)照組、試驗(yàn)組間平均耗料量差異不明顯。(2)GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液對(duì)肉雞糞便的影響選取1日齡羅斯308肉雞，飼料中添加GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液飼養(yǎng)5日后，可觀察到5日齡試驗(yàn)組和對(duì)照組間腹瀉情況的差別，對(duì)照組雞只糊肛?cái)?shù)量較多，試驗(yàn)組則情況較輕，見圖4。由試驗(yàn)結(jié)果可知，GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液的添加降低了料肉比，改善了肉雞的生產(chǎn)性能。本實(shí)驗(yàn)中使用GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液的試驗(yàn)組比使用常樂的對(duì)照組表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)，究其原因，可能是GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液作用于飼料中葡萄糖，產(chǎn)生葡萄糖酸，降低腸道pH值，為消化酶更好地發(fā)揮其作用提供有利的pH值環(huán)境，提高酶原激活率，提高消化酶的活性，從而提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率。同時(shí)反應(yīng)過程中消耗氧氣，提供了厭氧環(huán)境，改善了腸道內(nèi)微生態(tài)，促進(jìn)乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌的生長(zhǎng)繁殖，抑制了大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的生長(zhǎng)。GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液的添加對(duì)肉雞腸道的發(fā)育有促進(jìn)作用，能顯著優(yōu)化肉雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，為消化道的成熟和消化吸收提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)?？梢?，GOD重組黑曲霉表達(dá)菌株發(fā)酵酶液的添加為肉雞提供了一個(gè)更好的胃腸道消化環(huán)境，使肉雞整體機(jī)體水平得到改善，從而表現(xiàn)為提高了肉雞的生產(chǎn)性能。當(dāng)前第1頁1 2 3