本發(fā)明涉及一種瑞士乳桿菌的PCR快速檢測特異引物及方法，屬于生物技術(shù)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)是一種常見的乳酸菌，主要用于干酪、酸乳、飼料添加劑等制品的生產(chǎn)。瑞士乳桿菌同時也是一種重要的益生菌，是近年來國內(nèi)外迅速崛起的一類微生態(tài)制劑菌株，它廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品、畜牧和水產(chǎn)等行業(yè)。因其具有調(diào)節(jié)腸道功能紊亂、維持腸道內(nèi)菌群平衡和提高機體健康水平、能夠避免服用抗生素帶來的耐藥性和二重感染等問題的優(yōu)點，一直受世人矚目。近年來，關(guān)于瑞士乳桿菌在發(fā)酵乳制品方面的研究也越來越廣泛。另外，瑞士乳桿菌的細胞壁蛋白酶可以水解乳蛋白產(chǎn)生血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制肽，能有效地降低人體血壓。當前，瑞士乳桿菌的檢測方法主要是傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)——純分離培養(yǎng)——生化鑒定，該方法的缺點是操作繁瑣、檢測時間長，而且生化鑒定的項目較多。隨著人們生活水平的提高，對食品安全的需求越來越高，同時，瑞士乳桿菌微生態(tài)制劑的研制，生產(chǎn)規(guī)模的擴大，傳統(tǒng)檢測方法的低效率已經(jīng)不能滿足當前批量化的檢測任務(wù)。因而，研究的瑞士乳桿菌快速檢測方法很有必要。PCR方法具有檢測速度快、靈敏度高、成本低的優(yōu)點，是當前細菌鑒定中一種快速有效的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種瑞士乳桿菌的PCR快速檢測特異引物及方法，該方法具有檢測速度快、特異性強、成本低的優(yōu)點。本發(fā)明技術(shù)方案如下：一種瑞士乳桿菌的PCR快速檢測特異引物，所述引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述引物如下：L.helv-F：5’-TTCGAAAGAATCGAAGATGATT-3’SEQIDNO.1；L.helv-R：5’-TAATGGTATGGTCAAGGACGAC-3’SEQIDNO.2。利用上述PCR快速檢測特異引物PCR快速檢測瑞士乳桿菌的方法，步驟如下：(1)提取待測樣品中的DNA，制得基因組DNA；(2)以步驟(1)制得的基因組DNA為模板，利用上述PCR快速檢測特異引物進行PCR擴增，制得PCR擴增產(chǎn)物；(3)將步驟(2)制得的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，當結(jié)果中存在一條分子量為538bp的核酸條帶，則檢測樣品含有瑞士乳桿菌；當結(jié)果中不存在分子量為538bp的核酸條帶，則檢測樣品中不含有瑞士乳桿菌。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，PCR擴增體系如下，體系總體積為25μl：基因組DNA2μl；10×PCRBuffer2.5μl；Mg2+濃度1.5mmol/L；Taq酶1U；dNTP濃度0.1mmol/L；上游引物10pmol；下游引物10pmol；ddH2O補加至25μl；根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，PCR擴增程序如下：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，53℃退火30s，72℃延伸40sec，35個循環(huán)；72℃終延伸5min。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，采用質(zhì)量百分比為1.5％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，PCR上樣緩沖液濃度為10×。上述步驟(1)中提取待測樣品中的DNA和步驟(3)中瓊脂糖凝膠電泳均可按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作。上述實驗步驟如無特別說明均可參見《分子克隆實驗指南》第三版(北京：科學(xué)出版社，2002)。有益效果1、本發(fā)明采用瑞士乳桿菌基因組非編碼序列首次獲得瑞士乳桿菌的PCR快速檢測特異引物，由于非編碼序列在基因組進化中的選擇壓力更小，近緣物種間的保守性差，因而，擴增產(chǎn)物的特異性更好，準確率更高；2、本發(fā)明所述PCR快速檢測特異引物PCR快速檢測瑞士乳桿菌的方法，檢測速度快，直接利用菌液的基因組DNA進行檢測，省去了革蘭氏染色、分離純化和生化鑒定步驟，而分離純化和生化鑒定一般需要48～72h；3、本發(fā)明所述PCR快速檢測特異引物PCR快速檢測瑞士乳桿菌的方法成本低，由于省略了革蘭氏染色、分離純化和生化鑒定步驟，節(jié)省了革蘭氏染色、分離純化培養(yǎng)基和生化試劑的費用，降低了檢測成本。附圖說明圖1本發(fā)明所述瑞士乳桿菌的PCR快速檢測特異引物分別對發(fā)酵乳酸菌及其他18中干擾菌分別進行PCR檢測的電泳照片；圖中：M為分子量標準1：瑞士乳桿菌；2：發(fā)酵乳酸菌；3：加氏乳桿菌；4：德氏乳桿菌；5：嗜酸乳桿菌；6：雞乳桿菌；7：嗜熱脂肪芽孢桿菌；8：糞腸球菌；9：凝結(jié)芽孢桿菌；10：英諾克李斯特菌；11：河生腸桿菌；12：溶血性鏈球菌；13：綠膿桿菌；14：奇異變形桿菌；15：宋內(nèi)氏志賀氏菌；16：氣味沙雷氏菌；17：單核增生李斯特菌；18：產(chǎn)氣莢膜梭菌；19：大腸埃希氏菌；20：普通變形菌。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。實施例1首先無菌操作取1g待測酸奶樣品，加入盛有9mlMRS肉湯的滅菌容器內(nèi)，36℃±1℃，厭氧條件下培養(yǎng)48h。取培養(yǎng)的菌液加入離心管中，以12000rpm離心lmin，棄上清液，利用菌體沉淀提取基因組DNA并稀釋備用。然后進行PCR反應(yīng)，每個PCR反應(yīng)總體積為25μl，包括提取的基因組DNA，2μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Taq酶1u；dNTP0.1mmol/L；瑞士乳桿菌特異性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為：95℃變性5min；95℃30sec，53℃30s，72℃40sec，該反應(yīng)進行35個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。其中瑞士乳桿菌特異性引物為：L.helv-F：5’-TTCGAAAGAATCGAAGATGATT-3’；L.helv-R：5’-TAATGGTATGGTCAAGGACGAC-3’最后進行電泳檢測，取9μlPCR產(chǎn)物與10×PCR上樣緩沖液混合，在加入萬分之一的Gelred染色的1.5％瓊脂糖凝膠電泳中以DNA分子量標記(DL2000)對照進行檢測，如果在紫外燈下存在538bp的核酸片段，則說明有瑞士乳桿菌。實施例2首先無菌操作取1g待測番茄醬樣品(含有瑞士乳桿菌)，加入盛有9mlMRS肉湯培養(yǎng)基的滅菌容器內(nèi)，36℃±1℃，厭氧條件下培養(yǎng)48h。取培養(yǎng)的菌液加入離心管中，以12000rpm離心lmin，棄上清液，利用菌體沉淀提取基因組DNA并稀釋備用。然后進行PCR反應(yīng)，每個PCR反應(yīng)總體積為25μl，包括提取的基因組DNA，2μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg2+濃度1.5mmol/L；Taq酶1U；dNTP0.1mmol/L；瑞士乳桿菌特異性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，53℃退火30s，72℃延伸40sec，35個循環(huán)；72℃終延伸5min，4℃保存。其中瑞士乳桿菌特異性引物為：L.helv-F：5’-TTCGAAAGAATCGAAGATGATT-3’；L.helv-R：5’-TAATGGTATGGTCAAGGACGAC-3’最后進行電泳檢測，取9μlPCR產(chǎn)物與10×PCR上樣緩沖液混合，在加入萬分之一的Gelred染色的1.5％瓊脂糖凝膠電泳中以DNA分子量標記(DL2000)對照進行檢測，如果在紫外燈下存在538bp的核酸片段，則說明有瑞士乳桿菌。同時采用發(fā)酵乳酸菌(購自CGMCC，菌種編號1.1880)、加氏乳桿菌(購自CGMCC，菌種編號1.2743)、德氏乳桿菌(購自CGMCC，菌種編號1.2624)、嗜酸乳桿菌(購自CGMCC，菌種編號1.1854)、動物乳桿菌(購自CGMCC，菌種編號1.2623)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(購自CGMCC，菌種編號1.1923)、糞腸球菌(購自ATCC，菌種編號29212)、凝結(jié)芽孢桿菌(購自CGMCC，菌種編號1.2009)、英諾克李斯特菌(購自ATCC，菌種編號33090)、河生腸桿菌(購自ATCC，菌種編號51816)、溶血性鏈球菌(購自ATCC，菌種編號32210)、綠膿桿菌(購自ATCC，菌種編號27853)、奇異變形桿菌(購自ATCC，菌種編號12453)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(購自ATCC，菌種編號9290)、氣味沙雷氏菌(購自ATCC，菌種編號33077)、單核增生李斯特菌(購自ATCC，菌種編號BAA-751)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(購自ATCC，菌種編號64609)、大腸埃希氏菌(購自ATCC，菌種編號25922)和普通變形桿菌(購自ATCC，菌種編號49132)按上述同樣方法進行檢測，結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，只有瑞士乳桿菌有擴增產(chǎn)物，擴增長度為538bp，干擾菌沒有擴增產(chǎn)物，說明引物具有很好的特異性。對比例為了驗證本發(fā)明PCR擴增引物(乳桿菌基因組非編碼區(qū)設(shè)計的序列)的準確性，同時在乳桿菌基因組編碼區(qū)序列設(shè)計了PCR擴增引物5對，分別命名為引物A，引物B，引物C，引物D，引物E。選用番茄醬樣品，分別添加瑞士乳桿菌、發(fā)酵乳酸菌、加氏乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雞乳桿菌進行檢測。結(jié)果顯示，雖然這5對在編碼區(qū)設(shè)計的引物在瑞士乳桿菌中都能擴增，但在其他5種近緣物種間都有不同程度的擴增，說明在檢測相同樣品時，準確性都低于本發(fā)明所述的瑞士乳桿菌的PCR快速檢測特異引物。表1瑞士乳桿菌發(fā)酵乳酸菌加氏乳桿菌德氏乳桿菌嗜酸乳桿菌雞乳桿菌本發(fā)明引物+-----引物A+-+---引物B+--+--引物C+--+--引物D+-+-+-引物E++----SEQUENCELISTING<110>保齡寶生物股份有限公司<120>一種瑞士乳桿菌的PCR快速檢測特異引物及方法<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ttcgaaagaatcgaagatgatt22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2taatggtatggtcaaggacgac22當前第1頁1 2 3